Los autores agradecen al personal de la instalación de animales (BRC) por su apoyo continuo. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Salud y de Investigación Médica y el Consejo Australiano de Investigación.

Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité de Ética y Cuidado de Animales de la Universidad de Nueva Gales del Sur. 1. Preparación del transgén (integración aleatoria) <ol><li> Electroforesis analítica en gel de agarosa. <ol><li> Digerir el plásmido para extirpar el transgén utilizando enzimas apropiadas (1 h de incubación) o enzimas de digestión rápida (15 a 30 min de incubación) en un termociclador siguiendo las recomendaciones del fabricante (ver Figura 2A y su leyenda). </li><li> Se echó un gel de agarosa de ácido tris-acetato-etilendiaminotetraacético al 1% (TEA), teñido con 0,5-1,0 μg / ml de bromuro de etidio (EtBr). NOTA: Tenga cuidado cuando utilice EtBr; Es un potente mutágeno. Utilice el equipo de protección personal adecuado (consulte la hoja de datos de seguridad del material). </li><li> Cargar un marcador de peso molecular de 1 kb. </li><li> Cargar los fragmentos linealizados ( es decir, transgén y columna vertebral). </lI&gt; <li> Ejecutar la electroforesis a 100 V durante 45 min. </li><li> Visualizar el gel en un transiluminador ultravioleta (UV) para comprobar que la digestión es completa y confirmar el tamaño correcto del transgén ( es decir, 7,338 pb; véase la figura 2A ). </li></ol></li><li> Electroforesis preparativa en gel de agarosa. <ol><li> Se echó un gel de agarosa TAE al 1% teñido con una tinción de gel de baja toxicidad. Cargar 8 alícuotas (1 μg cada una) de transgén linealizado sin un marcador de peso molecular y ejecutar la electroforesis a 100 V durante 45 min. Utilice un bisturí para excisar todas las 8 bandas correspondientes al transgén linealizado. </li><li> Extraer el ADN usando un kit de extracción de gel siguiendo las recomendaciones del fabricante (ver Tabla de Materiales ). <ol><li> Se funden los fragmentos de gel a 50 ° C en tubos de 1,5 ml durante al menos 15 min. Se precipita con isopropanol y luego se añade el tampón de unión. </li><li> Combine todo el DNA pipeteando todo en una columna. Eluir en tampón de microinyección libre de nuclease (Tris-HCl 8 mM y EDTA 0,15 mM). Filtrar a través de un filtro de microcentrífuga de 0,22 μm y centrifugar durante 60 s a 12.000 x g. </li></ol></li><li> Medir la concentración y la calidad del ADN utilizando un espectrofotómetro. Compruebe que la relación A260 / A280 es de alrededor de 1,8 ( es decir, no hay contaminación por proteínas) y la relación A260 / A230 es de al menos 2,0 ( es decir, no hay contaminación por disolventes orgánicos). Diluir hasta 3 ng / μL en tampón de microinyección sin nucleasa, alícuota (20-50 μL) y congelar a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Síntesis de los componentes CRISPR (Gene Targeting) <ol><li> ARNm de Cas9. <ol><li> Diluir el ARNm de Cas9 (obtenido de una fuente comercial, véase la Tabla de Materiales ) a una concentración de 1 μg / μl en tampón de microinyección libre de nucleasa. </li><li> Alícuota en 2 μL y libre<html> Ze a -80ºC. </li></ol></li><li> Single-guide RNA (SgRNA). <ol><li> Identificar las dos secuencias genómicas deseadas (guías) utilizando una herramienta de diseño computacional que permite un mínimo potencial fuera de la actividad objetivo [ 17] . <ol><li> Para el knockout de genes, seleccionar sistemáticamente dos guías situadas a unos pocos cientos de pares de bases (bp), en direcciones opuestas, e incluir el codón de inicio del gen de interés. Para la reparación directa de homología, seleccione dos guías superpuestas (siempre que sea posible), en direcciones opuestas. NOTA: A modo de ejemplo, las guías siguientes han sido recientemente co-inyectadas con éxito para interrumpir el primer exón del gen TPM4.2 : Guía 1: 5 &#39;CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3&#39;; Guía 2: 5 &#39;CAGAACGATTGAGCTATGGC 3&#39; </li></ol></li><li> Ordenar un conjunto de cebadores como se describe en la Tabla 1 . </li><li> Sintetiza una plantilla de ADN lineal. <ol><li> Diluir px330Ref &quot;&gt; 12 a 10 ng / μl en agua libre de nucleasa. </li><li> Prepare la mezcla maestra como se indica en la Tabla 1 . Añadir la polimerasa al final y mantener la mezcla principal en hielo. </li><li> Mezclar y dividir en 8 tubos de PCR (19 μl / tubo). Añadir 1 μl de px330 por tubo y ejecutar la PCR bajo las siguientes condiciones: 1 min a 98 ° C; 40 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 64 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 15 s; Y un alargamiento final a 72 ° C durante 5 min. Mantener a 4 ° C. </li><li> Purificar los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR (véase la Tabla de Materiales ), un colector y una fuente de vacío (para un procesamiento más rápido). Aplicar la máxima resistencia al vacío ( es decir, 8 mbar). <ol><li> Añadir 5 volúmenes (100 μl) de tampón de unión a 1 volumen de la muestra de PCR y mezclar. </li><li> Coloque una columna de centrifugado de membrana de sílice (proporcionada) en un tubo de recolección (provisto) de 2 ml para centrifugación o en el colector para el proceso de vacíoEn g. Para unir ADN, aplique sucesivamente las 8 muestras a la columna y vacíe o centrifugue durante 60 s a 12.000 xg para cada carga. </li><li> Para lavar, añadir 0,75 ml de tampón de lavado (tampón PE) a la columna y vacío o centrifugar durante 60 s a 12.000 x g. Centrifugar la columna durante 60 s a 12.000 xg para eliminar el etanol residual. </li><li> Coloque la columna en un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml. Para eluir el ADN, añadir 30 μL de agua libre de nucleasa al centro de la membrana, dejar reposar la columna durante 1 min y centrifugar durante 60 s a 12.000 g. </li></ol></li><li> Medir la concentración utilizando un espectrofotómetro; Típicamente, la concentración debe ser de 100 ng / μl o superior. Compruebe que la relación A260 / A280 es de alrededor de 1,8 ( es decir, no hay contaminación por proteínas) y la relación A260 / A230 es de al menos 2,0 ( es decir, no hay contaminación por disolventes orgánicos). </li></ol></li><li> Transcripción in vitro usando un kit de síntesis de ARN T7. <ol><li> PrepararMezcla principal, como se indica en la Tabla 1 , e incubar durante 3 ha 37 ° C en un termociclador. Añadir 28 μl de agua libre de nucleasa y 2 μl de DNasa I e incubar durante otros 15 minutos a 37 ° C en un termociclador. </li></ol></li><li> Purificación de ARN utilizando columnas giratorias. <ol><li> Disolver el polvo contenido en la columna de centrifugado proporcionada en 650 μl de tampón de microinyección libre de nucleasas, eliminando cuidadosamente todas las burbujas de aire. Tape el tubo e hidrate durante 5 - 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Retire la tapa azul en la parte inferior y coloque la columna en un tubo de 2 ml. Centrifugar durante 2 min a 750 xg y temperatura ambiente. Coloque la columna en un tubo fresco de 1,5 ml y aplique 50 μL de la solución de ARN gota a gota al centro, sin tocar la pared de la columna. Girar la columna durante 2 min a 750 x g. </li><li> Mida la concentración de ARN usando un espectrofotómetro (el rendimiento típico de una reacción es de 30 - 50 μg). Compruebe que la relación A260 / A280 esAlrededor de 2,0 ( es decir, sin contaminación por proteínas) y la relación A260 / A230 es de al menos 2,0 ( es decir, no hay contaminación por disolventes orgánicos). Guarde los sgRNAs a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Evaluar la calidad del ARN usando los geles TAE al 1% utilizados habitualmente para la electroforesis de ADN. Ejecutar 200-400 ng de la plantilla de ADN y el correspondiente sgRNA en paralelo. La banda de ARN (≈ 100 pb) debería ser ligeramente mayor que la banda de ADN (véase la Figura 3A ). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Plantilla de donante <ol><li> Solicitar oligonucleótidos monocatenarios sintetizados comercialmente (ssOligos, véase la Tabla de Materiales ) para mutaciones puntuales o para la integración de pequeñas secuencias de hasta 50 pb; Homología armas son típicamente 60-90 pb de largo. </li><li> Para inserciones más grandes, use un plásmido donante como plantilla. Generar un plásmido adecuado usando el método de clonación clásico o la síntesis de novo de unFuente comercial. NOTA: Se recomienda un mínimo de 800 pb por homología. El tamaño de la columna vertebral no tiene influencia sobre la eficiencia de la homología directa de reparación (HDR). </li></ol> 4. Mezcla de inyección <ol><li> Diluir el ARNm de Cas9 a 50 ng / μl y los sgRNAs a 12,5 ng / μl (25 ng / μL en total) utilizando tampón de microinyección libre de nucleasa para experimentos de knockout génico. Añadir la plantilla de donante (ssOligo o plásmido) a una concentración de 200 ng / μ l para el genoma de edición de experimentos basados ​​en homología reparación directa. NOTA: Los volúmenes de dilución se pueden determinar fácilmente utilizando herramientas en línea, como una calculadora de resuspensión 18 . </li><li> Mantenga cada alícuota en hielo durante la sesión de microinyección y deséchela después (no vuelva a congelar la mezcla de inyección). </li></ol> 5. Vasectomía escrotal NOTA: Dos tipos de vasectomía se realizan comúnmente en ratones: abdominal y escrotal. El últimoEs menos invasiva y se ha descrito previamente [ 15] . <ol><li> Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos de acero inoxidable. </li><li> Determinar el peso del ratón usando una escala de pesada y anestesiar a los machos por inyección intraperitoneal (ip) con anestésicos inyectables (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg). </li><li> Monitoree la pérdida del reflejo del pellizco del dedo del pie y una vez que el ratón está sedado colóquelo encima de un cojín de calefacción. </li><li> Desinfectar la piel alrededor de los testículos con toallitas alternas de un antiséptico tópico como la clorhexidina y etanol al 70%. </li><li> Empuje los testículos hacia el saco escrotal y haga una incisión en la piel con un bisturí. </li><li> Visualice el testículo, la cauda del epidídimo y el conducto deferente. </li><li> Coge el conducto deferente con fórceps, sosténgalo y cauterize en cada lado de la pinza para retirar 3 mm del conducto deferente. </li><li> Realizar el mismo procedimiento en el segundo testículo. </li><li> Cierre las incisiones de la piel con clips de herida yRatón de cerca hasta la recuperación completa. </li></ol> 6. Superovulación (donantes de ovocitos) y el tiempo de apareamiento (hembras pseudo-embarazadas) NOTA: La técnica para generar un número adecuado de ovocitos fecundados y hembras foster taponadas para reimplantación se ha descrito en otra parte 15 . <ol><li> Inyectar 10 mujeres ip con 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG, en 100 μl) a las 12:00 del día 1. </li><li> Inyectar las hembras ip con 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG, en 100 μl) 46-48 h después (alrededor de las 11 am del día 3). </li><li> Acoplar inmediatamente a las hembras con machos de una sola vivienda durante la noche. </li></ol> 7. Inyecciones pronucleares (de integración aleatoria) y citoplásmicas (de orientación génica) <ol><li> Cull los ratones superovulados por dislocación cervical, exponer el abdomen, y el acceso a los ovarios y oviductos, como se describe anteriormente [ 15] . Diseccionar el oViducts y cosechar los complejos cumulus-ovocito (COCs) bajo un stereomicorscope [ 15] . Colóquelas en una gota de potasio simple optimización medio suplementado con aminoácidos (KSOMaa) siguiendo el método tradicional 15 . </li><li> Purificar los ovocitos añadiendo aproximadamente 1 μl de hialuronidasa (10 mg / ml) a la gota de medio KSOMaa utilizando una pieza bucal del aspirador y colocar la cápsula en una incubadora a 37ºC / CO2 al 5% durante 30 s a 1 min. </li><li> Lavar los ovocitos con 4 gotas nuevas de medio KSOMaa utilizando la pieza bucal del aspirador y transferirlos a una gota final de medio KSOMaa recubierto con aceite mineral (alrededor de 2 ml). Colocar el plato en la incubadora de 37 ° C / CO 2 al 5% hasta que los ovocitos estén listos para la inyección. </li><li> Inyección pronuclear (integración aleatoria). <ol><li> Visualizar los huevos bajo el microscopio estereoscópico y transferir aproximadamente 50 huevos a la cámara de inyecciónP de medio M2 recubierto con aceite mineral) usando la pieza bucal del aspirador. </li><li> Transferir la cámara de inyección al microscopio invertido e inyectar los ovocitos fecundados (dos pronúcleos visibles) con unos picolitros de la mezcla de inyección, apuntando a un pronúcleo (cualquiera de los pronúcleos puede ser objetivo). Visualizar una inyección exitosa observando la hinchazón del pronúcleo. </li></ol></li><li> Inyección citoplasmática (orientación génica). <ol><li> Transferir aproximadamente 50 huevos a una gota de KSOMaa que contiene 5 μg / ml de citocalasina B usando la pieza bucal e incubar durante 5 min en la incubadora a 37ºC / CO 2 al 5%. </li><li> Transferir los huevos a la cámara de inyección con la pieza bucal. </li><li> Inyectar pocos picolitros de la mezcla de inyección en el citoplasma a una presión muy baja (50-100 hPa), utilizando la presión de compensación del microinyector automático cuando sea posible. </li><li> Después de la inyección, transfiera los ovocitos de nuevo a una gota de KSOMaa (con la boca) y mantenerlos en el incubador de 37 ° C / 5% CO 2 , hasta que se cargan para su reimplantación en el oviducto de las hembras pseudo-preñadas. </li></ol></li></ol> 8. Reimplantación <ol><li> Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos de acero inoxidable. </li><li> Determinar el peso del ratón utilizando la escala de pesada y anestesiar a las hembras por inyección intraperitoneal (ip) con anestésicos inyectables (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg). </li><li> Monitoree la pérdida del reflejo del pellizco del dedo del pie y una vez que el ratón está sedado colóquelo encima de un cojín de calefacción. </li><li> Clip de una gran área de la piel alrededor de la línea media dorsal de la hembra del ratón. </li><li> Desinfectar la piel expuesta con toallitas alternas de un antiséptico tópico como la clorhexidina y etanol al 70%. </li><li> Exponer el tracto reproductivo siguiendo el método tradicional 15 . Haga una incisión de la piel de 1 cm de longitud paralela a la línea media dorsal, corte el músculo y agarre la almohadilla de grasa wiCon una pinza, luego tire suavemente del ovario hasta que su oviducto y el útero estén claramente visibles. </li><li> Fijar la almohadilla de grasa con una abrazadera del recipiente. Visualice el oviducto bajo el microscopio estereoscópico y usando un par de micro-tijeras hacer una incisión en la pared del oviducto pocos milímetros aguas arriba de la ampolla. </li><li> Bajo el microscopio estereoscópico, cargue 25 huevos microinyectados en el capilar de vidrio conectado a la pieza bucal (el diámetro interno del capilar debe ser alrededor de 120 μm de ancho). Introducir el capilar de vidrio en el oviducto y expulsar hasta que una burbuja de aire sea visible dentro de la ampolla. </li><li> Retire suavemente el capilar de vidrio y coloque el tracto reproductivo en el abdomen. Suturar la incisión con suturas quirúrgicas no absorbibles 3-0, luego cerrar con clips de herida. Monitoree el ratón de cerca hasta la recuperación completa. </li></ol> 9. Estrategias de genotipificación / secuenciación NOTA: Aislar el genomaADN de biopsias de 2 mm de la cola o del oído, siguiendo las normas de ética animal pertinentes. <ol><li> Extracción rápida de ADN genómico (integración aleatoria). <ol><li> Lyse las muestras de tejido (~ 2 mm) a 95 ° C durante 1 h en 100 μ l de reactivo de lisis alcalina (25 mM hidróxido de sodio y 0,2 mM EDTA, pH = 12). </li><li> Añadir 100 μl de reactivo neutralizante (Tris-HCl 40 mM, pH = 5). </li><li> Centrifugar durante 5 min a 12.000 gy 4 ° C. </li></ol></li><li> Extracción de ADN genómico de alta calidad (orientación génica). <ol><li> Se añaden 500 μl de tampón cola (Tris 50 mM, pH = 8, EDTA 100 mM, pH = 8, NaCl 100 mM, SDS al 1% y proteinasa K 0,5 mg / ml). </li><li> Incubar durante la noche a 55 ° C. </li><li> Mezclar durante 5 minutos por inversión (no vórtice). </li><li> Añadir 250 μL de NaCl saturado (6 M) y mezclar durante 5 min por inversión (no agitar vórtice). </li><li> Hacer girar durante 5-10 minutos a 12.000 xg y 4 ° C y verter el sobrenadante en el tubo nuevo. </lI&gt; <li> Añadir 500 μl de isopropanol y mezclar durante 5 min por inversión (no vórtice). </li><li> Girar durante 10 min a 12.000 xg y temperatura ambiente. </li><li> Decantar el sobrenadante (el pellet es invisible y se pega al tubo). </li><li> Lavar con 1 ml de etanol al 70%. </li><li> Girar durante 5-10 min a 12.000 xg y temperatura ambiente. Retire el sobrenadante con cuidado, ya que el pellet blanco ya no es pegajoso y se puede perder. </li><li> Secar al aire durante ~ 1 h. </li><li> Añadir 400 μl de tampón TE (Tris 10 mM y EDTA 1 mM, pH = 8). </li><li> Disolver el ADN a 55-60 ° C durante 2 h. </li></ol></li><li> Diseño del cebador. <ol><li> Diseño de los cebadores un mínimo de 20 pb de largo utilizando una herramienta computacional 19 . NOTA: Para la integración aleatoria, los cebadores deben hibridarse con el transgén, generando un fragmento distinto de 200-800 pb. Para la orientación génica, diseñar los cebadores para que se hibridan con el ADN genómico, la generación de un distinto fRación de unos cientos de pb alrededor de los sitios de corte. Para inserciones grandes, los cebadores pueden sentarse sobre el transgén, pero la confirmación de la integración dirigida se debe realizar posteriormente usando el caminar de imprimación o una técnica similar. </li></ol></li><li> PCR genotipificación. <ol><li> Para cada modificación genómica, diseñar un nuevo protocolo de PCR y probarlo empíricamente. Consideremos la longitud del fragmento generado y la temperatura de fusión (Tm) de cada par de cebadores. </li></ol></li><li> Secuenciación. <ol><li> Para la orientación de genes, envíe productos de PCR a un proveedor de servicios de secuenciación de Sanger. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+function+of+tau+mediates+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer's+disease+mouse+models.">Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models.</a> Cell. 142 (3), 387-397 (2010).</li><li>Ittner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+phosphorylation+of+tau+inhibits+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer's+mice.">Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice.</a> Science. 354 (6314), 904-908 (2016).</li><li>Marantz Henig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Monk in the Garden. , (2000).</li><li>Jaenisch, R., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simian+virus+40+DNA+sequences+in+DNA+of+healthy+adult+mice+derived+from+preimplantation+blastocysts+injected+with+viral+DNA.">Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei.">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Carbery, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 451-459 (2010).</li><li>Sung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting.">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).</li><li>Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Kang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+precise+genetic+modifications+into+human+3PN+embryos+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+editing.">Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing.</a> J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).</li><li>Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+editing+in+human+tripronuclear+zygotes.">CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.</a> Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).</li><li>Ittner, L. M., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronuclear+injection+for+the+production+of+transgenic+mice.">Pronuclear injection for the production of transgenic mice.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>. Resuspension Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/">https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/</a> (2017)</li><li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+differences+in+the+efficiency+of+transgenic+mouse+production.">Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production.</a> Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).</li><li>Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+superovulation+efficiency,+aneuploidy+rates,+and+sister+chromatid+cohesion+in+mice+aged+up+to+15+months.">Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months.</a> Biol Reprod. 86 (2), 49 (2012).</li><li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-superovulation+for+the+CRISPR-Cas9-mediated+production+of+gene-knockout,+single-amino-acid-substituted,+and+floxed+mice.">Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice.</a> Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male.">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).</li><li>Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+procedure+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms.">An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), E88 (2001).</li><li>Yoshimi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ssODN-mediated+knock-in+with+CRISPR-Cas+for+large+genomic+regions+in+zygotes.">ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.</a> Nat Commun. 7, 10431 (2016).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+via+CRISPR/Cas9+mediated+homology-independent+targeted+integration.">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. , (2016).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-71 (1999).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+mutation+at+the+known+collagenase+cleavage+site+in+mouse+type+I+collagen+impairs+tissue+remodeling.">A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling.</a> J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).</li><li>Ke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+suppression+of+A315T+mutant+human+TDP-43+expression+improves+functional+deficits+in+a+novel+inducible+transgenic+mouse+model+of+FTLD-TDP+and+ALS.">Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS.</a> Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).</li><li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+functional+transgenic+mice+by+DNA+pronuclear+microinjection.">Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection.</a> Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice.">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).</li><li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+globin+messenger+RNA+by+the+mouse+ovum.">Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum.</a> Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).</li><li>Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+transfer+into+mouse+ova+by+microinjection.">Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection.</a> Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).</li><li>Biggers, J. D., Summers, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+culture+medium:+making+informed+choices.">Choosing a culture medium: making informed choices.</a> Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+transfer+through+the+wall+of+the+fallopian+tube+in+mice.">Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice.</a> Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).</li><li>Truett, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+(HotSHOT).">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Delerue, F., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+Mice+Using+CRISPR/Cas9:+Achievements+and+Prospects.">Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects.</a> Clon. Transgen. 4, (2015).</li></ol>

