저자들은 지속적인 지원을 위해 동물 시설 (BRC) 직원에게 감사를드립니다. 이 작품은 국가 건강 및 의학 연구 협의회 (National Health and Medical Research Council)와 호주 연구위원회 (Australian Research Council)의 지원을 받았다.

모든 절차는 뉴 사우스 웨일즈 동물 보호 및 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 1. Transgene의 준비 (Random Integration) <ol><li> 분석 아가 로스 겔 전기 영동. <ol><li> 제조자의 권고 사항을 따르는 thermocycler에서 적절한 효소 (1 시간 배양) 또는 빠른 분해 효소 (15 ~ 30 분 배양)를 사용하여 도입 유전자를 제거하기 위해 플라스미드를 분해하십시오 ( 그림 2A 및 그 전설 참조). </li><li> 0.5 ~ 1.0 μg / ML ethidium bromide (EtBr)로 염색 한 1 % 트리스 - 아세테이트 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (TEA) 아가로 오스 겔을 주조합니다. 참고 : EtBr을 사용할 때는주의하십시오. 그것은 유력한 돌연변이 원입니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오 (물질 안전 보건 자료 참조). </li><li> 1 kb 분자량 마커를로드하십시오. </li><li> 선형화 된 조각 ( 즉, 도입 유전자 및 백본)을로드하십시오. </li&gt; <li> 전기 영동을 100V에서 45 분 동안 실행합니다. </li><li> 자외선 (UV) 투과 조명기에서 젤을 시각화하여 소화가 완료되었는지 확인하고 트랜스 진 ( 즉, 7,338 bp, 그림 2A 참조 )의 정확한 크기를 확인하십시오. </li></ol></li><li> 준비 아가로 오스 겔 전기 영동. <ol><li> 저독성 젤 얼룩으로 염색 된 1 % TAE 아가 로즈 겔을 주조하십시오. 분자량 마커가없는 직선화 된 도입 유전자 8 개 (각 1 μg)를 넣고 45 분 동안 100 V에서 전기 영동하십시오. 선형화 된 도입 유전자에 해당하는 8 개의 모든 밴드를 제거하려면 메스를 사용하십시오. </li><li> 제조사의 권고 사항에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다 ( 재료 표 참조). <ol><li> 적어도 15 분 동안 1.5 ML 튜브 50 ° C에서 겔 조각을 녹여. 이소프로판올로 침전시킨 다음 결합 버퍼를 첨가하십시오. </li><li> 전체 D 조 합치기모든 것을 하나의 컬럼으로 피펫 팅하여 NA. 뉴 클레아제가없는 마이크로 인젝션 완충액 (8 mM Tris-HCl 및 0.15 mM EDTA)으로 용출시킨다. 0.22 μm의 미세 원심 분리 필터를 거쳐 12,000 x g에서 60 초 동안 원심 분리하십시오. </li></ol></li><li> 분광 광도계를 사용하여 DNA의 농도와 품질을 측정하십시오. A260 / A280 비율이 1.8 ( 즉, 단백질에 의한 오염 없음)이고 A260 / A230 비율이 2.0 이상 ( 즉, 유기 용제에 의한 오염 없음)인지 점검하십시오. nuclease-free 마이크로 인젝션 버퍼, 분액 (20-50 μL)에서 3 ng / μL로 희석하고 -20 ° C에서 동결하십시오. </li></ol></li></ol> 2. CRISPR 성분의 합성 (유전자 표적화) <ol><li> Cas9 mRNA. <ol><li> nuclease-free 마이크로 인젝션 버퍼에 1 μg / μL의 농도로 Cas9 mRNA (상업용 소스에서 얻음, Table of Materials 참조)를 희석 하십시오. </li><li> 2 μL 및 무료로 나누어지는<html> -80 ° C에서하십시오. </li></ol></li><li> 단일 가이드 RNA (SgRNA). <ol><li> 최소한의 잠재적 인 목표 외 활동을 허용하는 컴퓨터 설계 도구를 사용하여 원하는 두 표적 게놈 서열 (지침)을 확인하십시오. <ol><li> 유전자 녹아웃의 경우, 반대 방향으로 수백 개의 염기쌍 (bp) 떨어져있는 두 개의 가이드를 체계적으로 선택하고 관심 유전자의 시작 코돈을 포함시킵니다. 상 동성 직접 수리의 경우, 가능한 한 두 개의 중첩 가이드를 반대 방향으로 선택하십시오. 참고 : 예를 들어, 다음 안내서는 최근 TPM4.2 유전자의 첫 번째 엑손을 파괴하기 위해 성공적으로 공동 주입되었습니다 : 가이드 1 : 5 &#39;CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3&#39;; 가이드 2 : 5 &#39;CAGAACGATTGAGCTATGGC 3&#39; </li></ol></li><li> 표 1 에 설명 된대로 프라이머 세트를 주문하십시오. </li><li> 선형 DNA 템플릿을 합성합니다. <ol><li> 희석 px330Nuclease-free water에서 10 ng / μL까지 플라스미드를 교체하십시오. </li><li> 표 1 에 표시된대로 마스터 믹스를 준비합니다. 마지막에 폴리머 라제를 첨가하고 마스터 믹스를 얼음에 보관하십시오. </li><li> 이를 8 개의 PCR 튜브 (19 μL / 튜브)로 나누고 나누십시오. 튜브당 px330 1 μL를 추가하고 다음 조건에서 PCR을 실행하십시오 : 98 ° C에서 1 분; 98 ℃에서 10 초, 64 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 15 초의 40주기; 및 72 ℃에서 5 분 동안의 최종 신도. 4 ° C에서 유지. </li><li> PCR 정제 키트 (물질 표 참조), 다기관 및 진공 원 (빠른 처리를 위해)을 사용하여 PCR 생성물을 정제하십시오. 최대 진공 강도 ( 예 : 8 mbar)를가하십시오. <ol><li> PCR 샘플 1 볼륨에 결합 버퍼의 5 볼륨 (100 μL)을 추가하고 섞는다. </li><li> 원심 분리를 위해 2-mL 수집 튜브 (제공) 또는 진공 공정을위한 매니 폴드에 (제공 한) 실리카 멤브레인 스핀 컬럼을 놓습니다ing. DNA를 바인딩하려면 8 개의 시료를 모두 컬럼에 연속적으로 넣고 60 초 동안 진공 또는 12,000 xg로 원심 분리합니다. </li><li> 세척을 위해 0.75 mL의 세척 완충액 (완충액 PE)을 컬럼에 넣고 12,000 x g에서 60 초 동안 진공 또는 원심 분리한다. 잔류 에탄올을 제거하기 위해 12,000 xg에서 60 초 동안 컬럼을 원심 분리하십시오. </li><li> 컬럼을 깨끗한 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오. DNA를 용리시키기 위해 멤브레인의 중심에 30 μl의 nuclease가없는 물을 넣고 컬럼을 1 분 동안 방치 한 다음 12,000 g에서 60 초 동안 원심 분리하십시오. </li></ol></li><li> 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정하십시오. 