Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a CSIC por el apoyo financiero dado este proyecto, Mariana Di Doménico para su asistencia técnica con microscopia confocal; a José Leonardo Báez para sus correcciones del manuscrito; a Luciano Correa por su dedicación a la creación del vídeo; a Natalia Rosano por prestar su voz para el vídeo y el Bloomington Drosophila Stock Center para proporcionar los recursos utilizados en este estudio. El Apa1 monoclonal anti-Ptc desarrollado por Isabel Guerrero fue obtenido de banco de hibridoma estudios del desarrollo (DSHB) bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por departamento de ciencias biológicas, la Universidad de Iowa, Iowa City, IA 52242.

Día 1
1. colección y cultivo pupas.
<ol>
	<li>Saque 0 h después de la formación del pupario (APF) o prepupas con un pincel mojado de cultivados frascos y colocarlos en frascos nuevos para casi completar el período de desarrollo (ver 2.1 y 2.2). 
	Nota: Debe mantenerse una sana población de moscas utilizando protocolos estándar de cultivo. Después de tres o cuatro días en los que se colocan los huevos, los adultos pueden extraerse viales para permitir un desarrollo óptimo de los individuos. Ellos se mantienen a una temperatura constante hasta que las larvas de tercer estadio inician la pupación. La transición de larvas/pupas se caracteriza por la formación de la prepupa considerada el 0 h APF. La prepupa es una larva blanca inmóvil que tiene un oblongo, con salientes espiráculos anteriores la forma redonda.</li>
</ol>
Día 2
2. transferencia, disección y fijación.
<ol>
	<li>Transferencia a las pupas (2 h antes de que el tiempo de desarrollo es completa) con un pincel, el portaobjetos con cinta de doble cara se adhirieron a él. Colocar las pupas para formar que una fila con los lados dorsales cefálicas y hasta termina en la misma dirección.</li>
	<li>Volver el portaobjetos a temperatura constante y permitir que las pupas completar el tiempo de desarrollo apropiado (es decir, 24-30 h APF). 
	Nota: El portaobjetos con la cinta de doble cara será una plataforma de disección transitorio para eliminar la envoltura pupal (véase abajo). El lapso de tiempo de la diapositiva del microscopio (fuera del frasco) ayuda a secar la envoltura pupal lo que es fácilmente rompible con fórceps.</li>
	<li>Quitar el opérculo de la envoltura pupal con unas pinzas.</li>
	<li>El caso de la rotura con pinzas (como se muestra en el video) haciendo una línea a lo largo de la parte de la pupa al extremo caudal de la misma. Con la iluminación adecuada es posible detectar la forma interior de la pupa evidenciar un espacio justo encima de la bisagra del ala pupa. Este espacio sirve como guía para realizar la apertura sin dañar la pupa.</li>
	<li>Saque porciones del caso, recogiendo por la frontera abierta y llevarlos hacia el lado opuesto donde les mantendrá la cinta de doble cara. Al final de la disección las pupas será casi "desnudas", que solamente un pedazo pequeño de la caja va cubriendo la extremidad posterior. Nota: El propósito de dejar una pequeña cantidad de casos en el extremo superior de la caudal es para una versión suave de la caja portaobjetos con cinta de doble cara. Razonamiento detrás de esta acción es porque si eliminas mucho del caso usted mucho riesgo de dañar la pupa. Por otro lado si quita muy poco, la pupa no fácilmente vendrá libre del caso.</li>
	<li>Empuje hacia abajo (con pinzas) el resto de la caja. Este movimiento provocará el extremo anterior de la pupa, permitiendo que la cabeza y el tórax en una posición preferencial a adherirse y a transferirse en el paso posterior.</li>
	<li>Tomar una nueva diapositiva con cinta de doble cara e invertir en la pupa o fila de pupas. Se recomienda realizar este planteamiento mediante la observación de los movimientos con la ayuda del estereomicroscopio para evitar la rotura de las pupas.</li>
	<li>Presione ligeramente para que las pupas se adhieren a la cinta y deslice suavemente el portaobjetos para eliminar las pupas del resto de los casos. Invertir el portaobjetos: las pupas se pegan en el lado dorsal a la altura de la cabeza / área de tórax.</li>
