Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation - Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

The authors have nothing to disclose.

Biofilms de Bacillus subtilis formes robustes et très structurés dans les deux liquides (pellicules) et sur un milieu solide (colonies). Par conséquent, il sert d&#39;organisme modèle idéal pour caractériser le mode d&#39;action des inhibiteurs de biofilm spécifiques. Sur un support solide, les cellules forment une structure multicellulaire présentant des caractéristiques distinctives qui ne sont pas évidents dans des pellicules, telles que les rides rayonnant à partir du centre vers le bord. Ainsi, les pellicules et les colonies sont des systèmes complémentaires pour étudier B. multicellularité subtilis. Le but de cette étude est de développer un B. subtilis système modèle pour biofilm (pellicules et des colonies) d&#39; inhibition. Plusieurs étapes sont essentielles pour la reproductibilité de l&#39;essai biofilm de perturbation. Une première étape critique est de confirmer que l&#39;effet sur la formation de biofilm est pas due à une toxicité générale à des bactéries cultivées dans le mode de vie planctonique. Ceci peut être considéré en comparant l&#39;effet d&#39;une concentration donnée en tant queun inhibiteur de molécule centre sur le biofilm inhibition par rapport à l&#39;effet de cette molécule sur la croissance planctonique. Un effet considérablement plus fort sur le développement du biofilm peut assurer l&#39;identification des mécanismes de cibles qui sont particulièrement importantes pour le développement de biofilms. En outre, l&#39;étude décrite ici démontre l&#39;importance des conditions de pré-culture pour le développement de pellicules et de leur sensibilité à de petites molécules. Avant de caractériser l&#39;effet de petites molécules, des conditions expérimentales reproductibles et robustes (par exemple, la température de croissance de la pellicule et le manque de sensibilité à la composition des médias) pour tester leurs effets devraient être définis. Pour trouver de telles conditions, les médias de l&#39;état pré-culture, de la phase des médias pré-culture, pré-culture enlèvement de médias, la température de croissance et de croissance la croissance devrait être envisagée. Un défi majeur, une fois un inhibiteur spécifique pour la formation de biofilm se trouve, est de trouver quantitativeet des méthodes qualitatives qui caractérisent les effets de ces inhibiteurs de petites molécules sur le développement d&#39;un biofilm et la résistance. Ici, deux méthodes importantes sont décrites en détail qui peuvent être utilisés pour évaluer les effets de ces inhibiteurs. Tout d&#39;abord, nous introduisons une méthode quantitative simple qui peut sonder de manière reproductible la résistance des traités contre les biofilms des colonies non traitées à bactéricides, tels que l&#39;éthanol. Des résultats représentatifs sont illustrés pour la sensibilité des colonies de biofilms D-leucine-traitée à 50% d&#39;éthanol. Cependant, cet essai peut être facilement modifié en utilisant différents agents stérilisants ou des antibiotiques. Deuxièmement, une méthode SEM est décrite en détail qui permet à haute résolution examen des changements dans la colonie de biofilm causée par l&#39;inhibiteur de petite molécule dans plusieurs niveaux complémentaires: la structure globale, l&#39;organisation et l&#39;abondance de la matrice des EPS et de ses composants, et la morphologies unicellulaires à travers le biofilm. Nous notons que les deux méthodes de dehydratile (séchage à l&#39;air de 100% d&#39;éthanol ou CP-séchage en utilisant du dioxyde de carbone comme fluide de transition) peut également être utilisé lors de la préparation de l&#39;échantillon au MEB d&#39;une colonie du biofilm. Surtout la fixation réussie de l&#39;échantillon de film biologique repose en grande partie sur le caractère hydrophobe de la colonie du biofilm. Cette hydrophobie est une caractéristique intrinsèque de B. biofilms subtilis due à la couche de