일반적으로 농도는 100 ng / μL 이상이어야합니다. A260 / A280 비율이 1.8 ( 즉, 단백질에 의한 오염 없음)이고 A260 / A230 비율이 2.0 이상 ( 즉, 유기 용제에 의한 오염 없음)인지 점검하십시오. </li></ol></li><li> T7 RNA 합성 키트를 이용한 시험관 전사. <ol><li> 준비하기그는 표 1 에 표시된대로 마스터 믹스하고 thermocycler에서 37 ° C에서 3 시간 품어. nuclease-free 물 28 μL와 DNase I 2 μL를 넣고 37 ℃에서 15 분 더 incubate하십시오. </li></ol></li><li> 스핀 컬럼을 이용한 RNA 정제. <ol><li> 제공된 스핀 컬럼에 담긴 파우더를 nuclease-free microinjection buffer 650 μL에 녹여 모든 기포를 조심스럽게 제거합니다. 튜브에 뚜껑을 덮고 실온에서 5-15 분 동안 수화시킵니다. </li><li> 하단의 파란색 캡을 제거하고 컬럼을 2 mL 튜브에 넣으십시오. 750 XG 및 실온에서 2 분 동안 원심 분리기. 칼럼을 새로운 1.5-mL 튜브에 넣고 칼럼 벽을 건드리지 않고 50㎕의 RNA 용액을 가운데에 적가한다. 칼럼을 750 x g에서 2 분간 돌린다. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정하십시오 (한 반응의 일반적인 수율은 30 - 50 μg입니다). A260 / A280 비율이2.0 ( 즉, 단백질에 의한 오염이 없음)이고 A260 / A230 비는 2.0 이상 ( 즉, 유기 용제에 의한 오염 없음)이다. 사용하기 전까지 -80 ° C에서 sgRNA를 보관하십시오. </li><li> DNA 전기 영동을 위해 일상적으로 사용되는 1 % TAE 젤을 사용하여 RNA의 품질을 평가하십시오. 200-400 ng의 DNA 주형과 해당 sgRNA를 동시에 실행하십시오. RNA 밴드 (≈ 100 bp)는 DNA 밴드보다 약간 커야합니다 ( 그림 3A 참조 ). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 기증자 템플릿 <ol><li> 점 돌연변이 또는 50bp 이하의 작은 서열의 통합을 위해 상업적으로 합성 된 1 본쇄 올리고 뉴클레오티드 (ssOligos, 표 2 참조)를 주문하십시오. 상 동성 암은 전형적으로 60-90 bp이다. </li><li> 더 큰 삽입을 위해, 기증자 플라스미드를 주형으로 사용하십시오. 고전적인 클로닝 방법을 사용하여 적절한 플라스미드를 생성하거나상업적 출처. 참고 : 상 동성 암당 최소 800 bp를 권장합니다. 백본의 크기는 상 동성 직접 수선 (HDR)의 효율성에 영향을 미치지 않습니다. </li></ol> 4. 사출 성형 <ol><li> 유전자 녹아웃 실험을 위해 nuclease-free microinjection buffer를 사용하여 Cas9 mRNA를 50 ng / μL로 희석하고 sgRNA를 12.5 ng / μL (총 25 ng / μL)로 희석한다. 상 동성 직접 수리를 기반으로 게놈 편집 실험 200 ng / μL의 농도에서 기증자 템플릿 (ssOligo 또는 플라스미드)를 추가합니다. 참고 : 희석액은 재 계산기 18 과 같은 온라인 도구를 사용하여 쉽게 결정할 수 있습니다. </li><li> microinjection 세션 동안 얼음에 각 나누어지는 유지하고 나중에 폐기 (주입 믹스를 다시 동결하지 마십시오). </li></ol> 5. 음낭 정관 절제술 참고 : 두 종류의 정관 수술은 일반적으로 생쥐에서 수행됩니다 : 복부 및 음낭. 후자의덜 침략적이며 이전에 설명되었습니다 15 . <ol><li> 모든 스테인레스 스틸 수술기구를 고압 증기 멸균하십시오. </li><li> 체중계를 사용하여 마우스의 무게를 결정하고 주사 마비 (케타민 100 MG / kg, xylazine 10 MG / kg)와 intraperitoneal (IP) 주사하여 남성을 마취. </li><li> 발가락 핀치 반사의 손실을 모니터하고 마우스가 진정되면 발열 패드 위에 올려 놓습니다. </li><li> 클로르헥시딘과 70 % 에탄올과 같은 국소 소독제를 번갈아 사용하여 고환 주위의 피부를 소독합니다. </li><li> 고환을 음낭 안으로 밀어 넣고 메스로 피부 절개를하십시오. </li><li> testis, cauda epididymis 및 vas deferens를 시각화하십시오. </li><li> 집게로 유리관을 잡고, 잡고, 집게의 3mm를 제거하기 위해 집게 양쪽을 소성합니다. </li><li> 두 번째 testis에 동일한 절차를 수행하십시오. </li><li> 상처 클립으로 피부 절개 부를 닫고완전히 회복 될 때까지 마우스를 가까이서 누릅니다. </li></ol> 6. Superovulation (난자 기증자)과 Time-mating (의사 임신 한 여성) 주 : 적절한 수의 수정 된 난 모세포를 생성하고 재 이식을 위해 위탁 암컷을 막는 기술은 다른 곳에서 기술되어있다. <ol><li> 1 일 12 시경 약 5 IU의 임산부의 혈청 생식샘 자극 호르몬 (PMSG; 100 μL)을 10 명의 여성에게 투여한다. </li><li> 46 ~ 48 시간 후 (3 일 오전 11 시경) 5 IU의 인간 chorionic 성선 자극 호르몬 (hCG, 100 μL)을 투여합니다. </li><li> 하룻밤 사이에 한 마리의 수컷 남성과 암컷을 즉시 교배하십시오. </li></ol> 7. 전핵 (무작위 통합)과 세포질 (유전자 타겟팅) 주사 <ol><li> 이전에 설명한 바와 같이, 자궁 경부 탈구로 과식 배란 된 마우스를 뽑아 내고, 복부를 노출시키고, 난소와 난관에 접근하십시오. 오해입체 시야 (stereomicorscope)하에 적운 - 난 모세포 복합체 (cumulus-oocyte-complexes, COCs)를 수확합니다. 전통적인 방법 15에 따라 아미노산 (KSOMaa)가 보충 된 칼륨 심플 렉스 최적화 배지 1 방울에 넣으십시오. </li><li> 흡인기 입 조각을 사용하여 KSOMaa 매체의 방울에 hyaluronidase (10 밀리그램 / ML)의 approximally 1μL를 추가하여 oocytes을 정화하고 1 분에 30 초 동안 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에 접시를 놓습니다. </li><li> 흡인기 마우스 조각을 사용하여 KSOMaa 매체 4 신선한 방울과 Oocytes을 씻어 KSOMaa 매체의 최종 드롭에 전송 미네랄 오일 (약 2 ML)와 중첩. oocytes가 주사 준비가 될 때까지 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에 접시를 놓습니다. </li><li> 원핵 주입 (무작위 통합). <ol><li> 입체 현미경으로 알을 시각화하고 약 50 개의 알을 주입 챔버 (droM 배지에 미네랄 오일을 중층 한 것). </li><li> 사출 챔버를 거꾸로 현미경으로 옮기고 수정 핵 세포 (두 개의 보이는 전핵)에 주사 핵산을 타겟팅하는 몇 가지 피코 리터를 주입합니다 (전핵의 표적이 될 수 있음). 