	<li>Cubra todas las pupas desnudas con paraformaldehído al 4% y esperar 10 minutos. En nuestra experiencia, este lapso de tiempo con el fijador ayuda a cambiar la consistencia de la cutícula lo que firme, menos pegajoso y fácil de manejar. 
	Nota: Para realizar la extracción de ácido ribonucleico (ARN), paraformaldehido sustituto para solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Rnasa agua libre y quitar las alas pupas haciendo un corte (con la ayuda de tijeras) cerca del punto de bisagra de cada apéndice. Usando pinzas transfiera el ala pupa a un tubo de microcentrífuga con 1 mL de reactivo de fenol y tiocianato de guanidinio. Después de recoger un total de 50-80 alas, almacene el tubo de microcentrífuga a-80 ° C hasta realizar la extracción de RNA10,11.</li>
	<li>Hacer una pequeña incisión en la región de la bisagra del ala o cerca de él. Permitir que el fijador alcanzar el epitelio del ala. Con una pipeta (p200) ras fijador sobre el ala. Cuando cambie de lavado la contaminada para fijar nuevas. Después del lavado, mantener ala fijador durante 5 minutos. 
	Nota: Aunque esta maniobra ayuda a eliminar la mayoría de los tejidos contaminantes, algunos hemocitos y gotitas de grasa pueden permanecer atrapadas entre las capas epiteliales dorsales y ventrales del ala (véase figura 1A).</li>
	<li>Tear con el fórceps de las fronteras de la cutícula (como se muestra en el video) ampliando el orificio y permitiendo la liberación del epitelio del ala del saco de la cutícula. Una vez que se libera el tejido del ala, dejar en la solución de paraformaldehído al completar 30 minutos de fijación.</li>
	<li>Transferencia de las alas fijas a un plato plástico 4 estaba llena con SAFT (Triton X-100 0.05%). Tienda durante la noche a 4 ° C.</li>
</ol>
Día 3
3. incubación del anticuerpo primario.
<ol>
	<li>Permeabilizar el tejido incubando las alas pupas en SAFT (Triton X-100 0,2%) durante 15 minutos usando una plataforma oscilante para facilitar un suave movimiento de medio líquido. 
	Nota: Hasta el montaje de las muestras, los pasos deben realizarse utilizando una plataforma oscilante.</li>
	<li>Bloquear las muestras usando PBSTA (BSA 3% Tritón X-100 0.1%) durante 1 hora.</li>
	<li>Utilice el mismo buffer para diluir el anticuerpo primario (ratón anti-Ptc, 1: 100) e incubar las alas pupas durante la noche a 4 ° C.</li>
</ol>
Día 4
4 incubación del anticuerpo secundario.
<ol>
	<li>Lavado de muestras 4 x 10 min cada uno con SAFT (Triton X-100 0.05%)</li>
	<li>Incubar con el anticuerpo secundario (p. ej., anti-ratón conjugado con fluorocromo) diluido a la concentración adecuada en PBSTA (BSA 3% Tritón X-100 0,1%) a temperatura ambiente en la oscuridad, por 2 h. 
	Nota: Si es apropiado, utilice 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o phalloidin para contratinción el tejido. Añadir estas puntas de prueba con el anticuerpo secundario teniendo en cuenta la longitud de onda de emisión de los fluorocromos para evitar la superposición de señales.</li>
	<li>Lavado de muestras 4 x 10 min cada uno con SAFT (Triton X-100 0.05%)</li>
</ol>
5. montaje
<ol>
	<li>Preparar una diapositiva muestra colocando 4 puntitos de esmalte de uñas transparente en el portaobjetos como si fueran los vértices de un cuadrado.</li></ol>Serán los puntos donde descansará el cubreobjetos, ayudando a evitar aplastar los tejidos.
	<li>Lugar 30 μl de montaje media (80% de glicerol/Tris-HCl) en el centro de la Plaza de los puntos hechos con esmalte de uñas sin tocar cualquiera de las esquinas (puntos). Tome una pipeta con una punta amarilla recortada, carga algunos medios de montaje y luego dibujar en varias alas pupas.</li>
	<li>Traslado alas pupas a punto de montar los medios en el portaobjetos. Con la ayuda de una punta, difundir los medios de montaje y hunden las alas pupas para evitar que flote. La morfología del tejido se mantendrá si las alas permanecen estables cuando se coloca el cristal en. Antes de colocar el vidrio de la cubierta, retire las burbujas de aire.</li>
	<li>Baje el cubreobjetos sobre las muestras tratando de evitar la generación de burbujas de aire. Este movimiento puede realizarse con la ayuda de fórceps.</li>

