Este trabajo fue financiado por Singapur NRF comunión (NRF-2011NRF-NRFF001-025), así como CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

NOTA: El ARN de interés en el contexto de este estudio es un fragmento de AR 3&#39;UTR. 1. Preparación de ARN marcado con biotina <ol><li> Para obtener el ARN, amplificar T7-AR-oligo por PCR, seguido por la transcripción in vitro utilizando un kit comercial y siguiendo las instrucciones del fabricante 11. NOTA: Los cebadores para PCR se enumeran en la Tabla 4: T7-AR-F y T7-AR-R. </li><li> Para el control de la unión no específica, amplificar una secuencia parcial del ADN de luciferasa de luciérnaga (FL) mediante PCR a partir psiCHECK-2 plásmido, seguido por la transcripción in vitro. NOTA: Los cebadores para PCR se enumeran en la Tabla 4: hluc (+) - T7-sonda-F y hluc (+) - sonda-R Tabla 4 Secuencias de molde y los cebadores para la amplificación por PCR... </li><li> Para un 50 l de reacción de PCR, mezclar 50 ng de ADN (oligo o plásmido), 4 dNTPs l (2,5 mM de cada dNTP individuales), 5 l de 10x tampón de reacción, 1 l 2,5 U / &amp; #181; l de ADN polimerasa, 2 l 10 mM de cebador directo, 2 l 10 mM cebador inverso, y agua libre de nucleasa. <ol><li> Ejecutar la amplificación por PCR en un termociclador usando el siguiente programa. Paso 1: un ciclo de 95 ° C durante 2 min; Paso 2: 35 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos (AR) o 60 segundos (FL); Paso 3: un ciclo de 72 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> Sintetizar ARN con biotina utilizando un kit de transcripción in vitro siguiendo las instrucciones del fabricante 11. En este experimento, utilizar productos de PCR como plantillas para la síntesis de ARN. Para una reacción de 20 l transcripción in vitro, mezclar 200 ng de ADN amplificado por PCR, 2 l de cada NTP individual, 1 l 10 mM de biotina-CTP, tampón de reacción de 2 l de 10x, y 2 l de ARN polimerasa de T7. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 4 h. </li><li> Después de la transcripción in vitro, mezcla de reacción tratamiento con 1 l 2 U de DNasa / l a 37 &amp; #176; C durante 15 minutos para degradar la plantilla de ADN. Por último, se diluye la ARN biotinilado a un volumen total de 60 l para la purificación posterior. </li><li> Se purifica ARN con biotina para eliminar las sales y los nucleótidos no incorporados mediante el uso de columnas de purificación siguiendo las instrucciones del fabricante 12. Medir la concentración de ARN y se almacena a -80 ° C durante pull-down ensayos posteriores. </li><li> Para asegurar la estructura secundaria apropiada para el ARN de interés por la interacción de ARN-proteína, de calor 50 l de ARN biotinilado (50 pM) a 90 ° C durante 2 min, enfriar en hielo durante 2 min, a continuación, suministrar con 50 l de 2x tampón de la estructura del ARN (Tabla 3), y permitir el plegamiento del ARN a TA durante 30 min 13,14. </li></ol> 2. Preparación de perlas de ARN conjugado NOTA: Utilice un soporte magnético para la separación de las perlas magnéticas y sobrenadante. <ol><li> Volver a suspender las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en el vial original mediante una breve vortexing siguiendo las instrucciones del fabricante. Transferir 150 l perlas se volvieron a suspender a un tubo de 1,5 ml. Se coloca el tubo en el imán durante 1 min. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas. NOTA: En los ensayos de pull-down de ARN, cuando una alícuota de perlas se volvieron a suspender a partir vial original, utilizar 50 perlas l para un ensayo seguido por el Western Blot, y 200 bolas l para un ensayo seguido de la EM. </li><li> Lavar perlas una vez por la re-suspensión de sedimento de perlas con 1 ml de recomendada por el fabricante 1x W &amp; B tampón (Tabla 3) (unión y lavado), seguido de girar el tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente en un rotador. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas. </li><li> Para inactivar la RNasa sobre perlas, perlas de lavar dos veces, cada vez por la re-suspensión de sedimento de perlas con 400 l de tampón A. El tampón A es una solución alcalina que contiene NaOH 0,1 M y 0,05 M NaCl (Tabla 3). Girar el tubo durante 2 min a temperatura ambiente en un rotador. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas. </li> &lt;li&gt; Para eliminar NaOH a partir de perlas, perlas de lavar dos veces, cada vez por la re-suspensión de sedimento de perlas con 400 l de tampón B (Tabla 3), seguido por la rotación del tubo durante 2 minutos a temperatura ambiente en un rotador. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas. </li><li> Volver a suspender sedimento de perlas con 300 l 2 x W &amp; B tampón, perlas dividida en partes iguales y transferir en tres tubos de 1,5 ml (100 granos l por tubo). Suministrar los tubos que contienen de talones con 100 l de RNasa libre de agua, 100 l con biotina ARN FL y 100 l biotina AR 3&#39;UTR ARN, respectivamente. </li><li> Incubar cada mezcla de microesferas durante 1 hr a temperatura ambiente con rotación. Colocar los tubos en el imán durante 1 min. Desechar todo el sobrenadante. Mantener los gránulos de talón. </li><li> Lavar perlas dos veces, cada vez por la re-suspensión de cada sedimento de perlas con 400 l 1x W &amp; B tampón, seguido de tubos giratorio durante 5 min a temperatura ambiente en un rotador. </li><li> Colocar los tubos en el imán durante 1 min. Desechar todo el sobrenadante. Resuspender cada grano pellet con 50 l de tampón de aislamiento nuclear (Tabla 3). </li></ol> 3. Aislamiento de preadipocitos y adipogénesis inducción <ol><li> Como se ha descrito en publicaciones anteriores 5, diseccionar preadipocitos de la almohadilla de grasa marrón interescapular (C57BL6 ratones de tipo salvaje, 3 semanas de edad). </li><li> Crecer y diferenciarse in vitro los preadipocitos 5. Las células están listas para la aplicación aguas abajo 4-5 días después de la iniciación de la diferenciación. </li></ol> 4. Preparación de lisado celular de los adipocitos primarios NOTA: Asegúrese de que todos los procedimientos de preparación de lisado celular se realizan en el hielo, y todos los tampones se enfrió en hielo. Pre-térmica del homogeneizadores de vidrio Dounce en hielo. <ol><li> Crecer y diferenciarse preadipocitos en 15 cm platos 5 (ver sección 3.2). Cada plato proporciona células adecuadas para el ensayo desplegable uno ARN. En el día 4 o 5 días de diferenciación, medio de cultivo celular de descarte, y ce lavarLLS una vez con PBS 1x. </li><li> Para cosechar las células, añadir 10 a 15 ml de 1x PBS a las células, raspar para recoger las células en un tubo de 50 ml, y las células de pellets por centrifugación a 200 xg durante 5 min a TA. Desechar el sobrenadante mediante el uso de 1 ml pipeta. </li><li> Resuspender pellet de células en 2 ml de tampón hipotónico (Tabla 3), e incubar las células en hielo durante 15 min. La transferencia de células a un homogeneizador de vidrio Dounce de 15 ml, y las células de cizalla mecánicamente en hielo con 20 golpes. </li><li> Pellets núcleos de las células por centrifugación a 3.300 xg durante 15 min a 4 ° C. Mantenga pellets núcleos en hielo para su uso posterior (ver sección 4.6). Transferir el sobrenadante a tubos de 1,5 ml, añadir 3M KCl al sobrenadante para obtener una concentración final de 150 mM, y centrifugado a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Después de la centrifugación, retirar con cuidado lipidlayeron la parte superior mediante el uso de una pipeta de 1 ml, y recoger el sobrenadante como el lisado celular citoplasmática. </li><li> Resuspender pellet núcleos (ver sección 4.4) en 1 ml de tampón de aislamiento nuclear. Tnúcleos RANSFERENCIA a un homogeneizador de vidrio Dounce de 15 ml usando una pipeta de 1 ml, y los núcleos de cizalla mecánica sobre hielo con 100 golpes. Sedimentar los restos nucleares por centrifugación a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C, y recoger el sobrenadante como el lisado celular nuclear. </li><li> O bien combinar los lisados ​​celulares nucleares y citoplasmáticos, o utilizar cada fracción por separado, para su aplicación desplegable aguas abajo. En este experimento de demostración, estas dos fracciones de lisado de células se combinaron a una relación en volumen de 1: 1. </li><li> Añadir inhibidor de RNasa a este lisado celular no fraccionada para obtener una concentración final de 0,5 U / l. Destinará 100 l de lisado celular como control de entrada para el Western Blot 15. </li></ol> 5. encuadernación y elución de RBP <ol><li> lisado de células de Split en tres alícuotas iguales (lisado de células de 1 ml en un tubo de 1,5 ml), e incubar con blanco, FL RNA-conjugado y perlas de AR 3&#39;UTR