전핵의 부종을 관찰하여 성공적인 주사를 시각화하십시오. </li></ol></li><li> 세포질 주사 (유전자 표적화). <ol><li> 마우스 조각을 사용하여 5 μg / ML Cytochalasin B를 포함 KSOMaa의 방울로 약 50 계란을 전송하고 37에서 5 분 동안 품어 ° C / 5 % CO 2 배양기. </li><li> 마우스 피스를 사용하여 주입 챔버에 알을 옮긴다. </li><li> 가능한 경우 자동 마이크로 인젝터의 보정 압력을 사용하여 매우 낮은 압력 (50-100 hPa)에서 세포질에 주사 믹스를 몇 피코 리터 주입하십시오. </li><li> 주사 후, 난 모세포를 한 방울의 KSOMaa (마우스 피스를 사용)를 37 ° C / 5 % CO 2 인큐베이터에 보관하여 의사 임신 여성의 난관으로 재 주입합니다. </li></ol></li></ol> 8. 이식 <ol><li> 모든 스테인레스 스틸 수술기구를 고압 증기 멸균하십시오. </li><li> 체중계를 사용하여 마우스의 무게를 결정하고 주 사용 마취제 (ketamine 100 MG / kg, xylazine 10 MG / kg)와 intraperitoneal (IP) 주사하여 여성을 마취. </li><li> 발가락 핀치 반사의 손실을 모니터하고 마우스가 진정되면 발열 패드 위에 올려 놓습니다. </li><li> 여성 마우스의 지느러미 중간 선 주위에 모피의 넓은 부분을 자르십시오. </li><li> 클로르헥시딘 (chlorhexidine)과 70 % 에탄올 (ethanol)과 같은 국소 소독제를 번갈아 사용하여 노출 된 피부를 소독하십시오. </li><li> 전통적인 방법 15에 따라 생식 기관을 드러내십시오. 지느러미 정중선과 평행 한 1cm 길이의 피부 절개를 만들고 근육을 자르고 지방 패드를 잡습니다.th 포셉, 그럼 부드럽게 첨부 난관과 자궁이 명확하게 볼 때까지 난소를 꺼내. </li><li> 지방 패드를 혈관 클램프로 고정하십시오. 입체 현미경으로 난관을 시각화하고 한 쌍의 마이크로 가위를 사용하여 관의 몇 밀리미터 상류에있는 난관의 벽을 절개합니다. </li><li> 입체 현미경으로 마우스 피스에 연결된 유리 모세관에 25 개의 미세 주입 된 계란을 넣습니다 (모세 혈관의 내경은 약 120 μm 여야합니다). oviduct에 유리 모세관을 도입하고 공기 방울이 ampulla 내부에 보일 때까지 뺍니다. </li><li> 부드럽게 유리 모세관을 제거하고 복부로 생식 기관을 다시 놓습니다. 3-0 비 흡수성 외과 봉합으로 절개를 봉합 한 다음 상처 클립으로 닫습니다. 전체 복구가 완료 될 때까지 마우스를 면밀히 모니터링하십시오. </li></ol> 9. 유전자 타이핑 전략 / 시퀀싱 참고 : 게놈 분리관련 동물 윤리 규정에 따라 2-mm 꼬리 또는 귀 생검에서 얻은 DNA. <ol><li> 빠른 게놈 DNA 추출 (무작위 통합). <ol><li> 알칼리 용해 시약 (25 MM 수산화 나트륨 및 0.2 MM EDTA, 산도 = 12)의 100 μL에서 1 시간 95 ° C에서 조직 샘플 (~ 2 mm)을 Lyse. </li><li> 중화 시약 (40 mM Tris-HCl, pH = 5) 100 μL를 넣는다. </li><li> 12,000 g 및 4 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. </li></ol></li><li> 고품질 게놈 DNA 추출 (유전자 표적화). <ol><li> 꼬리 버퍼 (50 MM 트리스, 산도 = 8, 100 MM EDTA, 산도 = 8, 100 MM NaCl, 1 % SDS, 0.5 MG / ML proteinase K, 갓 추가)의 500 μL를 추가합니다. </li><li> 55 ° C에서 밤새 품어 둡니다. </li><li> 반전하여 5 분 동안 혼합하십시오 (vortex하지 마십시오). </li><li> 포화 NaCl (6 M) 250 μL를 첨가하고 반전시켜 5 분 동안 혼합한다 (vortex하지 않는다). </li><li> 12,000 xg 및 4 ° C에서 5-10 분 동안 스핀하고 상층 액을 새 튜브에 붓습니다. </li&gt; <li> 500 μl의 이소프로판올을 첨가하고 반전시켜 5 분 동안 혼합한다 (볼텍트하지 마라). </li><li> 12,000 xg 및 실온에서 10 분간 회전합니다. </li><li> 상층 액을 따라 내고 (펠릿은 보이지 않고 튜브에 달라 붙는다). </li><li> 70 % 에탄올 1 mL로 씻으십시오. </li><li> 12,000 xg 및 실온에서 5-10 분 동안 스핀. 흰색 펠렛이 더 이상 끈적 거리지 않고 분실 될 수 있으므로 조심스럽게 상등액을 제거하십시오. </li><li> 약 1 시간 동안 공기를 건조시킵니다. </li><li> TE 버퍼 (10 MM 트리스와 1 MM EDTA, 산도 = 8)의 400 μL를 추가합니다. </li><li> 2 시간 동안 55-60 ° C에서 DNA를 녹입니다. </li></ol></li><li> 프라이머 디자인. <ol><li> 전산 도구를 사용하여 최소 20bp의 프라이머를 디자인하십시오 19 . 참고 : 무작위 통합의 경우, 프라이머는 도입 유전자와 혼성화하여 200-800 bp의 분명한 단편을 생성해야합니다. 유전자 타겟팅의 경우 프라이머를 게놈 DNA와 혼성화되도록 디자인하여 뚜렷한 f잘라내는 사이트 주위에 백 백 bp를 분열. 큰 삽입의 경우, 프라이머는 도입 유전자 상에 놓일 수 있지만, 표적 통합의 확인은 프라이머 워킹 (primer walking) 또는 유사한 기술을 사용하여 수행되어야한다. </li></ol></li><li> PCR genotyping. <ol><li> 각 게놈 변형에 대해 새로운 PCR 프로토콜을 설계하고 경험적으로 테스트하십시오. 생성 된 단편의 길이와 각 쌍의 프라이머의 용융 온도 (Tm)를 고려하십시오. </li></ol></li><li> 시퀀싱. <ol><li> 유전자 타겟팅의 경우 PCR 제품을 생거 시퀀싱 서비스 제공 업체에 보내십시오. </li></ol></li></ol>

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저자는 University of New South Wales의 Mark Wainwright Analytical Center를 통해 마우스에서 학술적 전이 서비스를 제공합니다.