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método de disección se describe en este vídeo puede utilizarse para preparar muestras de alta calidad de alas pupas de Drosophila de diversas etapas del desarrollo de muchos tipos de técnicas (por ejemplo, la inmunofluorescencia, la síntesis de cDNA para análisis PCR, in vitro desarrollo del ala). En este método el científico involucrados han utilizado 24-30 h APF. Sin embargo debe haber ningún obstáculo dentro de los pasos esenciales en la disección de pupa más joven o más viejo. Cambios pueden tener que acomodar más pupa de etapa.
El protocolo podría realizarse para disecar una pupa o pupas varios al mismo tiempo. Esto ayuda a acelerar el procedimiento, haciéndolo más fácil llegar a un gran número de alas disecado. En este caso existe la opción de eliminar una fila de 4-5 pupas al mismo tiempo. Se puede eliminar las pupas juntos o si no es posible, continuar eliminar individualmente en la misma diapositiva (véase la sección III del video: "Disección de pupas múltiples"). Para quitar la pupa desnuda de caso abierto, es importante que la extremidad posterior es suficientemente pequeña. Es posible quitar el caso Aunque sería la transferencia más rápido, la eliminación de todo el caso es difícil y existe un mayor riesgo de dañar la pupa.
Experiencia dicta que una maniobra importante para considerar es dejar (el último 2 h para completar el tiempo de desarrollo estipulado) la pupa conectado al portaobjetos dentro de la incubadora, pero fuera del frasco. Este lapso de tiempo ayuda a secar el caso lo que es más fácil de romper. Otro paso crítico durante la disección para inmunohistoquímica, es despegarse de la cutícula que cubre el epitelio del ala, tal modo conceder el acceso del anticuerpo a la superficie toda ala. Este paso debe hacerse después de fijar durante varios minutos (menos de 5 min después de hacer la incisión en el punto bisagra) ya que el fijador estabiliza los tejidos y cambia la consistencia de la cutícula, haciéndolo más fácil de pelar.
Al realizar todos los pasos de immunohistochemistry, asegúrese de que las alas estén en constante movimiento (plataforma oscilante). El movimiento ayuda a mejorar el intercambio y la penetración de las soluciones durante el lavado y las incubaciones. Sin embargo, es importante hacerlo suavemente, evitando la aparición de distorsiones no deseadas en la morfología de esta frágil estructura (es decir, es suficiente que las oscilaciones de la plataforma desplazará ligeramente el medio líquido que contiene las muestras).
Este procedimiento proporciona un acercamiento alternativo y complementario a los métodos ya publicados para la disección ala pupa.