Los autores proporcionan servicios de transgénesis académica en ratones a través de la Universidad de Nueva Gales del Sur Mark Wainwright Analytical Center.

Pasos críticos dentro del protocolo Se sabe que la generación de ratones modificados genéticamente es técnicamente difícil. Sin embargo, el protocolo presentado aquí es un método optimizado y simplificado que permite dominar y solucionar problemas de la técnica en tiempo récord. Hay dos pasos necesarios para la finalización exitosa de la técnica. En primer lugar, la síntesis de plantillas de ADN lineal (para la síntesis de sgRNAs) se puede lograr sin cloruro de magnesio (MgCl 2 ). Sin embargo, se recomienda sumamente agregar MgCl2 a la mezcla maestra porque la hibridación parcial del cebador directo a menudo se evita en ausencia de MgCl2. Además, es crítico que la secuencia genómica dirigida no esté presente en ninguna parte de la plantilla donante (en el caso de integración dirigida), de lo contrario la nucleasa Cas9 la cortará, impidiendo la aparición de HDR. ModificacionesY solución de problemas Aunque este protocolo para la generación de ratones genéticamente modificados se ha optimizado y racionalizado a lo largo de los años, hay algunas consideraciones relacionadas con el rendimiento de los oocitos de buena calidad para la microinyección y la tasa de taponamiento de las mujeres de acogida. La elección de la cepa de fondo es crítica en cuanto al número de cachorros vivos que resultan de una sesión de microinyección. C57BL / 6 es el fondo más comúnmente utilizado para los modelos de ratón de enfermedades. Sin embargo, es también uno de los fondos menos eficientes en términos de resistencia a la microinyección 20 . Además, la edad de la hembra es también crítica para producir un gran número de oocitos; Se recomienda evitar los ratones 5-8 semanas de edad, independientemente de los antecedentes, ya que este es el período menos favorable de la respuesta a la estimulación hormonal [ 21] . En nuestra experiencia, los ratones C57BL / 6 de 3 a 4 semanas de edad producen fiablemente 20-30 huevos por hembra. Es importanteHay que destacar que una nueva técnica (denominada ultra-superovulación) ha producido hasta 100 huevos por hembra y recientemente se ha utilizado para generar oocitos para la microinyección 22 . Sin embargo, el uso de ultra-superovulación para la microinyección es generalmente obstaculizada por la necesidad de fertilizar artificialmente (fertilización in vitro ) un gran número de huevos. Para obtener hembras foster taponadas adecuadas para reimplantación, ratones hembra se aparean con varones vasectomizados (el fondo de estos ratones no es crítico). Para aumentar el número de receptores taponados, se puede realizar un examen cuidadoso de la etapa de estro y la selección de hembras adecuadas 23 . La sincronización de los ciclos de las hembras también puede ser inducida por la exposición de las hembras a varones vasectomizados dos días antes del apareamiento (el llamado &quot;efecto Whitten&quot;) [ 24] . Limitaciones de la técnica <p clUna vez optimizado, el procedimiento debería permitir confiablemente la generación sistemática de ratones modificados genéticamente durante cada sesión de microinyección. Sin embargo, hay dos limitaciones principales del procedimiento que se correlacionan con el tamaño del intento de modificación genómica. Modificaciones genómicas muy pequeñas, tales como mutaciones puntuales, son relativamente fáciles de generar, pero son difíciles de identificar. Cuando se realiza genotipado, los productos de PCR se secuencian directamente mediante secuenciación de Sanger. Sin embargo, la microinyección directa de los componentes de CRISPR en ovocitos de ratón a menudo genera animales de mosaico porque el Cas9 permanece activo durante bastante tiempo y pueden ocurrir diferentes modificaciones genómicas después de la primera división del ovocito. Este efecto de confusión complica la identificación de mutaciones discretas entre varios alelos, y la secuenciación de próxima generación (NGS) puede ayudar con lecturas desafiantes. Las técnicas sensibles, como el tetra-primerARMS-PCR, 25 también puede ayudar con el genotipado de la colonia después de la identificación de los fundadores por secuenciación. Por el contrario, la inserción de grandes trozos de ADN de una manera selectiva sigue siendo un reto. Cuanto mayor sea el ADN exógeno, menor será la eficacia de HDR. En consecuencia, se están desarrollando actualmente nuevas estrategias, como el uso de donantes ssOligos largos (en lugar de plásmidos) 26 o integración dirigida independientemente de HDR [ 27 ]. Significado del protocolo Este protocolo presenta avances significativos porque los cuatro pasos principales ( es decir, preparación de los componentes del transgén o CRISPR, microinyección, reimplantación y genotipificación) se han optimizado, probado y validado en nuestro laboratorio. La integración aleatoria de transgenes es ampliamente utilizada para estudios de sobreexpresión por dos razones principales. Primero, para avoId el &quot;efecto de posición&quot; potencial, la integración dirigida de un transgén usando CRISPR en loci de &quot;puerto seguro&quot;, como los loci Rosa26 28 y Col1a 29 , sigue siendo notoriamente desafiante, ya que la eficiencia de HDR es baja. Estrategias para superar este problema son próximos 26 , 27 , pero la integración aleatoria hasta ahora ha demostrado ser más eficiente. Además, la generación de múltiples líneas transgénicas que sobreexpresan el mismo transgén con diferentes niveles de expresión es de interés en estudios que implican estrategias de tratamiento para revertir un fenotipo 30 . Los transgenes basados ​​en plásmidos se generan por medio de clonación, usando enzimas de restricción ad hoc para ensamblar fragmentos esenciales para la expresión de una proteína de interés. Generalmente, un transgén está hecho de al menos tres elementos: un promotor adecuado (a veces se añaden regiones potenciadoras); La codificación(CDNA), con o sin regiones intrónicas; Y una cola PolyA para estabilizar la expresión de mRNA [ 31] . Una vez montado, el transgén se inserta en un plásmido que contiene elementos de replicación bacterianos y se expande en cultivo después de la transformación (normalmente basado en choque térmico). El método de purificación de los transgenes para la microinyección es crítico. Este trabajo describe el uso de tinciones de ADN de nueva generación (baja toxicidad) para una visualización más precisa del fragmento de interés en el