프로토콜 내 중요 단계 유전자 변형 마우스의 생성은 기술적으로 어려운 것으로 알려져 있습니다. 그러나 여기에 제시된 프로토콜은 기록적인 시간에 기술을 마스터하고 문제를 해결할 수 있도록 최적화되고 단순화 된 방법입니다. 이 기술을 성공적으로 완료하려면 두 단계가 필요합니다. 첫째, 염화 마그네슘 (MgCl 2 )없이 선형 DNA 템플릿 (sgRNA 합성 용)의 합성이 가능합니다. 그러나 포워드 프라이머의 부분 하이브 리다이 제이션이 종종 MgCl 2 가없는 경우에 방지되기 때문에 체계적으로 마스터 믹스에 MgCl 2 를 첨가하는 것이 좋습니다. 또한, 표적 게놈 서열이 기증자 템플레이트 (표적화 된 통합의 경우)의 어느 부분에도 존재하지 않는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 Cas9 핵산 분해 효소가 그것을 절단하여 HDR의 발생을 방지한다. 수정및 문제 해결 유 전적으로 변형 된 생쥐를 생성하기위한이 프로토콜이 수년에 걸쳐 최적화되고 간소화되었지만, 마이크로 인젝션을위한 양질의 난 모세포의 수율 및 수유 여성의 막힘 률과 관련된 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 백그라운드 인력의 선택은 마이크로 인젝션 세션으로 생존 한 생존 강아지의 수와 관련하여 매우 중요합니다. C57BL / 6은 마우스 모델의 질병에 가장 일반적으로 사용되는 배경입니다. 그러나 마이크로 인젝션에 대한 저항성면에서 덜 효율적인 배경 중 하나입니다 20 . 또한 암컷의 나이도 많은 수의 난 모세포를 생산하는데 결정적이다. 배경과 상관없이 5 ~ 8 주령의 마우스를 피하는 것이 좋습니다. 호르몬 자극에 대한 반응이 가장 적게 나타나는시기입니다 21 . 우리의 경험에 따르면 3 주에서 4 주 된 C57BL / 6 마우스는 여성 당 20-30 개의 알을 생산합니다. 중요한 것은새로운 기술 (ultra-superovulation이라고 함)이 암컷 당 최대 100 개의 난자를 생산했으며 최근에 microinjection 22 를위한 난 모세포를 생성하는데 사용되었다는 것에 주목하십시오. 그러나 마이크로 인젝션을위한 초 과배란의 사용은 일반적으로 많은 수의 난을 인위적으로 수정 ( 체외 수정)해야 할 필요성 때문에 방해 받고 있습니다. 이식에 적합한 암컷 수컷 암컷을 얻기 위해 수컷 암컷 마우스를 정관 한 수컷과 교배시킨다 (이 마우스의 배경은 중요하지 않다). 연결이 끊어진 사람의 수를 늘리려면 발정 단계와 적절한 여성 선택에 대한 면밀한 검사가 수행 될 수 있습니다 23 . 암컷주기의 동기화는 또한 교미하기 2 일 전에 암컷을 정관 한 남성에게 노출시킴으로써 유도 될 수 있습니다 (소위 &quot;Whitten 효과&quot;). 기술의 한계 점 돌연변이와 같은 아주 작은 게놈 변형은 비교적 쉽게 생성 할 수 있지만 식별하기는 어렵습니다. genotyping이 수행되면, PCR product는 Sanger sequencing에 의해 직접 sequencing됩니다. 그러나, Cas9가 오랫동안 활성 상태로 유지되고 다른 게놈 변형이 난 모세포의 첫 번째 분열 후에 발생할 수 있기 때문에, 마우스 난 모세포 내로의 CRISPR 성분의 직접 미세 주입은 종종 모자이크 동물을 생성시킨다. 이러한 교란 효과는 다양한 대립 유전자들 사이의 개별 돌연변이의 식별을 복잡하게 만들고 차세대 시퀀싱 (NGS)은 도전적인 판독에 도움이 될 수 있습니다. 민감한 기술, 예를 들어 테트라 프라이머ARMS-PCR 25 는 시퀀싱을 통해 창립자를 식별 한 후 식민지를 유전자형 분석하는 것을 도울 수 있습니다. 반대로 표적 방식으로 대량의 DNA를 삽입하는 것은 여전히 ​​어려운 일입니다. 외인성 DNA가 클수록 HDR의 효율은 낮아집니다. 결과적으로, 긴 ssOligos 기증자 (플라스미드 대신) 26 또는 HDR- 독립적 인 표적 통합 27 의 사용과 같은 새로운 전략이 현재 개발 중입니다. 프로토콜의 중요성 이 프로토콜은 실험실에서 네 가지 주요 단계 ( 즉, 형질 전환 유전자 또는 CRISPR 구성 요소의 준비, 마이크로 인젝션, 재 이식 및 유전자형 결정)가 최적화되고 테스트 및 검증되었으므로 현저한 진보를 보여줍니다. 형질 전환 유전자의 무작위 적 통합은 두 가지 주된 이유로 과발현 연구에 널리 사용됩니다. 첫째, avo이 잠재적 인 &quot;위치 효과&quot;는 Rosa26 28 및 Col1a 29 유전자좌와 같은 &quot;안전한 항구&quot;유전자좌에서 CRISPR을 이용한 도입 유전자의 표적 통합은 여전히 ​​HDR의 효율성이 낮기 때문에 악명이 높습니다. 이 문제를 극복하기위한 전략은 곧 발표 될 예정이지만, 무작위 적 통합은 지금까지보다 효율적으로 입증되었습니다. 게다가, 표현 수준이 다른 동일한 transgene을 과발현하는 다중 형질 전환 계통의 생성은 표현형을 역전시키는 치료 전략을 포함하는 연구에서 중요하다. 플라스미드 기반 형질 도입 유전자는 클로닝 (cloning)의 수단에 의해 생성되며, 특이 적 제한 효소를 사용하여 목적 단백질의 발현을 위해 필수 단편을 조립한다. 일반적으로, 형질 전환 유전자는 적어도 3 가지 요소로 구성된다 : 적절한 프로모터 (인핸서 영역이 때때로 첨가된다); 코딩인트론 부위가 있거나없는 서열 (cDNA); mRNA 발현을 안정화시키는 PolyA 테일 31 . 일단 조립되면, 형질 도입 유전자는 세균 복제 요소를 함유하는 플라스미드에 삽입되고 형질 전환 후 배양 물 내에서 확대된다 (전형적으로 열충격에 기초 함). 마이크로 인젝션을위한 도입 유전자의 정제 방법이 중요합니다. 이 연구는 젤 (기존의 크리스탈 바이올렛에 비해)과 낮은 변이원성 노출 (에 티듐 브로마이드와 비교)에 대한 관심의 단편을보다 정확하게 시각화하기 위해 차세대 (저독성) DNA 얼룩의 사용에 대해 설명합니다. 유전자 표적화를 위해 본원에 기술 된 비 - 클로닝 방법은 매우 빠르고, 5-6 시간 만에 여러 sgRNA의 합성을 가능하게한다. 4 단계만이 필요합니다 : 표적 서열의 동정, T7 프로모터 및 선택된 표적 서열을 포함하는 선형 DNA 주형의 합성, 합성in vitro transcription (IVT)에 의한 sgRNA, 스핀 컬럼을 사용한 sgRNA의 정제. CRISPR 마우스 게놈 편집 초기에, 마우스 배아에서 매우 제한적임이 밝혀졌지만 선택된 마우스가 운반하는 육종 체계에 의해 쉽게 희석 될 수 있음에도 불구하고 잠재적 인 오프 - 타겟 효과가 체계적으로 평가되었다 원하는 게놈 수정. 온 - 타겟 활동은 체외에서 체계적으로 사전 평가 되었으며 , 다른 가이드를 사용하고보다 활동적인 것을 선택 12 . 몇 가지 이유로 이러한 관행은 덜 일반적입니다. 먼저, 표적 활성은 CRISPR 코딩 플라스미드로 불멸화 마우스 세포주 (전형적으로 N2a 또는 NIH3T3)의 트랜 스펙 션을 사용하여 평가된다. 이것은 마우스 난 모세포에 CRISPR RNA 성분을 주입하는 것과는 다른 방법입니다. 따라서 체외에서 발견 된 결과가 항상 똑같이 번역되는 것은 아닙니다.oocytes. 또한, 높은 처리량 실험은 대부분의 가이드가 활성화되었음을 보여주었습니다 33 . 결과적으로, 표적 활동은 평가되지 않았고, 지금까지 마우스 난 모세포에서 활동을 보이지 않는 가이드의 증거는 없었다. 