El protocolo facilita la disección del músculo de vuelo indirecto con etiqueta GFP de Drosophila en varios momentos durante el desarrollo de las pupas para evaluar los cambios en la expresión genética y proteica. Usando estas técnicas, se puede lograr una muestra muscular de vuelo altamente enriquecida con una degradación mínima de la proteína de ARN que es adecuada para RT-PCR, mancha occidental o enfoques omicos. Estas disecciones especializadas requieren práctica y habilidad, pero el número de pupas que se pueden diseccionar y la calidad de las muestras mejora con experiencia.
La demostración visual de esta disección es fundamental para determinar cómo distinguir los músculos de vuelo de los tejidos no musculares y facilitar el aislamiento rápido de los músculos de vuelo de los especímenes pupales. Para escenificar las pupas, usa un pincel mojado para recolectar y transferir pre-pupas a un plato petri de 60 milímetros, y sexa las pupas bajo un microscopio binocular. Los machos se identifican por la presencia de testículos, que aparecen como globos translúcidos en las pupas de otro modo opacas.
Después de etiquetar el plato con la hora, la fecha y el genotipo de las moscas, envejecer las pupas en una incubadora de 25 a 27 grados Celsius hasta la etapa apropiada. Para la disección de IFM antes de 48 H APF, utilice un pincel mojado para transferir las pupas adecuadamente escenificadas a un plato de disección negro sobre 2/3 lleno de PBS frío. Bajo el microscopio de disección fluorescente, usa 5 fórceps para empujar una de las pupas al fondo de la placa negra diseccionante.
Ajuste el zoom y el enfoque del microscopio hasta que las pupas se puedan visualizar claramente. Usando un par de fórceps para agarrar la anterior de las pupas, pincha las pupas con una sola punta de un segundo par de fórceps, ligeramente descentramente en el abdomen, justo detrás del tórax. Usa el primer par de fórceps para eliminar la mitad anterior del caso pupal, y para pellizcar las pupas expuestas justo detrás del tórax para separar el abdomen del tórax.
A continuación, apriete suavemente la parte anterior del tórax para exponer las IFM con etiqueta fluorescente. Luego, usa los fórceps para desechar el cadáver restante en el lado opuesto de la antena, y disecciona las pupas subsiguientes de la misma manera. Cuando todas las pupas hayan sido diseccionadas, usa los fórceps para recoger las fibras de IFM, y organiza las fibras en una pila en la parte inferior del plato de disección negro.
Utilice los fórceps para expulsar cualquier residuo del campo de visión y eliminar los músculos, la grasa, las cutículas u otro tejido no deseado de las muestras. A continuación, utilice una punta de pipeta recortada para transferir la pila de IFM a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 250 microlitros de PBS refrigerado. Para la disección ifM después de 48 H APF, utilice un pincel ligeramente humedecido para transferir las pupas escenificadas a una tira de cinta adhesiva de doble cara montada en una diapositiva de microscopio.
Oriente las pupas en una línea, el lado ventral hacia abajo y anterior hacia la parte inferior de la diapositiva. Cuando se hayan colocado todas las pupas, utilice fórceps para separarse y abrir el primer caso pupal por encima de los espiráculos anteriores, y deslice suavemente un par de fórceps dorsalmente, hacia la parte posterior, cortando el caso pupal a medida que los fórceps se mueven. Libere a las pupas de la caja abierta e inmediatamente transfiera las pupas a una gota de PBS en una segunda diapositiva del microscopio.
Cuando todas las pupas estén liberadas, usa tijeras finas para cortar el abdomen de las pupas lejos del tórax, y empuja los abdomens en una pila separada. Cuando se hayan extraído todos los tórax, utilice un pedazo de papel tisú para extraer la mayoría del PBS y la pila de abdomens. Agregue una gota de PBS fresco y frío a los tórax restantes, antes de usar las tijeras para cortar desde la cabeza a lo largo del eje longitudinal del cuerpo en un solo movimiento para dividir el tórax por la mitad.
Cuando todas las pupas hayan sido diseccionadas, utilice los 5 fórceps para seleccionar una de las hemisecciones, e inserte suavemente las puntas de un fórceps por encima y por debajo de la mitad de las IFM. Sosteniendo el primer par de fórceps quietos, utilice tijeras finas para cortar un extremo del IFM lejos de la cutícula y los tendones, antes de girar las pupas 180 grados, para permitir que el otro extremo de la IFM se corte libre de la cutícula y los tendones. Utilice fórceps para transferir el haz IFM desde el tórax hasta el borde de la burbuja PBS, utilizando la tensión del agua para mantener el haz en su lugar.
A continuación, empuje la carcasa hacia el lado opuesto de la diapositiva y disecciona el resto de las IFM de la misma manera. Cuando se hayan recogido todas las IFM, utilice los 5 fórceps para eliminar cualquier músculo de salto o fragmentos de cutícula que puedan haber encontrado su camino en las muestras. A continuación, utilice la tensión de agua para capturar suavemente las IFM diseccionadas entre un par de fórceps, y coloque las IFM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 250 microlitros de PBS refrigerado.
Los datos de secuenciación de ARNm de las SIMM IR de BRUNO1 muestran cambios en la expresión en el nivel de unidad genética en comparación con los datos de secuenciación de tipos salvajes. Utilizando espectrometría de masas de proteoma completo en IFM diseccionadas, se observa una regulación similar a niveles de isoforma de proteínas y proteínas. Después de la inserción de una línea de trampa de proteína en el intrón final de Mhc, la incorporación de la proteína etiquetada por GFP se puede observar en IFM como dos puntos a cada lado de la línea M a 90 H APF, mientras que en el tejido muscular de la pierna la señal GFP se puede observar uniformemente a través de la línea M de sarcomere.
Cuando se utiliza RT-PCR en IFM diseccionado, se puede detectar un interruptor de isoforma Mhc del exón 34 a 37 etiquetado por GFP al evento exon 34 a 35 sin etiquetar, entre 30 y 48 horas después de la formación de puparium a 27 grados centígrados. A partir de los datos de secuenciación de ARNm, los tejidos musculares de pierna y salto expresan las tres isoformas Mhc, manteniendo la expresión de la isoforma etiquetada por GFP en el músculo maduro. Tanto Spalt mutante principal como BRUNO1 IR-IFM, no lograron desactivar la expresión de la isoforma Mhc etiquetada por GFP a medida que se desarrollan, lo que resultó en un perfil de expresión isóforma que se asemeja al del tejido muscular de pierna y salto.
Recuerde que las disecciones deben realizarse en menos de 30 minutos para evitar la degradación del ARN. Y, para tener cuidado de limitar la contaminación por otros tipos de células. Este método genera muestras enriquecidas con IFM adecuadas para enfoques bioquímicos como RT-PCR, o hinchazón occidental, así como enfoques de estilo omic, como espectrometría de masas, secuenciación de alto rendimiento, captura de conformación de cromatina y metabolómica.
Estas disecciones pueden complementar los poderosos enfoques genéticos de Drosophila con datos a nivel de sistemas para investigar los mecanismos fundamentales de desarrollo y regulación genética.