gel (en comparación con el cristal violeta tradicional) y una exposición mutagénica baja (en comparación con el bromuro de etidio). El método de no clonación descrito aquí para la orientación génica es muy rápido y permite la síntesis de varios sgRNAs en sólo 5-6 h. Sólo se requieren cuatro pasos: la identificación de la secuencia diana, la síntesis de una plantilla de ADN lineal que contiene un promotor T7 y la secuencia diana elegida, la síntesis deF del sgRNA por transcripción in vitro (IVT), y la purificación del sgRNA usando columnas de spin. En la edad temprana de la edición del genoma del ratón CRISPR, se evaluó sistemáticamente el potencial efecto fuera del objetivo, aunque se ha demostrado que es muy limitado en embriones de ratón 32 y se puede diluir fácilmente por medio de un esquema de reproducción en el que los ratones seleccionados llevan solamente La modificación genómica deseada. La actividad objetivo también fue sistemáticamente pre-evaluada in vitro , utilizando diferentes guías y seleccionando las más activas 12 . Esta práctica es ahora menos común, por varias razones. En primer lugar, la actividad sobre la diana se evalúa utilizando transfección de líneas de células de ratón inmortalizadas (normalmente N2a o NIH3T3) con plásmidos codificadores de CRISPR. Este es un método diferente al de la inyección de componentes de ARN CRISPR en ovocitos de ratón. Por lo tanto, los resultados encontrados in vitro no siempre se traducen igualmenteA los ovocitos. Además, los experimentos de alto rendimiento mostraron que la mayoría de las guías son activas 33 . En consecuencia, no se evalúa la actividad en la diana y, hasta ahora, no ha habido evidencia de una guía que muestre ninguna actividad en los oocitos de ratón. Junto con el método de no-clonación para sintetizar sgRNAs, presentado aquí, esto simplifica y agiliza enormemente el flujo de trabajo, y múltiples guías activas pueden sintetizarse sin problemas en un día. CRISPR se considera una &quot;tecnología disruptiva&quot;, que es una innovación que cambia la forma en que se realizan las técnicas. Cuando se estableció la microinyección, Brinster et al. Mostraron que la transgénesis citoplásmica, aunque alcanzable, se mantuvo en su mayoría ineficiente [ 7] . En consecuencia, la microinyección pronuclear permaneció la única práctica común durante casi 30 años, hasta la primera demostración de un gen CRISPR exitoso dirigido a ratones. Este estudio mostró que microinject citoplasmático<html> Ion podría generar un resultado similar o superior en comparación con pronuclear entrega [ 12] . Obviamente, debido a que los componentes de CRISPR están hechos típicamente de ARN, es evidente que el citoplasma está dirigido. Sin embargo, incluso cuando se inyectan en el citoplasma, las plantillas de donantes también pueden inducir HDR con éxito. Una alta concentración citoplásmica de plantillas permite su difusión en el núcleo. Además, el uso de microinyección citoplásmica 16 no es un requisito. Una incubación corta de los oocitos con un inhibidor del citoesqueleto, tal como la citochalasina B, aumenta la supervivencia de los oocitos 34 , 35 , haciendo que sea suficiente para realizar inyecciones citoplásmicas sin un sistema de accionamiento por impacto piezoeléctrico. Del mismo modo, el uso de un medio de cultivo mejorado, tal como KSOMaa, disminuye el bloqueo en la etapa de dos células y mejora la capacidad de desarrollo de los embriones en comparación con el medio M16Xref &quot;&gt; 36. Los embriones de una o dos células (cuando se cultivan durante la noche) se pueden transferir al oviducto. El procedimiento convencional es bastante invasivo, ya que requiere el desgarramiento de la bolsa que protege el ovario. También es técnicamente difícil, porque el capilar de vidrio necesita ser insertado en el infundíbulo 15 . El método presentado aquí es mucho más fácil de aprender, no induce sangrado potencial, y preserva la integridad del ovario. Se basa en el trabajo desarrollado en la Universidad de Kumamoto 37 . Las estrategias de genotipificación y las técnicas de secuenciación son fundamentales para identificar a los posibles fundadores. Para la integración aleatoria, la extracción de ADN genómico se basa en un método sencillo adaptado de Truett et al. 38 . Un método de extracción tan rápido es suficiente para identificar a los fundadores potenciales, ya que los cebadores están diseñados para hibridar con el transgén (a menudo integrComo copias múltiples). Por el contrario, la orientación génica requiere ADN genómico altamente purificado, ya que el producto de PCR abarca la región genómica modificada. Para knockout génico, el método tradicional de inyectar un único sgRNA genera pequeñas deleciones (indels) o inserciones, eventualmente knock out el gen de interés [ 12] . Estas pequeñas modificaciones son difíciles de identificar y, a menudo, requieren de la clonación y la secuenciación independientes de la ligase tiempo, para confirmar la naturaleza de estas mutaciones. En este protocolo, aprovechamos CRISPR multiplexación para desarrollar la co-inyección sistemática de dos sgRNAs que abarca el codón de inicio de un gen de interés. Esto no sólo aumenta la probabilidad de un knockout de genes, sino también la escisión de un trozo de ADN genómico de un tamaño predefinido (100-300 pb), lo que permite la fácil identificación de los fundadores mediante simple PCR. De nota, los cachorros que no llevan el esperado genómico eXcision todavía podría analizarse para pequeñas mutaciones frameshift, cuando sólo un sgRNA demostrado activo. Del mismo modo, en el caso de la edición de genes, la co-inyección sistemática de dos sgRNAs superpuestos en direcciones opuestas debe aumentar la eficiencia de HDR, ya que los mecanismos de reparación celular preferentemente utilizar uno de los dos hilos [ 39] . Aplicaciones futuras El presente protocolo aprovecha los últimos avances en la embriología del ratón y la orientación de genes 40 para simplificar y agilizar el proceso de generación de diversos modelos de ratón sofisticados de las condiciones humanas. Estos modelos desempeñan un papel fundamental en ayudar a desarrollar nuestra comprensión de pathomechanisms, en última instancia, ayudando en el desarrollo de estrategias terapéuticas [ 2] . La optimización y racionalización de los reactivos necesarios para la orientación génica o la integración aleatoria se aplican ampliamente y fácilmenteA otras especies de mamíferos, como ratas, conejos e incluso a animales grandes como el ganado.