여기에 제시된 sgRNA 합성을위한 비 복제 방법과 함께 워크 플로우를 크게 간소화하고 능률화하며, 여러 활성 안내서를 하루 동안 원활하게 합성 할 수 있습니다. CRISPR은 기술이 수행되는 방식을 변경하는 혁신적인 &quot;파괴적인 기술&quot;로 간주됩니다. microinjection이 확립되었을 때, Brinster et al. 달성 할 수 있음에도 불구하고 세포질 형질 전환은 대부분 비효율적 인 것으로 나타났다. 결과적으로, 전핵 마이크로 주사는 생쥐에서 표적화 된 성공적인 CRISPR 유전자를 처음 시연 할 때까지 거의 30 년간 유일한 관행이었습니다. 이 연구는 세포질 미세 주입<html> 이온은 전 핵 전달과 비교하여 비슷하거나 우수한 결과를 나타낼 수 있습니다 12 . 분명히, CRISPR 성분은 전형적으로 RNA로 만들어 졌기 때문에, 세포질이 표적이 된 것이 분명하다. 그러나, 세포질에 주사했을 때조차도 기증자 템플릿은 HDR을 성공적으로 유도 할 수 있습니다. 템플릿의 높은 세포질 농도는 핵으로의 확산을 가능하게합니다. 또한, piezo-driven 세포질 microinjection 16 의 사용은 요구 사항이 아닙니다. Cytochalasin B와 같은 세포 골격 억제제와 함께 난 모세포가 잠복하면 난 모세포 34 , 35 의 생존율이 증가하여 피에조 충격 구동 시스템없이 세포질 주사를 수행하기에 충분합니다. 마찬가지로, KSOMaa와 같은 개선 된 배양 배지의 사용은 2- 세포 단계에서 막힘을 감소시키고 M16 배지와 비교하여 배아의 발생 능력을 향상시킨다xref &quot;&gt; 36. 한 세포 또는 두 세포 (밤새 재배) 배아는 난관으로 옮길 수 있습니다. 기존의 시술은 난소를 보호하는 버사를 찢을 필요가 있기 때문에 매우 침습적입니다. 또한 유리 모세 혈관이 infundibulum 15에 삽입되어야하기 때문에 기술적으로 어려움이 있습니다. 여기에 제시된 방법은 배우기가 훨씬 쉽고 출혈을 유발하지 않으며 난소의 완전성을 보존합니다. 구마모토 (熊 本) 대학에서 발전한 연구 결과에 기초하고 있습니다. 잠재적 인 창시자를 확인하려면 유전자형 전략과 시퀀싱 기술이 중요합니다. 무작위 적분을 위해, 게놈 DNA의 추출은 Truett et al. 38 . 이러한 빠른 추출 방법은 잠재적 인 창시자를 확인하기에 충분합니다. 왜냐하면 프라이머는 도입 유전자와 혼성화되도록 설계 되었기 때문입니다 (종종 integ여러 복사본으로 ated). 반대로, 유전자 표적화는 고도로 정제 된 게놈 DNA를 필요로하는데, 그 이유는 PCR 산물이 변형 된 게놈 영역을 포함하기 때문이다. 유전자 녹아웃의 경우, 단일 sgRNA를 주입하는 전통적인 방법은 작은 결실 (indels) 또는 삽입을 생성하여 궁극적으로 관심 유전자 12를 제거 합니다. 이러한 작은 변형은 확인하기가 어렵고 종종 이러한 돌연변이의 특성을 확인하기 위해 시간 소모적 인 리가아제에 의존하지 않는 복제 및 시퀀싱을 요구합니다. 이 프로토콜에서 우리는 CRISPR 멀티플렉싱을 활용하여 관심 유전자의 시작 코돈을 포함하는 두 개의 sgRNA를 체계적으로 동시에 주입하는 방법을 개발했습니다. 이것은 유전자 녹아웃의 가능성을 증가시킬뿐만 아니라, 미리 정의 된 크기 (100-300 bp)의 게놈 DNA 조각을 제거하여 간단한 PCR로 창시자를 쉽게 식별 할 수있게합니다. 주목할 것은 예상되는 게놈 e를 보유하지 않은 새끼들하나의 sgRNA가 활성화되었을 때 xcision은 여전히 ​​작은 frameshift 돌연변이를 분석 할 수있었습니다. 마찬가지로 유전자 편집의 경우 반대 방향으로 두 개의 겹치는 sgRNA를 체계적으로 동시에 주사하면 세포 수리 메커니즘이 두 가닥 중 하나를 우선적으로 사용하기 때문에 HDR의 효율을 높여야합니다 39 . 향후 응용 프로그램 현재의 프로토콜은 인간의 다양한 정교한 마우스 모델을 생성하는 과정을 간소화하고 간소화하기 위해 마우스 발생학 및 유전자 타겟팅 40 의 최신 개발을 활용합니다. 이 모델은 궁극적으로 치료 전략 개발에 도움이되는 pathomechanisms에 대한 이해를 개발하는 데 중추적 인 역할을합니다 2 . 유전자 표적화 또는 무작위 통합에 필요한 시약의 최적화 및 간소화는 광범위하고 쉽게 적용 할 수 있습니다쥐, 토끼와 같은 다른 포유 동물 종, 그리고 심지어는 소 같은 큰 동물까지.

척추 동물과 무척추 동물의 동물 모델은 알츠하이머 병과 같은 인간의 병태 생리학을 검사하는 도구가되어왔다. 그들은 질병 치료제를 찾고 궁극적으로 완치를위한 새로운 치료 전략을 개발할 수있는 귀중한 도구이기도합니다. 각 모델에는 본질적인 한계가 있지만, 전신 모델로 동물을 사용하는 것은 생물 의학 연구에 필수적입니다. 이것은 신진 대사와 복잡한 생리 환경이 조직 배양에서 완전히 모의 될 수 없기 때문입니다. 지금까지 마우스는 유전자 조작에 사용되는 가장 일반적인 포유류 종으로 남아 있기 때문에 몇 가지 장점이 있습니다. 질병과 관련된 생리적 과정과 유전자는 생쥐와 인간 사이에서 매우 잘 보존되어 있습니다. 마우스는 인간 게놈보다 일년 전에 (2002 년) 전체 유전체 염기 서열을 갖는 최초의 포유 동물이었다.나 (2003). 이 풍부한 유전자 정보 외에, 번식 능력이 좋고 발달주기가 빠르며 (수정으로부터 이유식까지 6 주) 적당한 크기입니다. 뚜렷한 외투 색상 (교차 전략에 필요)과 같은 생리적 인 지표와 결합 된 이러한 모든 장점은 마우스를 유전자 조작을위한 매력적인 모델로 만들었습니다. 주목할 만하게, 현대 유전학의 아주 이른 나이에서는, Gregor Mendel는 식물 3으로 움직이기 전에 쥐에 종사 시작했다. 유전자 전달 기술은 바이러스 성 전달을 이용하여 처음 생성 된 30 년 전의 첫 번째 형질 전환 마우스의 생성을 가져왔다. 그러나 연구자들은 곧 마우스 전이의 주요 과제 중 하나가 외인성 DNA의 운명을 제어 할 수 없다는 것을 깨달았습니다. 마우스 난 모세포로 형질 전환 유전자를 바이러스로 전달하면 게놈에 무작위로 여러 복제물이 통합되기 때문에,후속 형질 전환 계통을 확립하는 것이 제한적이었다. 이러한 한계 중 하나는 Gordon et al. microinjection 5 , 6 에 의한 최초의 형질 전환 마우스 라인을 생성했다. 이것은 재조합 DNA 기술의 시대를 열었고 마이크로 인젝션 세션의 결과에 영향을 미치는 매개 변수가 널리 연구되었습니다 7 . 마이크로 인젝션 (microinjection)은 형질 도입 유전자의 통합 부위에 대한 제어를 허용하지 않지만 (결과적으로 각 창 마우스에 대한 특이적인 발현 수준을 유도 함), 전 핵 마이크로 인젝션의 주요 이점은 컨 테이너 (concatemer)의 형성이다 ( 즉 , 게놈 통합 이전에 시리즈로 링크 됨) 5 . 이러한 특성은 수년 동안 관심있는 유전자를 과발현하는 수천 개의 트랜스 제닉 마우스 라인을 수립하는데 사용되었습니다. 그 이후로 유전자 변형,유기체 게놈의 인공 수정은 질병 발생시 단일 유전자의 역할을 확인하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 마리오 카 페치 (Mario Capecchi)가 생쥐의 단일 유전자를 성공적으로 파괴하여 유전자 표적화 시대를 열었을 때 마우스 게놈을 조작하는 데있어 중요한 성과를 달성했습니다. 그러나 ES 세포 배양의 어려움, 약간의 가변성의 키메라 (chimerism) 정도, 과정의 길이 ( 즉, 마우스를 얻는 데 최소 12-18 개월)를 비롯하여 ES 세포 기반 유전자 표적화에서 주요 단점이 빠르게 나타났다. . 최근에, ZFN, TALEN 및 CISPR / Cas9와 같은 신기술의 진보가 대체 방법으로 등장했다. 마이크에서 유전자 타겟팅 과정을 가속화한다.e 9 , 10 . 이 endonucleases는 microinjection에 의해 마우스 난 모세포에 쉽게 주입 될 수 있으며, 6 주 이내에 유전자 표적 마우스를 생성 할 수 있습니다. 게놈 편집을위한 CRISPR 사용에 관한 첫 번째 보고서 이후이 박테리아 적응 면역 시스템은 ZFN과 TALEN을 대체했으며 그 이유는 합성의 용이함과 동시에 여러 유전자좌를 표적으로하는 능력 ( &quot;멀티플렉싱 &quot;). CRISPR은 생쥐 12 번에서 유전자 타겟팅에 처음 사용되었으며 이후 식물에서 사람 13,14 로 무수한 종에 적용되었습니다. 현재까지 CRISPR 게놈 편집에 저항하는 단일 종에 대한보고는 없다. 유전자 변형 생쥐의 생성의 두 가지 주요 제한 단계는 난 모세포의 주입과 재 이식이 난 모세포를 가짜 임신 한 암컷으로 이 기술은 우리와 15 에 의해 기술되었지만 최근의 쥐 발생학 및 유전자 전달 기술의 기술적 향상은 유 전적으로 변형 된 쥐를 생성하는 과정에 혁명을 일으켰습니다. 이러한 개선 사항은 여기에 설명됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 0.1-2.5 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">4920000016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 2-20 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 20-200 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 100-1000 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular weight marker&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular weight marker&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td>HyperLadder 100 bp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93296</td>
			<td>10x - Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Safe gel stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PCR purification kit (Qiaquick)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Vacuum system (Manifold)</td>
			<td style="width:147px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free microinjection buffer&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-095-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrafree-MC microcentrifuge filter&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cas9 mRNA</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CAS9MRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">CRISPR expressing plasmid (px330)</td>
			<td style="width:147px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 Quick High Yield RNA kit</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">RNA purification spin columns (NucAway)</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ssOligos</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO STANDARD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Donor plasmid</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">GeneArt</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">KSOMaa embryo culture medium</td>
			<td>Zenith Biotech&#160;</td>
			<td>ZEKS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Mineral oil</td>
			<td>Zenith Biotech&#160;</td>
			<td>ZSCO-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">M2 Medium</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Mouthpiece</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glass microcapillaries</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Proteinase K</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3830.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Vessel clamp</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">18374-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Wound clips&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Clips applier&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cauterizer</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>18000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1691H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">5% CO2 incubator</td>
			<td style="width:147px;">MG Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Galaxy 14S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Electrophoresis set up</td>
			<td style="width:147px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1640300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">UV Transilluminator</td>
			<td style="width:147px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1708110EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>6334000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscopic microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">2x Micromanipulators</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5188000.012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Oocytes manipulator</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5176000.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microinjector (Femtojet)</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5247000.013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Mice C57BL/6J strain</td>
			<td style="width:147px;">Australian BioResources</td>
			<td>C57BL/6JAusb&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes

유전자 조작 마우스의 사용은 생체 내 및 병리학 적 생체 내 과정 모두에 대한 연구에 크게 기여했다. 수정 된 난 모세포 내로의 DNA 발현 구조물의 전 핵 주입은 과발현을위한 형질 전환 쥐를 생성하는 가장 보편적 인 기술로 남아있다. 유전자 표적화를위한 CRISPR 기술이 도입됨에 따라 수정 된 난 모세포에 전핵을 주입하여 knockout과 knockin 마우스를 생성 할 수있게되었다. 이 연구는 유전자 타겟팅을위한 사출 용 DNA의 준비와 CRISPR 가이드의 생성을 기술하고 있으며 특히 품질 관리에 중점을두고 있습니다. 잠재적 인 창시자를 확인하는 데 필요한 유전형 분석 절차가 중요합니다. CRISPR의 &quot;멀티플렉싱&quot;기능을 활용하는 혁신적인 유전자형 전략이 여기에 제시됩니다. 수술 절차도 요약되어 있습니다. 함께, 프로토콜의 단계는 세대의 생성을 허용합니다면역학, 신경 과학, 암, 생리학, 발달 및 기타를 포함한 수많은 연구 분야에서 마우스 식민지를 확립하는 데 사용됩니다.

아래에서, 무작위 통합 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅의 경우 microinjection에 대한 워크 플로우가 설명됩니다 ( 그림 1 ). <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> 그림 1 : 유전자 조작 마우스의 일반적인 워크 플로. 무작위 적으로 통합하기 위해 정화 된 형질 도입 유전자는 배란 된 수양 암컷으로 난 피가 전달되기 전에 수정 된 난 모세포의 전핵으로 주입된다. 자손 분석은 빠른 게놈 DNA 추출 후 PCR로 수행됩니다. CRISPR 유전자 표적화를 위해, sgRNA는 여기에 기술 된 비 - 클로닝 방법을 사용하여 합성되고, 2 개의 가이드가 수정 된 난 모세포의 세포질에 (Cas9 mRNA와 함께) 함께 주입된다. 이 전략은 후속 PCR 기반의 자손 분석에 사용되며, 고도로 정제 된 g에노믹 DNA. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55765/55765fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 난 모세포의 미세 주입과 주입 된 난자의 이식은 기술적 인 기술과 훈련을 필요로하는 두 가지 주요 제한 단계이지만, 유전자 변형 마우스를 성공적으로 생산하기 위해서는 주사 혼합의 품질이 가장 중요합니다. Transgene 정제 ( 그림 2A ) 및 sgRNA 합성 ( 그림 3A )의 품질은 분석 아가로 오스 겔에 대해 체계적으로 평가해야합니다. 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정 할 때 혼합물의 잠재적 오염도를 확인해야합니다. 흡수의 다른 값은 용액의 순도에 직접 의존하기 때문입니다 (1.2.3, 2.2.3.5 및 2.2.5.3 단계 참조). 그림 2B )과 유전자 타겟팅 ( 그림 3B ) 모두를위한 마이크로 인젝션 세션의 일반적인 판독을 설명합니다. DNA 추출 프로토콜은 실험 유형에 따라 다릅니다. 후속 PCR은 도입 유전자 또는 게놈 DNA에 각각 하이브리드 화하는 프라이머에 의존한다. 여기에 제시된 전략은 유전자 조작 마우스를 생산하는 데 필요한 각 단계의 문제 해결과 간소화를 용이하게합니다. microinjection 세션의 양적 결과가 실험자의 경험에 따라 달라 지지만 프로토콜의 각 단계가 최적화되면, 얻은 형질 전환 새끼의 비율은 일반적으로 무작위 적분에 대해 10-25 %에 도달해야합니다배급 ( 그림 2B) (출생 15 명 중 4 명 = 26.6 %). 다소 낮은 &quot;효율성&quot;은 마우스 게놈을 편집하는 CRISPR 구성 요소의 신뢰할 수있는 능력과 대조됩니다. 실제로, 유전자 표적화를 위해 CRISPR을 사용할 때 생성 된 창립자의 수는 일반적으로 더 높으며 범위는 25-100 %입니다 ( 그림 3B 참조 , 13 명의 새끼 중 3 명 = 23 %). CRISPR을 사용하여 편집 할 때 성공적으로 동형 접합 인 전체 자손을 얻는 것은 드문 일이 아닙니다. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig2.jpg" /> 그림 2 : 과발현을위한 트랜스 제닉 마우스의 성공적인 생산을위한 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략. ( A ) 플라스미드를 PvuI 및 NotI로 1 시간 동안 분해한다. 완전한 소화 및 정확한 크기 ( 즉, 도입 유전자 = 7,338 bp, 백본 = 1,440+ 896 bp)를 분석 겔 (1)에서 검사한다. 분 취용 겔 (2)로부터 여러 가지 분해 산물을 추출하면 도입 유전자 농도가 증가합니다. UV에 장시간 노출되는 것을 피해야하며 UV 투과 조명기 대신 청색광을 사용하는 것이 좋습니다. (B) 유전자 타이핑 전략 (Genotyping strategy) (1) : 프라이머는 도입 유전자에 놓여 야하며 200 - 800 bp의 단편을 생성하도록 설계되어야한다. genotyping이 수행 될 때 (2), 양성 대조군 ( 즉, microinjection에 사용되는 주사 혼합)과 음성 대조군 ( 즉, WT 마우스의 게놈 DNA)을 포함하는 것이 좋습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55765/55765fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig3.jpg" /> 그림 3 : 품질 관리 및 Genotyping StraGene-targeted (KO) 마우스의 성공적인 생산을위한 ( A ) 시험 관내 전사에 의해 생성 된 sgRNA의 품질은 DNA 템플릿과 생성 된 RNA를 각 가이드에 대해 병렬로 실행하여 평가합니다. RNA의 크기는 DNA보다 약간 크다. 