Las alas de Drosophila se desarrollan desde los discos imaginal de ala. Primordial de estos discos de ala se ponen a un lado durante el desarrollo embrionario como pequeños grupos de 20-30 células imaginales que invaginate del epitelio embrionario. Mientras que la larva crece en la tercera etapa del estadio, mitosis se produce en las células imaginales en momentos característicos específicos elevando su número (aproximadamente 50000 células) y formando el ala disco1,2,3, 4. Como las células proliferan, forme un epitelio tubular, resultando en un espiral compacto auto plegable. Durante la pupación, el epitelio del disco telescopios a ala forma dos capas y las venas longitudinales comienzan como lagunas entre ellas, que ocurre dos veces durante ala del desarrollo5,6.
El arreglo de venas siempre tiene un patrón idéntico; la habilidad de identificar fácilmente cada alteración en la formación de las venas hace mutaciones muy visibles (por ejemplo, falta o extra venas, cambios en las posiciones de vena, etcetera.). Curiosamente, las variaciones de fenotipo son generalmente la evidencia de mutaciones en los componentes conocidos o nuevos de vías que son relevantes para el desarrollo del ala de señalización. Uno de los caminos que juega un papel en determinar la posición y mantener la vena y territorios intervein es la vía de Hedgehog (Hh)6,7,8.
Dada la importancia del ala pupa como un modelo de sistema, será importante obtener muestras de buena calidad para trabajar con. En el pasado, los científicos que han publicado protocolos para diseccionar las alas de Drosophila no han dado una guía apropiada para lograr muestras viables. Sin la dirección de un investigador uno no puede visualizar claramente el proceso. En estos enfoques alternativos de disección la pupa es dividida en dos, separando el ala del tejido circundante y lavada varias veces para eliminar los desechos. Este tipo de enfoque pretende dejar la puerta libre de contaminantes, pero debido a la experiencia previa en el proceso es más lento y existe una mayor probabilidad de comprometer la estructura de las frágiles alas9.
El procedimiento descrito aquí fue desarrollado por la demanda para encontrar un método rápido y eficiente para obtener muestras de ala pupa adecuadas detectar proteínas específicas o las transcripciones mediante inmunodetección de protocolos o ensayos de reacción en cadena (PCR) polimerasa. Para ilustrar esto, la expresión y localización de Patched (Ptc o receptor de la canónico de la vía de Hh) se detecta en muestras ala pupa, proporcionando un protocolo que incluye detalles relevantes con éxito para llevar a cabo la completa procedimiento.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with cool light illumination</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>StarFrost</td><td>8037/1</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Lawton</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well plastic dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>p100 or p200 pipette</td><td>Finnpipette (Labsystems)</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DEPC treated water</td><td>MO.BIO</td><td>17011-200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/800)</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &amp;mu;g/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/100)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td></td><td>By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI, 1 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/5000)</td><td>Invitrogen</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol&lt;br/&gt; (1/600 working dilution)</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Canton S (fly stock)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Desarrollo del ala de Drosophila melanogaster es un modelo ideal para el estudio de morfogénesis a nivel de tejido. Estos Apéndices se convierten de un grupo de células llamado discos imaginal de ala formados durante el desarrollo embrionario. En las etapas larvales los discos imaginales crecen, aumentando su número de células y la formación de estructuras epiteliales monolayered. Dentro de la envoltura pupal, los discos imaginales bud hacia fuera y doblan en bicapas a lo largo de una línea que se convierte en el futuro margen de la ala. Durante este proceso, las venas longitudinales primodia originan células de vena sobre las posibles superficies dorsales y ventrales del ala. Durante la etapa de pupa las rayas de las células de la vena de cada superficie de comunican para generar tubos apretados; al mismo tiempo, las venas Cruz comienzan su formación.
Con la ayuda de marcadores moleculares adecuados, es posible identificar los elementos principales que componen el ala durante su desarrollo. Por esta razón, la capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en esta estructura es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo del ala.
El procedimiento descrito aquí se centra en manipular alas pupas, proporcionando instrucciones detalladas sobre cómo diseccionar el ala durante la etapa pupal. La disección de tejidos pupal es más difícil de realizar que sus contrapartes en larvas de tercer estadio. Por esta razón este enfoque fue desarrollado, para obtener muestras de alta calidad rápida y eficiente. Detalles de cómo immunostain y Monte estas muestras de ala, para permitir la visualización de proteínas o componentes de la célula, se encuentran en el protocolo. Con experiencia es posible recoger alas pupal de 8-10 alta calidad en un corto período de tiempo.