surface hydrophobe 10,34. Plusieurs approches ont été utilisées précédemment pour étudier l&#39; assemblage et le développement biofilm avec B. subtilis comme organisme modèle 35. Un certain nombre d&#39;études indépendantes ont démontré les effets de la composition des médias sur le développement du biofilm 36-38. Jusqu&#39;à présent, cependant, une évaluation systématique des effets de la composition des médias sur l&#39;inhibition de biofilm était, au mieux de notre connaissance, manque. Cette étude démontre que tandis que l&#39; inhibition de la pellicule de B. subtilis par de petites molécules est sensible aux conditions de culture pré, il est unaffected par les effets de la température et de la composition des milieux, et donc utile pour les écrans systématiques des inhibiteurs de petites molécules. En outre, nous avons établi une méthode simple, reproductible et quantitative pour évaluer la résistance des molécules non traitées ou petites colonies de biofilms inhibiteur traité à des agents antibactériens, qui fait actuellement défaut dans le modèle de biofilm organisme B. subtilis. B. biofilms subtilis en combinaison avec des journalistes fluorescentes peuvent être prises à la suite de rechercher des inhibiteurs de petites molécules qui ciblent soit une étape spécifique du développement de la formation de biofilm ou d&#39; une sous-population spécifique de cellules dans le biofilm. Les procédés décrits ici ne fournissent pas la résolution de la cellule unique en termes d&#39;expression de gènes au sein du biofilm. Méthodes d&#39;analyse de l&#39; expression du gène EPS matrice au sein de B. biofilms subtilis au niveau de la cellule unique ont été établis avec succès 39. Les biofilms bactériens sont de Crucial &#39;importance dans les milieux agricoles, industriels et cliniques. Dans un contexte agricole, la capacité à former des biofilms augmente la colonisation de la plante hôte de nombreux agents pathogènes des plantes 40, et dans un contexte clinique, les biofilms sont intrinsèquement résistants aux agents antimicrobiens 21 et sont au cœur de nombreuses infections bactériennes persistantes et chroniques. En outre, il est maintenant reconnu que les biofilms ont d&#39; énormes répercussions sur les coûts pour l&#39; industrie car ils sont extrêmement difficiles à éliminer et contrôler 41. Ainsi, l&#39; élaboration d&#39; un cadre expérimental pour l&#39;étude des inhibiteurs de biofilms microbiens fournira d&#39; importants agricoles 42,43, 21,44 cliniques et technologiques 45-47 progrès. Les méthodes actuelles sont limitées à B. subtilis. Nous encourageons en suivant les concepts quantitatifs et qualitatifs décrits pour étudier les inhibiteurs de petites molécules spécifiques biofilm dans d&#39;autres espèces. en outre<html> , Cette étude se rapporte à un exemple spécifique pour biofilm inhibition par D-leucine, de plusieurs inhibiteurs de biofilm spécifique publié précédemment 17. Surtout, D-leucine était déjà caractérisée comme une molécule anti-biofilm dans le pathogène végétal Xanthomonas citri 48, présentant des similitudes possibles entre la colonisation des plantes et la formation de biofilm. La formation du biofilm (pelliculaire et la formation de colonies rugose) est également fréquente chez les agents pathogènes humains (par exemple, Pseudomonas aeruginosa 49-51 et Escherichia coli uropathogènes 52,53). Les méthodes décrites peuvent être développés à la recherche de médicaments spécifiques qui inhibent la formation de biofilm et réduisent la résistance du biofilm médiée aux agents antimicrobiens dans la recherche clinique. Dans l&#39;ensemble, les méthodes décrites ici peuvent être utilisées comme base pour développer des concepts quantitatifs et qualitatifs pour étudier les inhibiteurs de petites molécules spécifiques biofilm dans d&#39;autres espèces. nt &quot;&gt; En résumé, nous fournissons une boîte à outil simple et utile qui démontre les forces et les pièges potentiels dans l&#39; utilisation de B. subtilis pour étudier les inhibiteurs de biofilm.

communautés bactériennes multi-cellulaires jouent un rôle important dans les milieux naturels et anthropiques, et peuvent être bénéfiques ou très néfaste. Ces colonies multicellulaires sont appelées biofilms, dans lequel les cellules individuelles sont noyées dans une (EPS) de la matrice extracellulaire des substances polymères auto-produites. Les EPS adhèrent fortement les cellules à la surface qu&#39;ils colonisent. Ils servent de bouclier contre les forces mécaniques et chimiques et de créer un contact étroit entre les cellules voisines, ce qui facilite la communication cellulaire 1. Un biofilm peut être considérée comme une communauté différenciée, où les cellules utilisent très réglementées, orchestré des processus pour coordonner leurs activités au sein de la communauté, ainsi que toutes les espèces 2-5. La transition d&#39;un planctoniques, mode libre-vie de la croissance à un état de biofilm est souvent associée à des processus de développement. Un bon exemple est la bactérie du sol Bacillus subtilis Gram positif, et donc un undómësouche sticated sert organisme modèle robuste pour étudier les étapes du développement menant à la formation de biofilm. Dans cette bactérie, cellules mobiles s&#39;organisent en structures multicellulaires visibles qui effectuent des tâches spécialisées 4. Un groupe de cellules, la matrice producteurs sécrètent exopolysaccharides 6, la protéine amyloïde Tasa 7,8, et la protéine de surface hydrophobe BSLA 9,10; qui tous participent à l&#39;assemblage des EPS 11-13. Compte tenu de l&#39;abondance des biofilms dans des niches naturelles et anthropiques et les dommages mortels putative ils peuvent causer, il y a un besoin urgent de trouver des moyens de prévenir leur formation. Les inhibiteurs de petites molécules peuvent aider à la découverte de nouvelles voies de régulation, des enzymes et des protéines structurales impliquées dans la formation de biofilm, et promouvoir ainsi un aperçu des processus complexes de l&#39;ensemble de la communauté multicellulaire. Comme B. subtilis est un modèle bien étudié pour la bioformation d&#39; un film 14,15, il peut être utilisé pour évaluer les effets de divers inhibiteurs de biofilm. Cette étude aborde quatre méthodes fondamentales qui sont essentielles pour évaluer la réponse des biofilms aux inhibiteurs de petites molécules. Tout d&#39;abord, pour s&#39;assurer que ces inhibiteurs ont une cible spécifique de biofilm, la séparation de l&#39;effet sur la croissance planctonique de l&#39;effet sur la formation de biofilm est critique. La plupart des agents antibactériens cellules cibles dans leur phase de croissance planctonique, mais des molécules qui ciblent le mode de vie de biofilm sont rares. En outre, en tant que molécules qui ne touchent pas la croissance planctonique ne sont pas toxiques, ils peuvent réduire la pression sélective favorisant des mutants résistants aux antibiotiques 16. Par exemple, lorsque les biofilms sont traités avec des acides aminés D ou de certaines autres molécules de paroi interférant cellule, ils sont soit perturbés ou démontées, mais ces inhibiteurs affectent seulement légèrement 12,17 croissance planctonique. En revanche, de nombreux antibiotiques altèrent considérablement la croissance planctonique, avec little ou pas d&#39; effet sur la formation de biofilm 17. Deuxièmement, l&#39;établissement d&#39;un cadre expérimental cohérente et solide pour étudier l&#39;effet des petites molécules est cruciale. Nous avons observé que la plage de concentration active d&#39;inhibiteurs de petites molécules est sensible aux conditions de préculture et le dispositif expérimental utilisé pour étudier l&#39;effet de ces inhibiteurs à petites molécules. Divers rapports, en particulier ceux qui étudient B. subtilis, a révélé des variations dans la plage de concentration à laquelle les acides D-aminés inhibent la formation de pellicules - les biofilms bactériens flottants 12,17-19. Les résultats présentés ici suggèrent que les facteurs suivants expliquent les différences dans la gamme de concentration active: les conditions de pré-culture (logarithmique 12,17 par rapport à la phase tardive stationnaire 20 croissance), le milieu de croissance utilisé dans l&#39;état pré-culture (riche, undefined [Luria Broth, LB] par rapport défini [glutamate monosodique-glycérol, MSgg]), le