ARN-conjugados (véase la sección 2.8), respectivamente, durante 3 horas a 4 ° docon la rotación. </li><li> Colocar los tubos en el imán durante 1 min. Recoger el sobrenadante usando una pipeta de 1 ml, seguido de aislamiento de ARN a partir del sobrenadante para confirmar RNA integralidad. Aislar el ARN mediante el uso de una solución de tiocianato de guanidinio-fenol ácido siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla 2). Evaluar la integridad de ARN mediante el análisis de 28S y 18S subunidades de ARN ribosómico. Mantener los gránulos de bolas en hielo. </li><li> Lavar las perlas magnéticas seis veces, cada vez por resuspensión cada sedimento de perlas con 1 ml de tampón de aislamiento nuclear que contiene 40 U de RNasa inhibidor y 0,25% de Igepal, seguido de tubos giratorio para 2 min a temperatura ambiente en un rotador. Utilice un soporte magnético para la separación de las perlas magnéticas y sobrenadante. Desechar todo el sobrenadante. Mantener los gránulos de bolas en hielo. </li><li> Utilice los pasos siguientes para eluir los complejos de ARN-proteína de los granos para el Western Blot. En primer lugar, volver a suspender cada sedimento de perlas en 75 l de tampón de aislamiento nuclear; a continuación, se añaden 25 l de 4x western blot carga buffer (que contiene SDS) para obtener un volumen total de 100 l. Finalmente, hervir perlas en esta solución 100 l a 95 ° C durante 5 min. NOTA: Utilice los siguientes pasos para eluir los complejos de ARN-proteína de los granos para la EM. Paso 1: resuspender cada sedimento de perlas en 100 l de tampón de elución (Tabla 3); PASO 2: incubar muestras de perlas durante 2-3 horas a temperatura ambiente con rotación; PASO 3: centrífuga y recoger el sobrenadante que contiene proteína; PASO 4: concentrar soluciones de proteínas de 20-30 l antes de su presentación para la EM. </li><li> Centrifugar cada 100 l de muestra de perlas a 12.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C, y recoger el líquido sobrenadante. Alícuota de sobrenadante de 15 l para el análisis de western blot (ver sección 6.1 y 6.2). Sonda de la membrana resultante con el anticuerpo monoclonal Hur ratón diluido (dilución 1: 1000), durante la noche. </li></ol> 6. Transferencia Western para la verificación de las prácticas comerciales restrictivas <ol><li> Las prácticas comerciales restrictivas separadas por SDS-PAGE utilizando técnicas estándar. </li><li> realizar nospopa secante utilizando técnicas estándar mediante el sondeo de las prácticas comerciales restrictivas asociados con el ARN de interés. NOTA: En este experimento de demostración, se utilizó el anticuerpo monoclonal de ratón Hur para la inmunodetección de la proteína Hur. </li><li> Incubar la membrana resultante con el anticuerpo Hur diluido (dilución 1: 1000) en 5% w / v de leche en polvo sin grasa, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 al 4 ° C con agitación suave, durante la noche. Lavar la membrana tres veces con 1x TBST. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario (de cabra anti-IgG de ratón-HRP) a temperatura ambiente durante 1 hr. membrana Wash. Desarrollar y señal de grabación. </li></ol>

<ol>
	<li>Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis.">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis.">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li><li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+exploits+three-dimensional+genome+architecture+to+spread+across+the+X-chromosome.">The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome.</a> Science. 341 (6147), 1237973 (2013).</li><li>Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+transcriptional+regulatory+circuit+drives+thermogenic+adipocyte+differentiation.">A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation.</a> Mol Cell. 55, 372-382 (2014).</li><li>Alvarez-Dominguez, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development.">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li><li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HADHB,+HuR,+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression.">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li><li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+of+HuR+and+poly(C)-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3&#180;+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA.">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3&#180; untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li><li>K&#246;nig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-RNA+interactions:+new+genomic+technologies+and+perspectives.">Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives.</a> Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).</li><li>Ferr&#232;, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+protein-lncRNA+interaction.">Revealing protein-lncRNA interaction.</a> Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).</li><li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia.">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li><li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases.">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes.">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome.">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements.">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins.">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

lncRNAs y las prácticas comerciales restrictivas tienen un papel vital en la salud y la enfermedad, sin embargo los mecanismos moleculares de estas moléculas son poco conocidos. Identificación de proteínas que interactúan con moléculas lncRNA es un paso clave para dilucidar los mecanismos de regulación. El enriquecimiento de las prácticas comerciales restrictivas por el sistema de ensayo desplegable ARN se basa en la captura en solución de interactuar complejo de manera que las proteínas de un lisado de células se pueden extraer de forma selectiva usando los cebos de ARN biotinilado unido a perlas magnéticas de estreptavidina. Varios otros métodos tales como chirrido, CARTA y RAP pueden lograr el mismo objetivo, sin embargo, estos métodos requiere más esfuerzo para configurar que el ARN desplegable 16,17,18 técnica. La principal fortaleza de ARN desplegable es que es relativamente un protocolo sencillo y fácil de realizar. Tanto CHIRRIDO y el PAR implican una etapa de reticulación que conserva de forma natural se producen complejos de ARN-proteína y el diseño de un conjunto completo de oligonucleótidos antisentido (90 nucleOtides larga en el RAP, y 20 nucleótidos de longitud en Chirp) embaldosar toda la diana de ARN 16,17,18. El plegamiento del ARN es un paso crítico en los ensayos de pull-down de ARN. La principal limitación de este protocolo es que los ARN diana se sintetizan in vitro y no pueden plegarse correctamente en la estructura nativa para permitir la unión con su RBP (s) apropiada. ARNs no nativos mal plegadas pueden fallar ya sea para formar ARN-proteína interacciones e invalidar los ensayos funcionales, o interacciones de forma que sólo se producen in vitro en condiciones no fisiológicas. Aunque el protocolo desplegable descrito aquí adoptó un procedimiento bien conocido para el plegamiento del ARN 13,14 (ver sección 1.7), que no garantiza el plegamiento adecuado para otros transcritos de ARN. ARN desplegable es a menudo junto con RIP como un enfoque complementario para detectar el ARN (s), vinculado por el RBP de interés 19. Otro paso crítico en este protocolo es la eliminación de la fracción lipídica del total de célulaslisado (ver sección 4.5) debido a la abundancia alta de lípidos en los adipocitos maduros presenta un gran desafío técnico. El protocolo descrito aquí está especialmente desarrollado para su uso con los adipocitos. Sin embargo, los componentes básicos de este protocolo y el rigor de todos los tampones usados ​​pueden ser modificadas y adaptadas para su aplicación a otros modelos de cultivo celular. Para tejidos que tienen altos niveles de RNasa endógena, diferentes protocolos desplegables de ARN se pueden aplicar. RNA desplegable, que utiliza ARN de interés para identificar las prácticas comerciales restrictivas asociados, es una técnica eficaz y eficiente para sondear las funciones fundamentales y los mecanismos de lncRNAs, que tienen una amplia gama de funciones en las células humanas. El desarrollo futuro de la captura basada en ARN, incluyendo ARN desplegable, será necesaria para hacer frente a los retos con la definición de los componentes, el montaje y la función de los complejos de proteínas y ARN, así como para generar suficientes las prácticas comerciales restrictivas de bajos abundantes complejos de ARN-proteína para la EM.