El protocolo ofrece un método sencillo para la obtención de muestras ala pupa que conservan la morfología familiar del ala. De estas preparaciones es posible obtener montones de imágenes que podrían proyectarse como 2-D o 3-d, para investigar la distribución y el enriquecimiento de proteínas durante la diferenciación del ala. Un protocolo similar (véase la nota de 2,9) puede utilizarse para recolectar la muestra ala pupa grande (con 50-80 pupa alas) necesaria para sintetizar ácido desoxirribonucleico complementario (cDNA), la plantilla utilizada en reacciones de PCR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55854/55854fig1.jpg"> 
Figura 1 : Gen de vía de hedgehog en Drosophila alas pupas 
Parches, (A) , el receptor canónico de vía de Hedgehog, se visualizó a las 24-30 h APF usando ratón anti - Ptc. núcleos fueron contratinción con DAPI que filamentos de actina son visualizados usando un phalloidin verde fluorescente. Distribución de actina ayuda para localizar venas de las alas y su relación con la expresión parcheado . Al mismo tiempo, phalloidin tinción revela la presencia de hemocitos y gotitas de grasa (círculos grandes) como contaminar el tejido. 20 aumentos, anterior es a. Escala de la barra, 100 μm (B) amplicones de actina (carril 1, 280 bp) y ptc (carril 2, 236 bp) fueron obtenidos usando el cDNA sintetizado a partir de ARN mensajero (ARNm) ala muestra generada por un protocolo de disección similar. MW: peso molecular. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55854/55854fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

La capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en los tejidos de la Drosophila es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo. Aquí está la descripción de un sencillo procedimiento para disecar alas pupas. Estas alas pueden utilizarse como muestras en diversas técnicas (análisis de PCR, immunohistochemistry, etc.).

Un método rápido y eficiente para disecar alas Pupal de Drosophila apto para Immunodetections o ensayos PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

a-rapid-efficient-method-to-dissect-pupal-wings-drosophila-suitable

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

8.0K vistas.  Laboratorio de Biología del Desarrollo. La capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en los tejidos de la Drosophila es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo. Aquí está la descripción de un sencillo procedimiento para disecar alas pupas. Estas alas pueden utilizarse como muestras en diversas técnicas (análisis de PCR, immunohistochemistry, etc.).

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Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Disección de los músculos de vuelo de Drosophila melanogaster para los enfoques de Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Investigación

Genética

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Neurociencias

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Disección y la coloración de los ovarios Pupal de Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Biología del Desarrollo

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Preparación de desarrollar tejido olfatorio periférico para Molecular y el análisis de Immunohistochemical en Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Disección de la Retina Pupal de Drosophila para inmunohistoquímica, Western análisis y aislamiento de ARN

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

Imaging Dpp Liberación de un disco de ala Drosophila

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa inmunohistoquímica Abdomen

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Biología

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Seguimiento en Vivo a largo plazo de la dinámica de la célula inflamatoria dentro de pupas de Drosophila

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Inmunología e Infección

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Disección, fijación y visualización del Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissection: A Method to Observe Developing Epithelia

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/55901/" target="_blank">Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia</a>. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila imaginal discs, often a rough dissection is performed where the discs are exposed but remain attached to the body. Once stained, the discs of interest are isolated and mounted. The example protocol demonstrates a procedure for wing imaginal disc dissection and mounting.

Drosophila Disección del disco imaginal de las larvas: un método para observar el desarrollo de los epitelios

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila ...