M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer's Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible. &#8195;

Declaración de ética de la investigación: Todos los experimentos con animales que se detallan en este documento fueron aprobados por la Universidad del Sur de California Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) y lleva a cabo estrictamente de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices y recomendaciones de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Internacional de los Animales. 1. Aislamiento del roedor del cerebro y la preparación para la inmunotinción DÍA 1: <ol><li> Coloque ratas TgF344-AD de edades (de 14 meses de edad) o APP / PS1 ratones (12 meses de edad) bajo anestesia con isoflurano profunda continua (4%). Evaluar la profundidad de la anestesia por pellizco del dedo del pie y la ausencia de reflejo de retirada. </li><li> Corte a través de ambos lados de la caja torácica y levantar para exponer el corazón. Insertar una aguja de 23 G en el ventrículo izquierdo del corazón y hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha. Continúe con el desangramiento por perfusión transcardial con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo(PBS) usando una bomba peristáltica (30 ml para los ratones; 150-200 ml para ratas). </li><li> Se practica una incisión en la línea media caudal en la piel y mover la piel y el músculo a un lado. Corte a través de la parte superior del cráneo a lo largo de la línea media y entre los ojos. Retire las placas óseas y aislar todo el cerebro del cráneo. </li><li> Coloque el cerebro en una matriz de cerebro de roedores coronal y cortar en cuartos. Incubar cuartas partes posteriores O / N (16 h) en fijador paraformaldehído (4% PFA en PBS) a 4 ° C. Lavar 3x en PBS y, a continuación, transferir a un 70% de etanol. Precaución: PFA es tóxico y debe ser manejado bajo una campana química con el equipo de protección personal adecuado. </li></ol> DIA 2: <ol start="5"><li> Coloque cuartas partes del cerebro en casetes de incrustación y progresivamente deshidratar tejido en sucesivamente más concentradas baños de etanol 1 h (70%, 80%, 95% y 100% x3). </li><li> etanol Borrar en el tejido con tres sucesivos baños de xileno 100% (1 h cada una). Precaución: El xileno es tóxico y shOuld ser manejado bajo una campana química con el equipo de protección personal adecuado. </li><li> Insertar el tejido en bloques de parafina después de dos cuartos de baño fundido de cera de parafina (56 a 58 ° C, 90 min cada uno). </li></ol> DÍA 3: <ol start="8"><li> Cortar secciones de 10 micras de espesor de cerebros incluidos en parafina utilizando un microtomo. secciones se sumergen en un baño de agua (50 ° C durante 1 min) y se aplican a portaobjetos de microscopio. Deja las diapositivas para O / N se seque, lo que garantiza la adhesión del tejido a la diapositiva. </li></ol> 2. La inmunotinción Nota: Las diferentes combinaciones de anticuerpos pueden ser utilizados para el procedimiento de tinción se describe a continuación. Cócteles de anticuerpos compatibles con el tejido cerebral de ratas y ratones se enumeran en la Tabla 1. DÍA 4: <ol><li> Desparafinar secciones del cerebro usando 2x 100% baños de xileno (12 min cada uno). </li><li> Rehidratar secciones de cerebro en baños sucesivos de etanol - 100% durante 10 min, 95% para 5 min, 80% para 10 min y, finalmente, 70% para 15 min - followed por lavados con PBS 3x [5 min a temperatura ambiente, con agitación ligera]. Mientras tanto, el calor solución de recuperación de antígenos a 95 - 97ºC en una placa caliente con agitación barra magnética. </li><li> Incubar las secciones del cerebro en la solución de recuperación de antígeno a 95 - 97ºC durante 30 min. A continuación, lavar 3 veces en PBS (5 min a temperatura ambiente, con agitación ligera). </li><li> Rápidamente secar los portaobjetos utilizando limpiaparabrisas tarea delicada para evitar la desecación del tejido, y trazar una barrera hidrofóbica alrededor de la zona de tejido con una pluma barrera hidrofóbica. Llene la región de tejido rodeada con tampón de bloqueo [PBS que contiene 0,3% de Triton X-100 y 10% normal burro suero (NDS)], y se incuba a TA durante 1 h en una cámara humidificada. </li><li> Sustituir el tampón Iba1 anticuerpo primario (diluido en tampón de bloqueo) para etiquetar los fagocitos mononucleares, y se incuba O / N a 4 ° C en una cámara humidificada de bloqueo. Para los hosts de anticuerpos y diluciones de trabajo, véase la Tabla 1 y la Tabla de Materiales. </li></ol> DÍA 5: <ol start="6"><li> Enjuagueanticuerpo primario con baños 3x PBS (5 min a temperatura ambiente con agitación ligera). Incubar con anticuerpo fluorescente secundario (conjugado con un fluoróforo de emisión 594 nm) durante 1 h (en tampón de bloqueo a temperatura ambiente en la oscuridad) seguido de baños 3x PBS (5 min a temperatura ambiente con agitación la luz). En este momento, mantener las secciones en la oscuridad para evitar la decoloración de la señal fluorescente. </li></ol> DÍA 6 - 7: <ol start="7"><li> Repita los pasos 2.5 y 2.6 con CD68 (los cerebros de ratas) o LÁMPARA1 (tejido de ratón) de anticuerpos y anticuerpos secundarios apropiados (junto con un fluoróforo emisión de 488 nm) para etiquetar fagolisosomas. </li></ol> DÍA 7 - 8: <ol start="8"><li> Repita los pasos 2.5 y 2.6 con OC (tejido de rata) o 4G8 (cerebros de ratón) de anticuerpos y anticuerpos secundarios apropiados (acoplado a un fluoróforo 647 nm) para marcar los depósitos de Aß. NOTA: Como alternativa, el anticuerpo 6E10 puede ser utilizado con éxito tanto en el ratón y la rata de tejido. Para las combinaciones de anticuerpos adecuados, consulte la Tabla de Materiales </strong&gt;. </li><li> Permitir a las secciones completamente seca O / N a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, la cubierta especímenes con una hoja de cubierta sellada por medio de montaje de fluorescencia DAPI. </li></ol> 3. Adquisición de Gran Z-pila confocal Conjuntos de datos Nota: Este protocolo requiere un escaneo láser confocal microscopio totalmente automatizado equipado con un objetivo de 60X y 405 nm, 488 nm, 594 nm, y 647 nm láser. Todo el equipo es controlado por un software de imagen y control del láser ordenador. Antes de comenzar el protocolo de imagen, encendido de la computadora, lámpara de epifluorescencia, microscopio, láser y cámara. DÍA 9: <ol><li> Seleccione el objetivo del microscopio 60X. Añadir el aceite de inmersión de la lente, y colocar la muestra en el soporte del microscopio de diapositivas. Elevar el objetivo hasta que el aceite se pone en contacto con la corredera. Ajustar el plano focal para localizar las placas de amiloide en el hipocampo o la corteza cerebral y requiere una iluminación de epifluorescencia a través de los oculares. </li><li> Adquirir im confocaledades de los fagocitos mononucleares activados que rodean los depósitos de amiloide en el hipocampo o la corteza de los roedores por microscopía confocal (ampliación 60X, pasos pila Z: 0,25 m &lt;z &lt;0,40 m, el número de pasos 25 &lt;n &lt;35). </li></ol> 4. q3DISM Nota: Con el fin de producir resultados significativos, se sugiere el análisis de un mínimo de 3 imágenes por animal / región de interés. Para cada imagen, la abundancia de células a analizar puede variar dependiendo de los paradigmas experimentales. En los resultados representativos mostrados en este informe, analizamos 3 células / condición (por ejemplo, los fagocitos mononucleares distantes o asociados con placas; véanse las Figuras 1C - D y 2C - D). DÍA 10: <ol><li> Analizar conjuntos de datos confocal con colocalización de procesamiento de imágenes 3D científica y análisis de software (coloc) Módulo de proximidad espacial de Iba1 / CD68 (tejido de rata) o Iba1 / LÁMPARA1 (tejido de ratón) tinción en todos los planos z simultáneamente.Crear Iba + / CD68 + o canales Iba + / + LÁMPARA1 colocalización que corresponden a fagolisosomas dentro de los fagocitos mononucleares activados. <ol><li> Seleccionar TRITC para el canal A (correspondiente a la tinción Iba1 junto con 594 fluoróforo nm) y FITC para el canal B (correspondiente a CD68 o tinción LAMP1 junto con 488 fluoróforo nm). En la parte derecha de la ventana del software de &#39;modo de chequeo,&#39; &#39;umbral&#39;, seleccionar y de &#39;intensidades Coloc,&#39; Seleccionar &#39;&#39; canales de origen. </li><li> Haga clic en &#39;Editar&#39; para seleccionar &#39;de color coloc&#39; en el lado derecho de la ventana del software. </li><li> Para cada canal de forma independiente, ajustar los umbrales para incluir y excluir a una tinción específica fondo señales / no específicos. Una vez ajustado, no cambie umbrales entre imágenes para garantizar un análisis imparcial. Los voxels (pixels colocalized de todos los z-pilas) aparecerán en el color seleccionado en el paso 4.1.2 en todos los z-pilas SIMultaneously. </li><li> Haga clic en &quot;construir el canal coloc &#39;. El canal de colocalización creado aparecerá en la ventana de ajuste de visualización. </li><li> Haga clic en el canal coloc para abrir estadísticas del canal. El &#39;% del volumen / material A por encima del umbral colocalizó&#39; representa el% de señal Iba1 (voxels correspondientes al fluoróforo 594 nm) colocalized con LÁMPARA1 o señal de CD68 (voxels correspondientes al fluoróforo 488 nm). Más simplemente, esto es el volumen ocupado por los monocitos fagolisosomas (ver las figuras 1C y 2C). NOTA: &#39;% del volumen / material B por encima del umbral colocalizó&#39; corresponde al% de la señal LÁMPARA1 o CD68 colocalized con Iba1. Esto debería ser cercana al 100%, como fagolisosomas son estructuras intracelulares. Los valores se basan en la relación entre la señal de todos los z-pilas por encima del umbral colocalized. </li></ol></li><li> Con el módulo de coloc, analizar el canal coloc creado en el paso 4.1 para la proximidad espacial con OC (ti rataN ú mero) o 4G8 (tejido de ratón) señales de Aß. Esto permite la cuantificación de Aß encapsulado dentro de fagolisosomas. <ol><li> Seleccione el canal Un conjunto de datos coloc (correspondiente a la Iba1 / CD68 o canal Iba1 / LAMP1 coloc creado en el paso 4.1) y Cy5 para el canal B (correspondiente a OC o tinción 4G8 junto con 647 fluoróforo nm). </li><li> Construir un canal coloc como se describe en los pasos 4.1.2 a 4.1.5. </li><li> Haga clic en el canal coloc para abrir estadísticas del canal. El &quot;% de volumen / material A por encima del umbral colocalized &#39;representa el% de Iba1 / LAMP1 o Iba1 / CD68 (voxels correspondiente al canal coloc construido en el paso 4.1.5.) Colocalized con OC o señal 4G8 (voxels que corresponde a la 647 nm fluoróforo). Este es el volumen ocupado por fagolisosómico beta (véanse las figuras 1D y 2D). NOTA: &#39;% del volumen / material B por encima del umbral colocalizó&#39; se corresponde con la señal de Aß% de total de colocalized con fagolisosomas.Esto se puede utilizar para evaluar la fracción del total de depósitos de Aß encapsulados dentro fagolisosomas (no se muestra en los presentes resultados representativos). </li></ol></li><li> Utilice el módulo de superar a reconstruir las pilas de imágenes confocal y generar modelos 3D de Aß encapsulados dentro fagolisosomas monocitos. <ol><li> En la ventana de &quot;ajuste de visualización &#39;, seleccione TRITC (tinción para mostrar solamente Iba1). En la ventana &#39;&#39; propiedades del volumen, haga clic en &quot;añadir nueva superficie &#39;. </li><li> En el paso &#39;1/5 algoritmo&#39;, en &#39;Configuración&#39;, seleccione &#39;superficie&#39;. Además, en &#39;Color&#39;, seleccionar el tipo de color en la paleta o RGB y ajustar la transparencia (rojo se fija en el 60% de transparencia en las figuras 1B y 2B). casilla de verificación &quot;Seleccionar una región de interés&quot;. Haga clic en Siguiente. </li><li> En el Paso &#39;2/5 región de interés,&#39; dibujar una ventana alrededor de la célula de interés mediante el ajuste de X, Y y Z coordenadas (ver cuadros blancos en las figuras 1A </strong&gt; y 2A). Haga clic en Siguiente. </li><li> En el Paso &#39;3/5 canal de origen&#39;, seleccione el canal de origen TRITC. Marque la casilla &#39;suave&#39;, y el nivel de detalle superficie de 0,4 micras. Para &#39;umbral&#39;, seleccione la intensidad absoluta. Haga clic en Siguiente. </li><li> En el Paso &#39;4/5 umbral,&#39; ajustar el umbral de modo que el volumen creado superpone a la perfección con la señal del canal TRITC. Haga clic en Siguiente. </li><li> En el Paso &#39;5/5 clasifican superficies,&#39; en la sección &#39;tipo de filtro,&#39; seleccionar objetos en función de su tamaño para ser incluidos o excluidos de los volúmenes a ser creados. Haga clic en Finalizar, ejecutar todos los pasos de creación, y salir del asistente. </li><li> Repetir los pasos 4.3.1 a 4.3.6 para crear una superficie 3D para el canal de FITC (LAMP1 + o CD68 + fagolisosomas). </li><li> Repita los pasos 4.3.1 a 4.3.6 para crear una superficie 3D para el canal de Cy5 (4G8 + depósitos de Aß OC + o). </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+amyloid+plaques+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).</li><li>Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -. A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-Microglia+Cross+Talk+through+Complement+Activation+Modulates+Amyloid+Pathology+in+Mouse+Models+of+Alzheimer's+Disease.">Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease.</a> J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).</li><li>Novotny, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Synthetic+A&#946;+to+In+Vivo+Active+Seeds+and+Amyloid+Plaque+Formation+in+a+Hippocampal+Slice+Culture+Model.">Conversion of Synthetic A&#946; to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model.</a> J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).</li><li>Tartaro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fluorescence-based+in+vivo+phagocytosis+assay+to+measure+mononuclear+phagocyte+system+function+in+the+rat.">Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat.</a> J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo que se describe en este informe para una verdadera cuantificación 3D de Aß fagocitosis in vivo por los fagocitos mononucleares se basa en el etiquetado específico de los compartimentos celulares y subcelulares, así como los depósitos de Aß. Específicamente, usamos Iba1 (ionizada-calcio Encuadernación adaptador molécula 1), una proteína que está implicada en ruffling membrana y la fagocitosis tras la activación de células 18, 19, para teñir los fagocitos mononucleares cerebrales. Mientras que las células Iba1 + son generalmente considerados como microglia cerebro residente, sigue siendo posible que periféricamente infiltrantes fagocitos mononucleares comprenden un subconjunto de células inmunomarcadas. Fagolisosomas intracelulares se revelaron con anticuerpos que reconocen los miembros de la familia lisosomal / endosomal-glicoproteína asociada a la membrana (LAMP): LÁMPARA1 20 o 21 CD68. Esta última se localiza principalmente a los lisosomas y endosomas, con una fracción más pequeña de circulación a la s célulasTu cara. LÁMPARA1 anticuerpos CD68 y ambos se han utilizado con éxito en el tejido de la rata y el ratón, y la decisión sobre cuál utilizar depende principalmente de la cantidad de otros anticuerpos utilizados para la co-tinción (véase el cuadro 1). Es importante tener en cuenta que diversos anticuerpos se pueden utilizar para la detección de Aß. En tejido de ratón, 4G8 (que reconoce los residuos de aminoácidos humanos y de ratón 17-24 de Aß péptido 22, Figura 1) y 6E10 (que reconoce los residuos de aminoácidos humana 1-17 23, datos no mostrados) se han utilizado con éxito, lo que permite la detección y cuantificación de contenido Aß en LAMP1 + o CD68 + fagolisosomas presentes en fagocitos mononucleares Iba1 +. El uso de nuestra metodología q3DISM, se observó aumento de la carga de Aß en las células Iba1 + asociados con la reducción global de la carga de Aß en el cerebro de los APPPS1 / IL-10 - / - ratones 16, mientras que otros mostraron disminución de la captación de Aß en Iba1 + &lt;<html> / sup&gt; células acompañados por un mayor volumen de carga y la placa de Aß en el cerebro de los ratones de trapo-5xfAD 24. Estos resultados sugieren que el fenómeno observado es una &quot;instantánea&quot; de la fagocitosis activa Aß, aunque nuestra metodología no se puede usar para predecir si el material fagocitado se digiere y se aclaró de manera eficiente. En el tejido de rata, se detectó depósitos de Aß utilizando OC (reconociendo solubles Aß 42 oligómeros / fibrillas 25,26, Figura 2) o 6E10 17 (no mostrado). Curiosamente, muy pocas fibrillas OC + estaban presentes en fagolisosomas monocitos en los cerebros de ratas TgF344-AD. Este fenómeno ha sido previamente informado en APP23 ratones transgénicos utilizando tinción inmuno y la reconstrucción 3D 27. Nota: una variedad de anticuerpos para la detección de diferentes especies / confórmeros Aß están disponibles y, potencialmente, puede ser probado y emplearse a discreción del usuario. nt &quot;&gt; Nuestra técnica q3DISM ha sido adoptado por nosotros y otros para cuantificar Aß fagocitosis en el contexto de AD 16,24,28. Sin embargo, el método puede adaptarse para evaluar prácticamente cualquier forma de la fagocitosis. También se puede aplicar a los tejidos aparte del cerebro, y para otras especies animales (incluidos los humanos). los procedimientos descritos en este protocolo se basan en la inmunotinción estándar, que se detectó con fluorescencia y fotografiado con un microscopio confocal. en este informe, hemos utilizado tejido incluido en parafina de acuerdo con las directrices proporcionada por los fabricantes de anticuerpos. Si se desea, el presente protocolo podría también ser optimizado para tejido fresco (incrustado en 2% de agarosa en PBS). el protocolo también se puede optimizar para detectar la fagocitosis de coaggregating proteínas. Esto se hace posible mediante la tinción y la adquisición imágenes compuestas de más de 4 colores fluorescentes 29. En este caso, la creación de la primera canal de colocalización (monocitos / fagolisosoma) sería seguido por la creaciónde un segundo canal de colocalización (agregado de proteínas 1 / co-agregados de proteínas 2). Entonces, los dos canales se utilizan para el análisis y modelado 3D. La técnica q3DISM está limitada principalmente por la especificidad y sensibilidad de la inmunotinción, la calidad de los anticuerpos, y el enfoque de colocalización. Este procedimiento de múltiples etapas tiene algunos peligros potenciales que pueden afectar la calidad de la tinción y, por lo tanto, la cuantificación de la captación de 3D Aß. El primer paso crítico del procedimiento es el aislamiento de cerebros de roedores. De hecho, la manipulación de tejidos cuidadosa es fundamental para evitar daños en el cerebro y para garantizar que las estructuras cerebrales permanecen intactas cuando seccionada. En segundo lugar, el tiempo de fijación del tejido es muy importante, ya que el exceso de fijación (más de 16 horas en PFA al 4%) de los límites de detección fagolisosomas subcelulares y contenido de Aß. Es importante destacar que, la tinción sucesiva de 1) monocitos, 2) fagolisosomas y 3) Aß es crítico para el éxito del método. Es Essential de usar los anticuerpos no consecutively- concomitantemente. Además, la adquisición de las imágenes confocal z-pila es de suma importancia, ya que el modelado 3D de células, fagolisosomas y péptido Aß así como colocalización análisis depende de la calidad de las imágenes de las estructuras celulares y subcelulares a través del espesor de la sección de tejido. Por último, el ajuste de los umbrales en el software es crucial para el modelado 3D y para el análisis de colocalización. De hecho, los umbrales de los diferentes canales deben ser elegidos cuidadosamente, ya que determinarán qué señal se incluyó (específica) o excluidos (fondo) del análisis. También es fundamental que los umbrales elegidos se mantienen consistentes entre muestras en el caso de la comparación de diferentes animales / especímenes. Hasta el momento, inmunohistotinción clásica, la resonancia y la tomografía por emisión de positrones magnética han sido los métodos de imagen de elección para la visualización in vivo y cuantificación de Aß30. Aunque muy útil para la cuantificación a gran escala de la carga de amiloide en los cerebros de roedores o pacientes con AD, estos métodos son ineficaces para la visualización de intracelular Aß. Otras técnicas mediante microscopía confocal, la espectroscopia de fluorescencia y citometría de flujo existen y se han utilizado por nosotros y otros para discriminar y cuantificar el contenido de Aß intracelular in vitro 16,31,32. Tinción Inmunoelectrónica junto con reconstrucción 3D fue utilizado anteriormente para poner de relieve la ausencia de fibrillas de amiloide dentro de la microglia in vivo en APP23 ratones transgénicos 27, y otro estudio utilizó con éxito imagen confocal y 3D reconstrucción de la superficie de la microglia asociada con placas de beta-amiloide para mostrar Aß limitada interacción y absorción 33. Sin embargo, estas técnicas no permiten la cuantificación de intra-fagolisosómico especies Aß. Otros han desarrollado recientemente una fluorescencia basado en ensayo in vivo que permite la mediciónde la actividad fagocítica de los macrófagos periféricos en la rata 34. Este método permite ingeniosamente para la cuantificación de biosondas fluorescentes en fagolisosomas en vivo, sin embargo, los datos disponibles hasta ahora se limitan a la periferia. Para nuestro conocimiento, es la primera q3DISM método que permite la visualización en 3D y cuantificación de Aß fagocitosis en los cerebros de modelos de roedores de AD. Esta herramienta formidable, sin duda, allanar el camino a una comprensión más profunda de Aß cerebral fagocitosis, y también puede resultar útil en otros contextos.

La enfermedad de Alzheimer (EA), la demencia más común relacionada con la edad 1, se caracteriza por la acumulación de amiloide cerebral-β (Aß) en forma de placas &quot;seniles&quot; ß-amiloide, la neuroinflamación crónica de bajo nivel, taupatía, pérdida neuronal y alteraciones cognitivas 2 . En los cerebros de pacientes con AD, la neuroinflamación se destina por los astrocitos y los fagocitos mononucleares reactiva (referida como microglia, aunque sus centrales vs. origen periférico sigue siendo poco clara) que rodea los depósitos de Aß 3. Como los centinelas inmunes innatas del CNS, microglia se posicionan centralmente para borrar cerebro Aß. Sin embargo, el reclutamiento microglial a las placas de Aß se acompaña de muy poca, o ninguna, la fagocitosis Aß 4,5. Una hipótesis es que la microglía son inicialmente neuroprotector por phagocytozing pequeños montajes de Aß. Sin embargo, con el tiempo estas células se convierten neurotóxico tan abrumadora carga de Aß y / o relacionada con la edad d funcionalecline, provoca la microglía en un fenotipo proinflamatorio disfuncional, lo que contribuye a la neurotoxicidad y la disminución cognitiva 6. Los estudios de asociación de genoma completo (GWAS recientes) han identificado un grupo de alelos de riesgo de AD que pertenecen al núcleo vías inmune innata que modulan la fagocitosis 7 8-11. En consecuencia, la respuesta inmune a la deposición de amiloide cerebral se ha convertido en una importante área de interés, tanto en términos de la comprensión de la etiología de AD y para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos 12-14. Sin embargo, hay una necesidad vital de la metodología para evaluar la fagocitosis Aß in vivo. Para hacer frente a esta necesidad no satisfecha, hemos desarrollado 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM) para permitir la cuantificación real en 3D de la fagocitosis cerebral Aß por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer similar. Limitada sólo por el grado en que recapitular la enfermedad, los modelos animales tienensido de gran ayuda para la comprensión de pathoetiology AD y para la evaluación terapéutica experimental. Debido al hecho de que las mutaciones en los genes presenilina (PS) y la proteína amiloide Precursor (APP) causan independientemente AD autosómica dominante, estos transgenes mutantes se han utilizado ampliamente para generar modelos de roedores transgénicos. Los ratones transgénicos APP / PS1 co-expresar de forma simultánea &quot;sueca&quot; APP mutante humana (SWE APP) y Δ exón 9 presenilina humana mutante 1 (PS1ΔE9) presentes con amiloidosis cerebral acelerada y la neuroinflamación 15,16. Además, hemos generado ratones bi-transgénico coinjected con APP SWE y construcciones PS1ΔE9 (línea TgF344-AD, sobre un fondo Fischer 344). A diferencia de modelos de ratones transgénicos de amiloidosis cerebral, ratas TgF344-AD desarrollan amiloide cerebral que precede taupatía, pérdida de apoptosis de las neuronas, y el deterioro del comportamiento 17. En este informe, se describe un protocolo para la immunostaining microglia, fagolisosomas y depósitos de Aß en secciones cerebrales de ratones APP / PS1 y ratas TgF344-AD, y la adquisición de grandes imágenes confocal z-dimensional. Nos detalle en la generación y análisis de las verdaderas reconstrucciones 3D a partir de conjuntos de datos confocal que permite la cuantificación de la captación de Aß en fagolisosomas microgliales silico. En términos más generales, la metodología que detallamos aquí se puede utilizar para cuantificar prácticamente cualquier forma de fagocitosis in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:384px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:152px;">Abbott</td>
			<td style="width:127px;">NDC 0044-5260-05</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Dissecting scissors Blunt tip</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">82027-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Tweezers</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>94024-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">23G needle</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>BD305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">peristaltic pump FH10</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td>72-310-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:152px;">Bioland Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PBS01-02</td>
			<td>Working concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Kent Scientific</td>
			<td>RBMS-200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Kent Scientific</td>
			<td>RBMS-305C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">32% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:152px;">EMS</td>
			<td style="width:127px;">15714-S</td>
			<td>Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Ethanol</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Various concentrations, see protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>25608-774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Embedding and Infiltration Paraffin</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>15147-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Microtome Leica RM2125</td>
			<td style="width:152px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Disposable Microtome Blades&#160;</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Water bath Leica HI 1210</td>
			<td style="width:152px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Micro slide Superfrost plus</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Xylene</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">534056-4X4L</td>
			<td style="width:249px;">Caution: Toxic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Target Retrieval Solution 10X</td>
			<td style="width:152px;">DAKO</td>
			<td style="width:127px;">S1699</td>
			<td>Working concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KimWipes</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Hydrophobic PAP pen</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">95025-252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:152px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:127px;">017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Coverslips</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">48393081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Glass Slide Rack</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:127px;">100492-942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Iba1 antibody (polyclonal, rabbit)</td>
			<td style="width:152px;">Wako</td>
			<td style="width:127px;">019-19741&#160;</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Iba1 antibody (polyclonal, goat)</td>
			<td style="width:152px;">LifeSpan Bioscience</td>
			<td style="width:127px;">LS-B2645</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse)</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td style="width:127px;">ab955</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat)</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td style="width:127px;">ab53444</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat)</td>
			<td style="width:152px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:127px;">14-1071</td>
			<td>Working concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse)</td>
			<td style="width:152px;">Covance</td>
			<td style="width:127px;">SIG-39220</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse)</td>
			<td style="width:152px;">Covance</td>
			<td style="width:127px;">SIG-39320</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">OC antibody (polyclonal, rabbit)</td>
			<td colspan="2">Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine)</td>
			<td>Working concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 488&#160; mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">A-11001</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 488&#160; rat secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 594 goat secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11080</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21235</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21443</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:152px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">A1 Confocal microscope</td>
			<td style="width:152px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">NIS Elements Advanced Research software</td>
			<td style="width:152px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;">Imaris:Bitplane software version 7.6</td>
			<td style="width:152px;">Bitplane</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>&#34;coloc&#34; and &#34;supass&#34; modules are used.&#160;Alternatively, the open-source freeware&#160;ImageJ can be used for colocalization&#160;analysis of confocal z-stacks datasets.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:384px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative 3d in silico modeling (q3dism) of cerebral amyloid-beta phagocytosis in rodent models of alzheimer's disease

Neuroinflamación es ahora reconocida como un factor etiológico importante en la enfermedad neurodegenerativa. fagocitos mononucleares son células inmunes innatas responsables de la fagocitosis y la eliminación de escombros y detritus. Estas células incluyen macrófagos residentes del SNC conocidas como microglia y fagocitos mononucleares infiltrantes de la periferia. Microscopía de luz en general se ha utilizado para visualizar la fagocitosis en roedores o muestras de cerebro humano. Sin embargo, los métodos cualitativos no han proporcionado pruebas definitivas de la fagocitosis in vivo. A continuación, describimos 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM), un método robusto que permite la cuantificación verdadera 3D de amiloide-β fagocitosis (Aß) por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer (EA). El método implica la visualización de fluorescencia Aß encapsulado dentro fagolisosomas en secciones del cerebro de roedores. Grandes conjuntos de datos confocal z dimensiones son entonces reconstruidos en 3D para la cuantificación de A &amp;# 946; espacialmente colocalized dentro del fagolisosoma. Se demuestra la aplicación exitosa de q3DISM de cerebros de ratones y ratas, pero esta metodología se puede extender a prácticamente cualquier evento de fagocitosis en cualquier tejido.

Utilizando la metodología de múltiples etapas para q3DISM se ha detallado anteriormente, somos capaces de cuantificar la absorción de Aß en fagolisosomas monocitos en los cerebros de APP / PS1 ratones (Figura 1) y ratas TgF344-AD (Figura 2). Por lo tanto, la metodología q3DISM ha permitido el análisis de los fagocitos mononucleares en ratón y rata modelos de AD. Curiosamente, el volumen ocupado por CD68 + fagolisosomas es significativamente mayor en los fagocitos mononucleares Iba1 + asociados con comparación con distante de placas tanto en APP / PS1 ratones (Figura 1B, C) y las ratas TgF344-AD (Figura 2B, C). Estos datos muestran que los fagocitos mononucleares cerca de las placas están listas para la fagocitosis en comparación con las células situadas lejos de la placa. Con el fin de ilustrar la gama de datos de la tinción de diferentes confórmeros Aß, hemos utilizado varios anticuerpos en el ratón y el tejido de rata (detallado en Table 1 y discusión) - no estamos tratando de comparar directamente los modelos de ratón y de rata de la EA con respecto a Aß fagocitosis. No obstante, era digno de mención que la placa asociada fagocitos mononucleares habían aumento de la captación de Aß en ratones APP / PS1 comparación con las células distantes de las placas (Figura 1D). Ratas TgF344-AD tenían muy modesto absorción de fibrillas Aß en general, y no hay cambio en la fagocitosis de fibrillas Aß como una función de la distancia de las placas (Figura 2D). <img alt="tabla 1" src="/files/ftp_upload/54868/54868table1.jpg" /> Tabla 1: La inmunotinción los fagocitos mononucleares, fagolisosomas y β-amiloide en el tejido cerebral de ratones APP / PS1 o ratas TgF344-AD. Ratas o ratones cócteles de anticuerpos específicos se enumeran con sus respectivos acogida entre paréntesis. Los colores indican el fluoróforo usado para el anticuerpo secundario. Red: Alexa Fluor 594; verde: Alexa Fluor 488;magenta: Alexa Fluor 647. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54868/54868fig1.jpg" /> Figura 1: La visualización y cuantificación de amiloide-β fagocitosis en los cerebros de APP / PS1 de ratón. (A) Confocal de imágenes de secciones del cerebro de un ratón APP / PS1 que muestran Iba1 + células (rojo), LÁMPARA1 + fagolisosomas (verde) y 4G8 + depósitos de amiloide (magenta). El recuadro 1 pone de relieve un fagocito mononuclear distante de la placa, mientras que la inserción 2 muestra un fagocito mononuclear asociado con la placa. La barra de escala indica 50 micras. Los paneles más pequeños de la derecha son ampliaciones de Iba1, LÁMPARA1 y 4G8 señales dentro de inserciones 1 y 2. reconstrucción (B) 3D de Iba1, LÁMPARA1 y señales 4G8 para inserciones 1 y 2. La barra de escala de puntos marca el 3 micras. (C) La cuantificación de Iba1 + volumen de fagocitos mononucleares ocupado por LÁMPARA1 + fagolisosomas. ( <strong&gt; D) La cuantificación del volumen LÁMPARA1 + intracelular phagolysosomal ocupado por 4G8 + Aß. Los valores se basan en la relación de la señal (voxels) por encima del umbral que se colocalizó. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (n = 6 células) por fagocitos mononucleares distantes de las placas (1), o asociados con las placas (2). ** P &lt;0,01 por la prueba t de Student. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54868/54868fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54868/54868fig2.jpg" /> Figura 2: La visualización y cuantificación de amiloide-β fagocitosis en los cerebros de ratas TgF344-AD. (A) Confocal de imágenes de secciones del cerebro de una rata TgF344-AD que muestra células Iba1 + (rojo), CD68 + fagolisosomas (verde), y OC + fibrilar soluble A &amp; #<html> 946; (magenta). El recuadro 1 pone de relieve un fagocito mononuclear distante de la placa, mientras que la inserción 2 muestra un fagocito mononuclear asociado con la placa. La barra de escala indica 50 micras. Los paneles más pequeños de la derecha son ampliaciones de Iba1, CD68 y señales OC dentro de inserciones 1 y 2. (B) la reconstrucción 3D de Iba1, CD68 y las señales de CO para inserciones 1 y 2. La barra de escala indica 3 micras. (C) La cuantificación de Iba1 + volumen de fagocitos mononucleares ocupado por fagolisosomas CD68 +. (D) La cuantificación del volumen de CD68 + intracelular phagolysosomal ocupado por OC + Aß. Los valores se basan en la relación de la señal (voxels) por encima del umbral que se colocalizó. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (n = 6 células) por fagocitos mononucleares distantes de las placas (1), o asociados con las placas (2). ** P &lt;0,01 por la prueba t de Student.rge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Hemos desarrollado una metodología para 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM) de β-amiloide cerebral fagocitosis (Aß) por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer. Este método puede ser generalizado para la cuantificación de virtualmente cualquier caso fagocítica in vivo.

3D cuantitativa<em&gt; In silico</em&gt; Modelado (q3DISM) de beta-amiloide cerebral fagocitosis en roedores modelos de enfermedad de Alzheimer

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

quantitative-3d-silico-modeling-q3dism-cerebral-amyloid-beta

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

7.9K vistas.  University of Southern California (USC).  Hemos desarrollado una metodología para 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM) de β-amiloide cerebral fagocitosis (Aß) por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer. Este método puede ser generalizado para la cuantificación de virtualmente cualquier caso fagocítica in vivo. 

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Examining the Characteristics of Episodic Memory using Event-related Potentials in Patients with Alzheimer's Disease

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic mild cognitive impairment (aMCI) and Alzheimer's disease (AD). Whereas behavioral data inform us about the patients' performance, ERPs allow us to record discrete changes in brain activity. Further, ERPs can give us insight into the onset, duration, and interaction of independent cognitive processes associated with memory retrieval. In patient populations, these types of studies are used to examine which aspects of memory are impaired and which remain relatively intact compared to a control population. The methodology for collecting ERP data from a vulnerable patient population while these participants perform a recognition memory task is reviewed. This protocol includes participant preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis. In addition to basic setup and acquisition, we will also demonstrate localization techniques to obtain greater spatial resolution and source localization using high-density (128 channel) electrode arrays.

The methodology for collecting high-density event-related potential data while patients with Alzheimer's disease perform a recognition memory task is reviewed. This protocol will include subject preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis.

Examinar las características de la memoria episódica con potenciales relacionados con eventos en pacientes con enfermedad de Alzheimer

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic ...

Investigación

Medicina

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

El uso de ultra-alta MRI Field en Modelos pequeño roedor de la enfermedad renal poliquística para<em&gt; En Vivo</em&gt; Fenotipificación de Drogas y Vigilancia

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle proliferation and obliteration of pulmonary arterioles. This in turn results in right ventricular (RV) failure, with significant morbidity and mortality. Rodent models of PAH, in the mouse and the rat, are important for understanding the pathophysiology underlying this rare disease. Notably, different models of PAH may be associated with different degrees of pulmonary hypertension, RV hypertrophy and RV failure. Therefore, a complete hemodynamic characterization of mice and rats with PAH is critical in determining the effects of drugs or genetic modifications on the disease. 
Here we demonstrate standard procedures for assessment of right ventricular function and hemodynamics in both rat and mouse PAH models. Echocardiography is useful in determining RV function in rats, although obtaining standard views of the right ventricle is challenging in the awake mouse. Access for right heart catheterization is obtained by the internal jugular vein in closed-chest mice and rats. Pressures can be measured using polyethylene tubing with a fluid pressure transducer or a miniature micromanometer pressure catheter. Pressure-volume loop analysis can be performed in the open chest. After obtaining hemodynamics, the rodent is euthanized. The heart can be dissected to separate the RV free wall from the left ventricle (LV) and septum, allowing an assessment of RV hypertrophy using the Fulton index (RV/(LV+S)). Then samples can be harvested from the heart, lungs and other tissues as needed.