A correction to the author list was made to: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Prácticas comerciales restrictivas son proteínas que se unen al ARN de doble o de cadena sencilla en las células y participan en la formación de complejos de ARN-proteína. Las prácticas comerciales restrictivas pueden unir una variedad de especies de ARN, incluyendo ARN no codificantes de ARNm y largos (lncRNAs), y ejercer su influencia a nivel post-transcripcional. Ambas prácticas comerciales restrictivas y lncRNAs están surgiendo como nuevos reguladores en el desarrollo adiposo y funcionan 1,2,3. Para entender el mecanismo de RBP- y regulación lncRNA mediada de vías celulares, a menudo es necesario para detectar la interacción entre una molécula de ARN específico y una o varias prácticas comerciales restrictivas, y, a veces, para identificar el espectro completo de proteínas asociados de un ARN transcripción. Sin embargo, el experimento puede ser difícil debido al alto contenido de lípidos en los adipocitos. El protocolo desplegable RNA descrito aquí se puede emplear para recuperar los compañeros de la proteína de un ARN específico de los lisados ​​de adipocitos de cultivos primarios 4,5. Justificación de este protoCol se resume de la siguiente manera. Un cebo de ARN es transcrito in vitro a partir de un molde de ADN, marcado con biotina y conjugado a perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina 4. El cebo de ARN se incuba con lisados ​​celulares para permitir la formación de complejos de ARN-proteína, que se extraen posteriormente hacia abajo en un soporte magnético. Más específicamente, el protocolo desplegable RNA describe a continuación utilizar un fragmento de ARN de AR 3&#39;UTR como el cebo para recuperar proteína Hur, un RBP expresado universalmente unido a 3&#39;UTR de ARNm de 6,7, de theadipocytelysate de cultivo primario. Para probar la especificidad de unión de este ensayo, un RNAas no relevantes así como perlas de estreptavidina en blanco se incluyen como control. Este protocolo es compatible con el Western Blot o espectrometría de masas (MS) para confirmar la captura de un RBP específica o para identificar el repertorio completo de las prácticas comerciales restrictivas capturados 8, respectivamente. Hay disponibles varias técnicas para estudiar la interacción proteína-ARNs. Para revelar los ARN unidos por un determinado RBP, RIP (ARN inmunoprecipitación) y CLIP (reticulación UV e inmunoprecipitación) se puede aplicar. Por el contrario, para identificar proteínas asociados de un determinado ARN, ARN desplegable, Chirp (cromatina aislamiento mediante la purificación del ARN), gráfico (análisis de hibridación de captura de dianas de ARN) y el PAR (purificación de ARN antisentido) se puede aplicar. En comparación con los posteriores, la técnica desplegable ARN requiere menos esfuerzo de configurar. Puede ser empleado para capturar proteínas in vitro e in vivo. El enfoque in vivo de ARN desplegable, que es técnicamente más difícil que su homólogo in vitro, preserva las interacciones ARN-proteína por reticulación en las células, capta los ARN aptamer etiquetado de interés a partir de células, y, posteriormente, detecta las prácticas comerciales restrictivas consolidados. ARN desplegable se puede utilizar para enriquecer las prácticas comerciales restrictivas bajas abundantes, y para aislar e identificar los complejos de proteínas y ARN que tienen diversos roles funcionales en el control de la regulación celular 9,10 </sarriba&gt;.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Major materials used in this study.</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript kit</td>
			<td>&#160;Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin-14-CTP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucAway spin columns&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (1&#215;PBS)</td>
			<td>&#160;HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pfu Turbo DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIsure</td>