rapport d&#39;inoculation et en particulier l&#39;élimination du milieu de pré-culture avant l&#39;inoculation. La température de croissance pelliculaire statique a montré un rôle moins important dans le domaine d&#39;activité de l&#39;inhibiteur de petite molécule de D-leucine, représentant un acide D-aminé utilisé dans la présente étude. Enfin, une fois que les biofilms sont traités avec des inhibiteurs de biofilm spécifiques, des méthodes robustes et informatives sont nécessaires pour caractériser les effets de ces inhibiteurs sur biofilm fitness. Ici, deux méthodes pour caractériser de façon indépendante l&#39;effet des inhibiteurs de petites molécules sont décrits en détail: (1) L&#39;effet sur des cellules individuelles au sein d&#39;une colonie du biofilm et leur résistance aux agents antimicrobiens. Les cellules dans les biofilms sont généralement plus résistantes aux antibiotiques par rapport à des bactéries vivant librement 21-23. Bien que ce phénomène est multifactorielle, la capacité des EPS pour réduire la pénétration des antibiotiques a souvent été considérée comme une explication attrayante 24 </sup&gt;. Cette méthode évalue la survie des cellules pré-établies biofilm après exposition à des substances antibactériennes. (2) L&#39;effet sur l&#39;architecture biofilm de la colonie, de la grande à la petite échelle. les colonies biofilm se caractérisent par leur structure tridimensionnelle et la présence de l&#39;EPS. En utilisant la microscopie électronique à balayage, des changements dans la morphologie cellulaire, la structure de la colonie du biofilm et l&#39;architecture et l&#39;abondance de l&#39;EPS peut être visualisée à partir de la grande taille (mm) à la petite échelle (um).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="897">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Luria Broth, Lennox</td>
			<td style="width:305px;">Difco</td>
			<td style="width:127px;">240230</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, 209.27 g/mol</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Merck, 203.30 g/mol&#160;</td>
			<td>1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride anhydrous</td>
			<td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td>
			<td>1311-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma, 197.91 g/mol</td>
			<td>31422-250G-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iron(III) chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 270.30 g/mo)</td>
			<td>F2877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zinc chloride anhydrous&#160;</td>
			<td>Acros Organics, 136.29 g/mol</td>
			<td>424592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma, 337.27 g/mol</td>
			<td>T1270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-tryptophan</td>
			<td>Fisher Scientific, 204.1 g/mol</td>
			<td>BP395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma, 165.19 g/mol</td>
			<td>P5482-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-threonine</td>
			<td>Sigma, 119.12 g/mol</td>
			<td>T8625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol anhydrous</td>
			<td>Bio-Lab Itd</td>
			<td>712022300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamic acid monosodium salts hydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>G1626-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-leucine</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>855448-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol anhydrous</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">razor blade</td>
			<td>Eddison</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">circular cellulose filter papers</td>
			<td>Whatman, 90 mm</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutaraldehyde</td>
			<td>EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>EMS, 16% in water</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium cacodylate</td>
			<td>Merck, 214.05 g/mol&#160;</td>
			<td>8.2067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride 2-hydrate</td>
			<td>Merck, 147.02 g/mol&#160;</td>
			<td>1172113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stub-aluminium mount</td>
			<td>EMS, sloted head</td>
			<td>75230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">carbon adhesive tape</td>
			<td>EMS</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker 37&#176;C</td>
			<td>New Brunswick Scientific Innowa42</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf table top centrifuge 5424</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:301px;">Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip</td>
			<td>Branson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 30 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 23 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter System, 500 ml, polystyrene</td>
			<td>Cornig Incorporated</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S150 Sputter Coater&#160;</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPD 030 Critical Point Dryer</td>
			<td>BAL-TEC</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Environmental Scanning Electron Microscope</td>
			<td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Le dosage de la pellicule est une méthode pour étudier les processus hautement réglementés et dynamiques de B. multicellularité subtilis. En outre, le dosage de la pellicule est adapté pour tester une gamme de conditions soit pré-démarrage ou des concentrations de petites molécules dans une plaque multiple à la culture cellulaire unique dans une expérience. Cependant, B. la formation pelliculaire subtilis est sensible aux conditions de pré-culture (par exemple, le milieu de croissance de la pré-culture et de sa phase de croissance), le rapport d&#39;inoculation et l&#39;élimination du milieu de pré-culture. Nous avons donc d&#39;abord examinées pour une installation expérimentale qui nous a permis de reproduire pelliculaire inhibition par D-leucine. Nos résultats montrent que reproductible pelliculaire d&#39;inhibition par le D-leucine peut être obtenu si les cellules sont pré-cultivées dans indéfini milieu LB riche en une phase de croissance mi-logarithmique (une seule colonie dans 3 ml de LB à 37 ° C pendant 4 heures tout en agitant ), centrifugées et remises en suspension dans un milieu défini MSgg avant d&#39;un mélange 1: 1 000 inoculation (figure 3A). Lorsque les cellules ont été cultivées dans du milieu MSgg au-logarithmique à mi phase de croissance (une seule colonie dans 1 ml de LB pendant 2 heures, re-dilué 1: 100 à 3 ml MSgg, et cultivées pendant 5 heures à 37 ° C sous agitation à 200 rpm), le retrait du milieu de pré-culture n&#39;a pas eu d&#39;effet sur l&#39;activité de la D-leucine. Les cellules cultivées jusqu&#39;à la phase de croissance stationnaire (colonie unique dans 1 ml de LB pendant 2 heures, re-dilué 1: 100 à 3 ml MSgg et cultivées pendant jusqu&#39;à 20 heures dans un rouleau à la température ambiante) et lavées dans un milieu MSgg avant la inoculation étaient moins sensibles. Cependant, cette augmentation de la résistance à l&#39;égard de l&#39;effet d&#39;inhibition de la pellicule de D-leucine peut être dû à la densité cellulaire plus élevée de la pré-culture, ce qui augmente le taux d&#39;inoculation. Le rapport d&#39;inoculation de la culture préalable à la croissance dans un milieu statique MSgg, à savoir 1: 500 ou 1: 1000, influencé la gamme d&#39;activité de la D-leucine et la durée du développement pelliculaire (figure 3B). Pellicle inhibition par D-leucine a eu lieuà différentes températures de croissance (23 ° C et 30 ° C, figure 3C). Fait important, alors que la sensibilité des cellules à la D-leucine est fonction des conditions de pré-culture, la reproductibilité des phénomènes à différentes températures, montre que l&#39;inhibition pelliculaire par la petite molécule de D-leucine a des caractéristiques robustes. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig3.jpg" /> . Figure 3. Exemples de résultats qui montrent les effets de diverses conditions de pré-culture sur pellicule inhibition par D-leucine Plusieurs paramètres doivent être évalués pour obtenir une configuration expérimentale robuste, y compris: (A) l&#39; élimination des contaminants de la croissance pré-culture moyen (non lavé par rapport lavé), moyenne de la pré-culture de croissance (, milieu LB undefined riche ou défini biofilm induisant moyen MSgg), et de l&#39;état de la pré-culture de croissance (logarithmique contre phase stationnaire de croissance), (B) Taux d&#39;inoculation (1: 1000 par rapport à 1: 500) de la pré-culture dans le milieu final de croissance pelliculaire, et (C) la température de croissance (23 ° C contre 30 ° C) B.. subtilis NCIB 3610 cellules ont été cultivées dans le milieu indiqué (LB ou MSgg) pendant 4 heures à 37 ° C ou à la température ambiante pendant la nuit (o / n) avec agitation, et milieu de pré-culture a été remplacé par MSgg si indiqué (lavés ou non lavés). Enfin, la culture starter a été inoculé 1: 1000 sauf indication contraire et les pellicules ont été cultivées dans des conditions statiques à 23 ° C pendant trois jours. photographies descendantes ont été acquises avec une caméra. Eh bien le diamètre est de 22 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Après l&#39;identification des conditions de pré-culture et un dispositif expérimental qui a permis une gamme d&#39;activité reproductible de D-leucine sur la formation pelliculaire (pré-culture cultivée dans du milieu LB à une phase de croissance mi-logarithmique, lavées dans MSgg, dilué à 1: 1000 et cultivées à 23 ° C pendant trois jours), l&#39;effet a été testé pour sa robustesse. A cet effet, l&#39;activité de la D-leucine sur la formation pelliculaire a été évaluée dans divers milieux MSgg modifiée (figure 4). La plage d&#39;activité de la D-leucine dans l&#39;inhibition de la pellicule était constante dans les cinq milieux testés, et montre que l&#39;effet du D-leucine sur la formation de la pellicule est robuste. Une tendance similaire a été observée avec la D-tyrosine, où l&#39;inhibition de la pellicule dans la gamme de concentration allant jusqu&#39;à 2 pm était cohérente dans plusieurs milieux modifiés MSgg (concentration en fer inférieure et le remplacement de la source d&#39;azote avec du chlorure d&#39;ammonium ou la source de carbone avec du glucose, des données non représenté). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig4.jpg" /> La sensibilité à la figure 4. D-leucine se produit dansdivers milieux de croissance. Montré sont des photographies de haut en bas de B. subtilis NCIB 3610 pellicules, cultivées dans des conditions statiques à 23 ° C dans un sens, le milieu MSgg biofilm induisant ou dans différents milieux MSgg modifié (source de carbone , 0,5% de glucose, une source d&#39;azote 0,5% de (NH 4) 2 SO 4; teneur élevée en fer de 250 pM FeCl 3, faible glycérol 0,125% de glycerol) pendant trois jours, sauf pour le moyen de source d&#39;azote alternatif (où les pellicules ont été cultivées pendant cinq jours) , soit sans soit avec la D-leucine , à des concentrations indiquées. Cultures de départ ont été cultivées pendant 4 heures à 37 ° C avec agitation dans undefined, milieu riche LB. Avant l&#39;inoculation, les cellules ont été lavées par centrifugation et remises en suspension dans le milieu de croissance de la pellicule correspondante. La culture de départ a été dilué à 1: 1000, le diamètre du puits est de 22 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> </a&gt; Une autre méthode consiste à étudier B. subtilis multicellularité est le biofilm colonie essai sur un milieu de MSgg solide. Comme pellicules, ce test permet l&#39;étude des processus spatio-temporels. Une fois que la plage active d&#39;inhibiteurs de petites molécules est déterminé dans le système pelliculaire, leur effet sur la formation de biofilm de colonies peut être étudiée. Dans cette étude, les colonies biofilm ont été utilisés pour évaluer l&#39;effet du D-leucine sur la résistance des colonies biofilm à des agents stérilisants, parce que les colonies de biofilms sont moins fragiles et sur le fond solide, ils sont plus faciles à manipuler. Lorsque les colonies de biofilms traitées avec la D-leucine sont exposés à 50% d&#39; éthanol pendant 10 min, le pourcentage de cellules survivantes diminue considérablement par rapport à la fraction non traitée (figure 5). Cette méthode peut être développée pour évaluer les effets d&#39;autres inhibiteurs de petites molécules et de leur effet sur la résistance aux agents bactéricides (sterilagents ou des antibiotiques izing). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig5.jpg" /> Figure 5. Exemple de résultats de résistance biofilm colonie non traitées ou traitées contre un agent stérilisant. Colonies biofilms de B. subtilis NCIB 3610 ont été cultivées sur des bases solides, un milieu défini pour 68 heures à 30 ° C, avec ou sans mM D-leucine 0,5. Après avoir coupé les colonies en deux moitiés égales, une moitié a été traitée avec du PBS (témoin interne) et l&#39;autre moitié avec 50% d&#39;éthanol ou du PBS (contrôle). Après sonication douce, la dilution en série, le placage et le comptage des unités formant des colonies, le pourcentage des survivants par rapport au contrôle interne a été calculé. Sont représentés les résultats de trois expériences indépendantes avec les moyennes de deux (A) ou trois (B, C) se réplique et leurs écarts - types. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici t</a>o voir une version plus grande de cette figure. La microscopie électronique à balayage (MEB) est un outil puissant qui peut être utilisé pour se concentrer sur l&#39;architecture spatiale des rides biofilm des colonies, l&#39;abondance et la localisation des EPS et de la morphologie de la cellule unique 31. l&#39;imagerie SEM nécessite des échantillons qui peut être imagée sous vide poussé. Pour étudier des échantillons dans des conditions de vide élevé, toutes les molécules d&#39;eau en vrac doivent être enlevés, et par conséquent, l&#39;imagerie SEM nécessite la déshydratation de l&#39;échantillon avant l&#39;imagerie. En variante, les échantillons peuvent être imagés dans des conditions de faible dépression dans le mode par voie humide par microscopie électronique à balayage environnemental (ESEM), où l&#39;échantillon hydraté est séché doucement dans la chambre de microscope. Pour évaluer les effets des inhibiteurs de petites molécules sur l&#39;architecture biofilm de la colonie, l&#39;organisation des EPS et la morphologie des cellules, trois types d&#39;échantillons déshydratation différents ont été comparés: le séchage au microscope sous mo humidede conditions (ESEM), séché à l&#39;air d&#39;un point (CP) solvant ou critique -séchée en utilisant du dioxyde de carbone comme fluide de transition. Dans non traitée et la D-leucine traité B. subtilis colonies de biofilms différentes des étapes d&#39;hydratation selon la méthode utilisée pourraient être observées. Imaging dans des conditions de faible dépression dans le mode humide par ESEM conservé l&#39;état très naturel de la colonie de biofilm. Cependant, des informations sur la morphologie cellulaire unique et de l&#39;abondance des EPS et de l&#39;architecture était rare, que les EPS étaient encore complètement hydraté et les cellules ont été intégrés dans les EPS (données non présentées). En termes de déshydratation, CP-séchage est la procédure la plus stricte. Il a éliminé plus structurellement des molécules d&#39;eau liées ou en vrac à partir du tissu, ce qui représente une perte de 30 à 70% en volume, en fonction du tissu 32. En revanche, l&#39;air de séchage a conservé les molécules d&#39;eau liées. Un tissu embryonnaire par exemple perdu 18% de son volume après séchage à l&#39; air de l&#39;éthanol solvant volatil et 59% après CP-séchage 32 </sup&gt;. Comme les EPS lient l&#39;eau et sont très hydratée, nous recommandons de considérer la perte complète de l&#39;eau dans le procédé de CP-séché. Lorsque les échantillons de cette étude ont été déshydratés dans de l&#39; éthanol et séché à l&#39; air, la structure tridimensionnelle de la colonie du biofilm a été conservée, les cellules individuelles sont apparues, et l&#39;EPS ont été rasées, mais ils ont encore connecté et porté sur les cellules individuelles (figure 6A) . Colonies biofilm qui ont été déshydratés avec de l&#39; éthanol et CP-séchées également conservé leur structure tridimensionnelle et les EPS sont apparus comme une toile d&#39;araignée (Figure 6C). Dans les échantillons séchés à l&#39;air et CP-séchés, les effets de l&#39;inhibiteur à petites molécules de D-leucine , de l&#39;architecture du biofilm de colonies, la structure de la morphologie cellulaire et le BPA unique étaient apparentes (figure 6B et D). Les colonies de biofilms cultivés en présence de D-leucine étaient plus petites et les rides sont moins prononcées. Les cellules D-leucine ont été traitées de forme allongée, un phénotype qui est observed dans les cellules traitées avec des molécules ciblant la paroi cellulaire 33. En outre, les cellules ont été nettement moins couverts avec les EPS et non étroitement liés à leurs cellules voisines via les EPS comme on le voit dans les colonies de biofilms non traitées. Les résultats présentés montrent que les procédés de biofilm colonie déshydratation, séché à l&#39;air à partir d&#39;éthanol ou CP-séchées en utilisant du dioxyde de carbone comme fluide de transition donnent des indications précieuses sur l&#39;effet de petites molécules sur la morphologie cellulaire unique, ainsi que sur l&#39;abondance EPS et de l&#39;architecture. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig6.jpg" /> Figure 6. Les petites molécules peuvent changer la grande et petite échelle de l&#39;architecture biofilm de la colonie. Colonies biofilms de B. subtilis NCIB 3610 adulte (A et D) en absence ou (B et D) en présence de mM D-leucine 0,5 pendant 72 heures à 30 ° Csur un milieu solide MSgg ont une fixation tel que décrit dans le protocole et séché dans de l&#39; éthanol de la manière suivante: (A et B) et séché à l&#39; air (C et D) CP séché en utilisant du dioxyde de carbone comme fluide de transition. Montré sont de haut en bas des images binoculaires des colonies de biofilms (gauche, panneaux supérieurs), de haut en bas des photographies des colonies de biofilms séchées monté sur électrons moignons de microscopie avant or-palladium-revêtement (gauche, panneaux inférieurs), à faible et à fort grossissement images acquises par SEM pour montrer l&#39;architecture 3D des rides biofilm des colonies ou le / EPS seule organisation de la morphologie des cellules. Les barres d&#39;échelle de gauche à droite:. 5 mm, 100 pm, 2 pm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.925 mM </td><td> potassium dihydrogénophosphate </td></tr><tr><td> 3.075 mM </td><td> de phosphate de potassium dibasique </td></tr><tr><td> 100 mM </td><td> 3- (N - morpholino) propanesulfonique acide, à pH 7,1 </td></tr><tr><td> 2 mM </td><td> chlorure de magnésium hexahydraté </td></tr><tr><td> 700 pM </td><td> chlorure de calcium anhydre </td></tr><tr><td> 50 uM d&#39; un </td><td rowspan="2"> fer (III) hexahydraté </td></tr><tr><td> 125 uM b </td></tr><tr><td> 1 pm </td><td> le chlorure de zinc anhydre </td></tr><tr><td> 2 pm </td><td> le chlorhydrate de thiamine </td></tr><tr><td> 50 pg / ml </td><td> tryptophane </td></tr><tr><td> 50 pg / ml </td><td> phénylalanine </td></tr><tr><td> 50 pg / ml </td><td> thréonine </td></tr><tr><td> 0,5% (v / v) </td><td> glycérol anhydre </td&gt; </tr><tr><td> 0,5% (p / v) </td><td> les sels monosodiques d&#39;acide L-glutamique hydrate </td></tr><tr><td colspan="2"> un pour le dosage de la pellicule, b pour le dosage d&#39; un biofilm </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Composition finale 1x MSgg utilisée dans cette étude.

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Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Méthodologies pour l&#39;étude<em&gt; B. subtilis</em&gt; biofilms comme un modèle pour Caractériser Inhibiteurs biofilm petites molécules

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

methodologies-for-studying-b-subtilis-biofilms-as-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

15.0K vues.  Weizmann Institute of Science. This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Vidéo: Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modèle murin de CD40-activation des cellules B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Recherche

Immunologie et infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

Dans la formation de biofilms in vitro dans une diapositive Chambre de 8 puits

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

L&#39;utilisation du modèle EpiAirway pour Caractériser long terme Interactions hôte-pathogène

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Analyse unicellulaire des<emBacillus subtilis> Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Kératite herpétique récurrente stromale chez la souris, un modèle pour l&#39;étude de l&#39;homme HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infection expérimentale avec<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En tant que modèle pour l&#39;étude de l&#39;hôte Réponses Interféron-y

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modèle murin du Groupe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonisation

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d&#39;un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...