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease of pulmonary arterioles that leads to their obliteration and the development of right ventricular failure. Rodent models of PAH are critical in understanding the pathophysiology of PAH. Here we demonstrate hemodynamic characterization, with right heart catheterization and echocardiography, in the mouse and rat.

Hemodinámica Caracterización de roedores modelos de hipertensión arterial pulmonar

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle ...

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It is well established that synapse loss and ensuing neurodegeneration are the best predictors for memory impairments in AD. Latest studies have emphasized the neurotoxic role of soluble amyloid-beta oligomers (A&#946;o) that begin to accumulate in the human brain approximately 10 to 15 yr before the clinical symptoms become apparent. Many reports indicate that soluble A&#946;o correlate with memory deficits in AD models and humans. The A&#946;o-induced neurodegeneration observed in neuronal and brain slice cultures has been more challenging to reproduce in many animal models. The model of repeated A&#946;o infusions shown here overcome this issue and allow addressing two key domains for developing new disease modifying therapies: identify biological markers to diagnose early AD, and determine the molecular mechanisms underpinning A&#946;o-induced memory deficits at the onset of AD. Since soluble A&#946;o aggregate relatively fast into insoluble A&#946; fibrils that correlate poorly with the clinical state of patients, soluble A&#946;o are prepared freshly and injected once per day during six days to produce marked cell death in the hippocampus. We used cannula specially design for simultaneous infusions of A&#946;o and continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps. This innovative in vivo method can now be used in preclinical studies to validate the efficiency of new AD therapies that might prevent the deposition and neurotoxicity of A&#946;o in pre-dementia patients.

To study the effects of A&#946;o in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble A&#946;o coupled with continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of A&#946;o.

Neurodegeneración en un modelo animal de beta-amiloide crónica Oligómero de infusión es contrarrestado por el anticuerpo Tratamiento Con una infusión de bombas osmóticas

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated measurements over weeks or months of accessory respiratory muscle activity while simultaneously measuring ventilation in a non-anesthetized, freely behaving mouse. The technique includes the surgical implantation of a radio transmitter and the insertion of electrode leads into the scalene and trapezius muscles to measure the electromyogram activity of these inspiratory muscles. Ventilation is measured by whole-body plethysmography, and animal movement is assessed by video and is synchronized with electromyogram activity. Measurements of muscle activity and ventilation in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are presented to show how this tool can be used to investigate how respiratory muscle activity changes over time and to assess the impact of muscle activity on ventilation. The described methods can easily be adapted to measure the activity of other muscles or to assess accessory respiratory muscle activity in additional mouse models of disease or injury.

This paper introduces a method for repeated measurements of ventilation and respiratory muscle activity in a freely behaving amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mouse model throughout disease progression with whole-body plethysmography and electromyography via an implanted telemetry device.

Repetida Medición de la actividad muscular respiratoria y ventilación en el ratón modelos de enfermedad neuromuscular

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

Application of Granger Causality Analysis of the Directed Functional Connection in Alzheimer's Disease and Mild Cognitive Impairment

Impaired functional connectivity in the Default Mode Network (DMN) may be involved in the progression of Alzheimer&#39;s Disease (AD). The Posterior Cingulate Cortex (PCC) is a potential imaging marker for monitoring the progression of AD. Previous studies did not focus on the functional connectivity between the PCC and nodes in regions outside the DMN, but our study is an effort to explore these overlooked functional connections. For collecting data, we used functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) and Granger Causality Analysis (GCA). fMRI provides a non-invasive method for studying the dynamic interactions between the different brain regions. GCA is a statistical hypothesis test for determining whether one-time series is useful in forecasting another. In simple terms, it is judged by comparing the &#34;Known all the information on the last moment, the distribution of the probability of X at this time&#34; and the &#34;Known all the information on the last moment except Y, the distribution of the probability of X at this time&#34;, to determine whether there is a causal relationship between Y and X. This definition is based on the complete information source and stationary chronological sequence. The main step of this analysis is to use X and Y to establish the regression equation and draw a causal relationship by a hypothetical test. Since GCA can measure causal effects, we used it to investigate the anisotropy of the functional connectivity and explore the hub function of the PCC. Here, we screened 116 participants for MRI scanning, and after preprocessing the data obtained from neuroimaging, we used GCA to derive the causal relationship of each node. Finally, we concluded that the directed connection is significantly different between the Mild Cognitive Impairment (MCI) and AD groups, both from the PCC to the whole brain and from the whole brain to the PCC.

Based on resting-state functional magnetic resonance imaging with Granger causality analysis, we investigated the alterations in the directed functional connectivity between the posterior cingulate cortex and whole brain in patients with Alzheimer&#39;s Disease (AD), patients with Mild Cognitive Impairment (MCI), and healthy controls.

Aplicación del análisis de causalidad de Granger de la conexión funcional dirigida en la enfermedad de Alzheimer y deterioro cognitivo leve

Impaired functional connectivity in the Default Mode Network (DMN) may be involved in the progression of Alzheimer&#39;s Disease (AD). The Posterior ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Evaluación de la función renal en modelos de ratón de la enfermedad Glomerular

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...