품질이 만족 스럽다면 ( 즉, 스미어 밴드가없는 경우) 농도가 측정됩니다. ( B ) (1) 엑손 1의 시작 코돈을 포함하는 두 개의 가이드 (반대 방향)의 설계. 프라이머는 결국 두 가이드에 의해 절제 된 영역 밖의 게놈 DNA와 하이브리드 화하도록 선택된다. 전형적으로,이 전략은 PCR (2)을 사용하여 이형 접합체 (# 5 및 # 9) 및 동형 접합체 (# 3) KO 설립자를 직접 확인할 수있게한다. 동형 접합 동물의 PCR 생성물에는 WT 밴드가 표시되지 않습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55765/55765fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <tableborder = &quot;1&quot;fo : keep-together.within-page = &quot;1&quot;fo : keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> 반응 </td><td> 구성 요소 </td><td> 음량 </td><td> 노트 </td></tr><tr><td rowspan="7"> 선형 DNA 주형의 합성 (2.5) </td><td> Nuclease free water </td><td> 97.2 μL </td><td></td></tr><tr><td> 5x HF 버퍼 </td><td> 36 μL </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 9 μL </td><td></td></tr><tr><td> 10 mM dNTPs </td><td> 9 μL </td><td></td></tr><tr><td> 10 μM fwd 프라이머 </td><td> 9 μL </td><td> 5&#39;TTAATACGACTCACTATAGN 20 gttttagagctagaaatagcaagttaaaata aggctagtc 3 &#39; </td></tr><tr><td> 10 μM rev 프라이머 </td><td> 9 μL </td><td> 5 &#39;AAAAGCACCGACTCGGTGCC 3&#39; </td></tr><tr><td> Proof-reading polymerase </td><td> 1.8 μL </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> T7 RNA 합성 키트를 이용한 IVT (2.6) </td><td> Nuclease free water </td><td> X μL </td><td> 총 부피 20 μL까지 </td></tr><tr><td> NTP 버퍼 믹스 </td><td> 10 μL </td><td></td></tr><tr><td> 템플릿 DNA </td><td> 약 300 ng </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA 중합 효소 </td><td> 2 μL </td><td></td></tr></tbody></table> 도표 1 :이 학문에서 사용 된 다른 주된 혼합의 구성. 선형 DNA 주형의 합성 : T7 프로모터 최소 서열 (TTAATACGACTCACTATAG)은 20-bp 서열 (가이드; CRISPR 디자인 툴을 사용하여 확인 된 N20) 및 발현 벡터 (gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc)에 상보적인 서열의 상류에있다. 체외에서전사 (IVT) : DNA 템플레이트의 농도에 따라 최종 부피는 nuclease-free water로 20 μL로 조정해야합니다.

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Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

20.4K 조회수.  University of New South Wales.  마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다. 

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Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

연구

발생학

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. Cardiac differentiation from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is modulated by defined signaling pathways that are essential for embryonic heart development. Numerous cardiac differentiation methods on 2-D and 3-D platforms have been developed with various efficiencies and cardiomyocyte yield. This has puzzled investigators outside the field as the variety of these methods can be difficult to follow. Here we present a comprehensive protocol that elaborates robust generation and expansion of patient-specific cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). We first describe a high-efficiency iPSC reprogramming protocol from a patient&#39;s blood sample using non-integration Sendai virus vectors. We then detail a small molecule-mediated monolayer differentiation method that can robustly produce beating cardiomyocytes from most human iPSC lines. In addition, a scalable cardiomyocyte expansion protocol is introduced using a small molecule (CHIR99021) that could rapidly expand patient-derived cardiomyocytes for industrial- and clinical-grade applications. At the end, detailed protocols for molecular identification and electrophysiological characterization of these iPSC-CMs are depicted. We expect this protocol to be pragmatic for beginners with limited knowledge on cardiovascular development and stem cell biology.

Here, we present a protocol to robustly generate and expand human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...