Modelos animales, tanto en vertebrados e invertebrados, han sido fundamentales para examinar la fisiopatología de condiciones humanas como la enfermedad de Alzheimer 1 , 2 . También son herramientas invaluables para buscar modificadores de la enfermedad y, en última instancia, desarrollar nuevas estrategias de tratamiento con la esperanza de una cura. Aunque cada modelo tiene limitaciones intrínsecas, el uso de animales como modelos sistémicos enteros es vital para la investigación biomédica. Esto se debe a que el entorno fisiológico metabólico y complejo no puede ser completamente simulado en el cultivo de tejidos. Hasta la fecha, el ratón sigue siendo la especie de mamífero más común utilizada para la manipulación genética, ya que presenta varias ventajas. Los procesos fisiológicos y los genes asociados con enfermedades son altamente conservados entre ratones y humanos. El ratón fue el primer mamífero que tuvo su genoma completo secuenciado (2002), un año antes del genotipo humanoMe (2003). Aparte de esta riqueza de información genética, el ratón tiene buenas capacidades de cría, un ciclo de desarrollo rápido (6 semanas desde la fertilización hasta el destete) y un tamaño razonable. Todas estas ventajas, junto con los indicadores fisiológicos, como los distintos colores de la capa (necesarios para las estrategias de cruce), convirtieron al ratón en un modelo atractivo para la manipulación genética. En particular, en la temprana edad de la genética moderna, Gregor Mendel comenzó a trabajar en ratones antes de pasar a las plantas 3 . Técnicas de transferencia de genes resultó en la generación del primer ratón transgénico hace más de tres décadas 4 , inicialmente creado mediante la administración viral. Sin embargo, los investigadores pronto se dieron cuenta de que uno de los principales retos de la transgénesis del ratón era la incapacidad de controlar el destino del ADN exógeno. Debido a que la entrega viral de transgenes en ovocitos de ratón resultó en múltiples copias integradas al azar en el genoma, el possibilitY de establecer líneas transgénicas posteriores fue limitada. Una de tales limitaciones fue superada cuando Gordon et al. Generó la primera línea de ratón transgénico por microinyección 5 , 6 . Esto comenzó la era de la tecnología del ADN recombinante, y los parámetros que influyen en el resultado de una sesión de microinyección han sido ampliamente estudiados [ 7] . Aunque la microinyección no permite el control sobre el sitio de integración del transgén (que eventualmente da lugar a niveles de expresión específicos para cada ratón fundador), la principal ventaja de la microinjección pronuclear sigue siendo la formación de concatemers ( es decir, matrices de múltiples copias del transgén, Vinculados en serie) antes de la integración genómica 5 . Esta característica se ha utilizado a lo largo de los años para establecer miles de líneas transgénicas de ratón que sobreexpresan un gen de interés. Desde entonces, la transgénesis, la aModificación artificial del genoma de un organismo, se ha utilizado ampliamente para identificar el papel de los genes individuales en la aparición de enfermedades. Otro logro clave en la manipulación del genoma del ratón se alcanzó cuando Mario Capecchi con éxito interrumpido un solo gen en el ratón, abriendo la era de la orientación de genes [ 8] . Sin embargo, los inconvenientes importantes emergieron rápidamente de la orientación de genes basados ​​en células ES, incluyendo los desafíos de cultivar células ES, el grado de quimerismo algo variable y la duración del proceso ( es decir, 12-18 meses, mínimo, para obtener el ratón) . Recientemente, los avances en nuevas tecnologías, tales como las endonucleasas de ingeniería ( por ejemplo, las nucleasas de dedo de cinc (ZFN), las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción (TALEN) y las repeticiones palindrómicas cortas intercaladas con intervalos regulares (CRISPR / Cas9) han surgido como métodos alternativos para Acelerar el proceso de orientación de genes en micrófonoE 9 , 10 . Estas endonucleasas pueden inyectarse fácilmente en ovocitos de ratón mediante microinyección, lo que permite la generación de ratones dirigidos a genes en tan sólo 6 semanas. Desde el primer informe sobre el uso de CRISPR para la edición del genoma 11 , este sistema inmune adaptativo bacteriano ha reemplazado ZFN y TALEN debido a sus muchas ventajas, incluyendo la facilidad de síntesis y la capacidad de apuntar múltiples loci a la vez (denominado &quot;multiplexing &quot;). CRISPR se utilizó por primera vez para la orientación génica en ratones [ 12] y desde entonces se ha aplicado a innumerables especies, de las plantas a los seres humanos [ 13 , 14] . Hasta la fecha, no hay ningún informe de una sola especie resistente a la edición del genoma CRISPR. Los dos pasos limitantes principales de la generación de ratones transgénicos son la inyección de ovocitos y el reimplanteDe estos ovocitos en hembras pseudo-preñadas. Aunque esta técnica ha sido descrita por nosotros 15 y otros 16 , las recientes mejoras técnicas en embriología de ratón y técnicas de transferencia de genes han revolucionado el proceso de generación de ratones genéticamente modificados. Estas mejoras se describirán en el presente documento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 0.1-2.5 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">4920000016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 2-20 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 20-200 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 100-1000 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular weight marker&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular weight marker&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td>HyperLadder 100 bp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93296</td>
			<td>10x - Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Safe gel stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PCR purification kit (Qiaquick)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Vacuum system (Manifold)</td>
			<td style="width:147px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free microinjection buffer&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-095-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrafree-MC microcentrifuge filter&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cas9 mRNA</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CAS9MRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">CRISPR expressing plasmid (px330)</td>
			<td style="width:147px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 Quick High Yield RNA kit</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">RNA purification spin columns (NucAway)</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ssOligos</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO STANDARD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Donor plasmid</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">GeneArt</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">KSOMaa embryo culture medium</td>
			<td>Zenith Biotech&#160;</td>
			<td>ZEKS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Mineral oil</td>
			<td>Zenith Biotech&#160;</td>
			<td>ZSCO-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">M2 Medium</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Mouthpiece</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glass microcapillaries</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Proteinase K</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3830.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Vessel clamp</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">18374-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Wound clips&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Clips applier&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cauterizer</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>18000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1691H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">5% CO2 incubator</td>
			<td style="width:147px;">MG Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Galaxy 14S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Electrophoresis set up</td>
			<td style="width:147px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1640300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">UV Transilluminator</td>
			<td style="width:147px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1708110EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>6334000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscopic microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">2x Micromanipulators</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5188000.012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Oocytes manipulator</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5176000.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microinjector (Femtojet)</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5247000.013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Mice C57BL/6J strain</td>
			<td style="width:147px;">Australian BioResources</td>
			<td>C57BL/6JAusb&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes

El uso de ratones modificados genéticamente ha contribuido significativamente a los estudios tanto en procesos fisiológicos y patológicos in vivo . La inyección pronuclear de construcciones de expresión de ADN en oocitos fertilizados sigue siendo la técnica más comúnmente utilizada para generar ratones transgénicos para sobreexpresión. Con la introducción de la tecnología CRISPR para la orientación génica, la inyección pronuclear en ovocitos fertilizados se ha extendido a la generación de ratones knock-out y knockin. Este trabajo describe la preparación de ADN para inyección y la generación de guías CRISPR para la orientación génica, con especial énfasis en el control de calidad. Los procedimientos de genotipado necesarios para la identificación de los posibles fundadores son críticos. Se presentan aquí estrategias innovadoras de genotipado que aprovechan las capacidades de &quot;multiplexación&quot; de CRISPR. También se describen procedimientos quirúrgicos. Juntos, los pasos del protocolo permitirán la generación de genY para el posterior establecimiento de colonias de ratón para una plétora de campos de investigación, incluyendo inmunología, neurociencia, cáncer, fisiología, desarrollo y otros.

A continuación, se describen los flujos de trabajo para la microinyección en el caso de la integración aleatoria y la orientación de genes mediados por CRISPR ( Figura 1 ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> Figura 1: Flujo de trabajo típico para la generación de ratones modificados genéticamente. Para la integración aleatoria, el transgén purificado se inyecta en el pronúcleo de ovocitos fecundados antes de la transferencia del oviducto en las hembras foster taponadas. El análisis de la progenie se realiza mediante PCR después de una rápida extracción de ADN genómico. Para la orientación de genes CRISPR, sgRNAs se sintetizan utilizando el método de no-clonación que se describe aquí, y dos guías se co-inyecta (junto con Cas9 mRNA) en el citoplasma de ovocitos fecundados. Esta estrategia se utiliza para el posterior análisis basado en la PCR de la progenie, que requiere g altamente purificadoEnomic DNA. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55765/55765fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Aunque la microinyección de ovocitos y el reimplante de estos huevos inyectados son los dos pasos limitantes principales que requieren habilidades técnicas y entrenamiento, la calidad de la mezcla de inyección es de suma importancia para generar con éxito ratones modificados genéticamente. La calidad de la purificación del transgén ( Figura 2A ) y la síntesis de sgRNAs ( Figura 3A ) se deben evaluar sistemáticamente en geles analíticos de agarosa. También deben comprobarse las posibles contaminaciones de la mezcla al medir las concentraciones con un espectrofotómetro, ya que los diferentes valores de absorción dependen directamente del grado de pureza de la solución (véanse los pasos 1.2.3, 2.2.3.5 y 2.2.5.3). <p class="jove_content"Fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Del mismo modo, la identificación de ratones fundadores potenciales depende en gran medida de estrategias innovadoras de genotipificación. Este trabajo ilustra una lectura típica de una sesión de microinyección, tanto para la integración aleatoria ( Figura 2B ] como para la orientación de genes ( Figura 3B ). Los protocolos de extracción de ADN también son diferentes dependiendo del tipo de experimentos; Las PCR posteriores se basan en cebadores que se hibridan bien en el transgén o en el ADN genómico, respectivamente. Las estrategias presentadas aquí permiten la fácil solución de problemas y racionalización de cada paso requerido para producir ratones genéticamente modificados. Aunque el resultado cuantitativo de una sesión de microinyección varía dependiendo de la experiencia del experimentador, una vez que se ha optimizado cada paso del protocolo, el porcentaje de cachorros transgénicos obtenidos normalmente debe alcanzar 10-25% para el integ, Como se ilustra en la Figura 2B (4 fundadores de 15 crías nacidos = 26,6%). Esta eficiencia algo &quot;baja&quot; contrasta con la capacidad fiable de los componentes CRISPR para editar el genoma del ratón. De hecho, el número de fundadores generados es generalmente mayor cuando se utiliza CRISPR para la orientación génica y oscila entre el 25 y el 100% (véase la figura 3B , 3 fundadores de 13 cachorros = 23%). No es raro obtener una progenie entera que sea homocigótica con éxito cuando se editan usando CRISPR. <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig2.jpg" /> Figura 2: Estrategia de control de calidad y genotipificación para la producción exitosa de ratones transgénicos para sobreexpresión. ( A ) El plásmido se digiere durante 1 h con PvuI y NotI. Digestión completa y tamaños correctos ( es decir, transgén = 7,338 pb, columna vertebral = 1,440+ 896 pb) en un gel analítico (1). La extracción de varios productos de digestión a partir del gel preparativo (2) genera una concentración aumentada del transgén. Se debe evitar la exposición prolongada a los rayos UV y se recomienda el uso de una luz azul en lugar de un transiluminador UV. (B) Estrategia de genotipado (1): Los cebadores deben sentarse sobre el transgén y deben estar diseñados para generar un fragmento de 200 - 800 pb. Cuando se realiza el genotipado (2), se recomienda incluir un control positivo ( es decir, la mezcla de inyección utilizada para microinyección) y un control negativo ( es decir, ADN genómico de un ratón WT). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55765/55765fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig3.jpg" /> Figura 3: Control de calidad y genotipificaciónPara la exitosa producción de ratones con orientación genética (KO). ( A ) La calidad de los sgRNAs producidos por transcripción in vitro se evalúa ejecutando la plantilla de ADN y el ARN generado en paralelo para cada guía. El tamaño del ARN es ligeramente mayor que el ADN. Si la calidad es satisfactoria ( es decir, no hay bandas de frotis) se miden las concentraciones. ( B ) Diseño de las dos guías (direcciones opuestas) que abarcan el codón de inicio en el Exón 1. Los cebadores se seleccionan para hibridarse con el ADN genómico fuera de la región eventualmente excisada por las dos guías. Típicamente, esta estrategia permite la identificación directa de heterocigotos (# 5 y 9) y homocigotos (# 3) KO fundadores utilizando PCR (2). Los productos de PCR de animales homocigóticos no muestran ninguna banda WT. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55765/55765fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <tableBorder = &quot;1&quot; para: keep-together.within-page = &quot;1&quot; para: keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reacción </td><td> Componentes </td><td> Volumen </td><td> Nota </td></tr><tr><td rowspan="7"> Síntesis de la plantilla de ADN lineal (2,5) </td><td> Nuclease libre de agua </td><td> 97,2 μL </td><td></td></tr><tr><td> 5x tampón HF </td><td> 36 μL </td><td></td></tr><tr><td> MgCl _ {2} </td><td> 9 μL </td><td></td></tr><tr><td> DNTP 10 mM </td><td> 9 μL </td><td></td></tr><tr><td> 10 mu M de cebador de fwd </td><td> 9 μL </td><td> 5&#39;TTAATACGACTCACTATAGN 20 Gttttagagctagaaatagcaagttaaaata Aggctagtc 3 &#39; </td></tr><tr><td> 10 mu M de cebador de rev </td><td> 9 μL </td><td> 5 &#39;AAAAGCACCGACTCGGTGCC 3&#39; </td></tr><tr><td> PrOof-reading polymerase </td><td> 1,8 μl </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> IVT utilizando un kit de síntesis de ARN T7 (2.6) </td><td> Nuclease libre de agua </td><td> X μL </td><td> Completar hasta 20 μL de volumen total </td></tr><tr><td> Mezcla tampón NTP </td><td> 10 μL </td><td></td></tr><tr><td> ADN modelo </td><td> ≈ 300 ng </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasa </td><td> 2 μL </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1: Composición de las diferentes mezclas maestras utilizadas en este estudio. Síntesis de la plantilla de ADN lineal: La secuencia mínima del promotor T7 (TTAATACGACTCACTATAG) está arriba de la secuencia de 20 pb (guía; N 20 identificada utilizando la herramienta de diseño CRISPR) y una secuencia complementaria al vector de expresión (gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc). In vitroTranscripción (IVT): Dependiendo de la concentración de la plantilla de ADN, el volumen final debe ajustarse a 20 μL con agua libre de nucleasa.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes at JoVE.com

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

La microinyección de ovocitos de ratón se utiliza comúnmente tanto para la transgénesis clásica ( es decir, la integración aleatoria de transgenes) como para la orientación de genes mediados por CRISPR. Este protocolo revisa los últimos avances en microinyección, con especial énfasis en el control de calidad y las estrategias de genotipificación.

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

generation-genetically-modified-mice-through-microinjection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

20.4K vistas.  University of New South Wales.  La microinyección de ovocitos de ratón se utiliza comúnmente tanto para la transgénesis clásica ( es decir, la integración aleatoria de transgenes) como para la orientación de genes mediados por CRISPR. Este protocolo revisa los últimos avances en microinyección, con especial énfasis en el control de calidad y las estrategias de genotipificación. 

Video: Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Generación de células madre adiposas Humano a través Desdiferenciación de adipocitos maduros en culturas de techo

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Vitrificación de Volumen Mínimo de Ovocitos Felinos Inmaduros

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separación de células foliculares y ocitos en folículos ováricos de pez cebra

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. Cardiac differentiation from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is modulated by defined signaling pathways that are essential for embryonic heart development. Numerous cardiac differentiation methods on 2-D and 3-D platforms have been developed with various efficiencies and cardiomyocyte yield. This has puzzled investigators outside the field as the variety of these methods can be difficult to follow. Here we present a comprehensive protocol that elaborates robust generation and expansion of patient-specific cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). We first describe a high-efficiency iPSC reprogramming protocol from a patient&#39;s blood sample using non-integration Sendai virus vectors. We then detail a small molecule-mediated monolayer differentiation method that can robustly produce beating cardiomyocytes from most human iPSC lines. In addition, a scalable cardiomyocyte expansion protocol is introduced using a small molecule (CHIR99021) that could rapidly expand patient-derived cardiomyocytes for industrial- and clinical-grade applications. At the end, detailed protocols for molecular identification and electrophysiological characterization of these iPSC-CMs are depicted. We expect this protocol to be pragmatic for beginners with limited knowledge on cardiovascular development and stem cell biology.

Here, we present a protocol to robustly generate and expand human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells.

Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microinyección de cigoto para la creación de alelos de genes de casete knock-in y flox en ratones

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...