			<td>&#160;Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Major equipment used in this study.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend X1R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Rad T100 thermal cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BOECO rotator Multi Bio RS-24&#160;</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 magnet&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) están emergiendo como una capa de regulación en el desarrollo y la función del tejido adiposo. Prácticas comerciales restrictivas juegan un papel clave en la regulación de la expresión génica a nivel posttranscriptional al afectar la eficiencia de la estabilidad y de la traducción de ARNm diana. técnica desplegable RNA ha sido ampliamente utilizado para estudiar la interacción de ARN-proteína, que es necesaria para dilucidar el mecanismo de la función de las prácticas comerciales restrictivas &quot;, así como largos ARN no codificante&quot; (lncRNAs) subyacente. Sin embargo, la alta abundancia de lípidos en los adipocitos plantea un desafío técnico en la realización de este experimento. Aquí un protocolo desplegable ARN detallada está optimizado para el cultivo de adipocitos primaria. Un fragmento de ARN a partir de (AR) 3 &#39;no traducida del receptor de andrógenos (3&#39;UTR) que contiene un elementwas adenilato-uridylate ricos utilizados como un ejemplo para demostrar cómo recuperar su socio RBP, proteínas Hur, de lystate adipocito. El método descrito aquí se puede aplicar para detectar las interacciones entrePrácticas comerciales restrictivas y ARN no codificantes, así como entre las prácticas comerciales restrictivas y ARN de codificación.

En este experimento de demostración, un fragmento de ARN AR se utilizó como cebo para capturar su proteína de unión Hur. Tanto un ARN cebo FL que no es relevante para la proteína Hur, y una alícuota de perlas de estreptavidina en blanco no conjugados sirvieron como controles negativos. interacciones ARN-proteína puede ocurrir ya sea en el núcleo o citoplasma, y ​​este protocolo desplegable se puede aplicar a total o fraccionado lisados ​​celulares (citoplásmicos o nuclear). Análisis de proteínas por Western Blot muestra que la muestra de 15 lisado celular no fraccionada l (ver sección 4.8), como control de entrada sin cordón, dio un resultado positivo, lo que indica que la proteína Hur se detecta en el lisado de los adipocitos de cultivo primario del ratón mediante el uso de el anticuerpo monoclonal. La fracción de elución de ARN AR dio un resultado positivo, que indica que se detectó la proteína Hur en el lisado de los adipocitos mediante el uso de las perlas de RNA-conjugados AR para el ensayo de pull-down RNA. Tanto la fracción de elución de ARN FL y la bmuestra lacio grano dio resultados negativos, lo que indica que las interacciones no específicas entre fragmento de ARN y la proteína FL Hur, así como entre las perlas en blanco y proteínas Hur no son detectables por este enfoque pull-down RNA. Los resultados de estos dos controles negativos también indican que una interacción específica entre el fragmento de ARN y la proteína AR Hur se detecta con éxito por el protocolo desplegable RNA se describe aquí. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54207/54207fig1.jpg" /> Figura 1: Western Blot Verificación de Hur capturado por el ARN desplegable Ensayos de entrada: reconstituida lisado celular (citoplasmática + lisado nuclear);. Beads: la muestra de perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en blanco; FL ARN: perlas de estreptavidina unida con el ARNm FL; AR ARN 3&#39;UTR: perlas de estreptavidina unida con el 3&#39;UTR del mRNA AR; El anticuerpo primario: anticuerpo monoclonal de ratón Hur; anticuerpo secundario: de cabra anti-mouse IgG-HRP; Abreviatura, FL: luciferasa de luciérnaga, AR: receptor de andrógenos; <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54207/54207fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Centrífugo </td></tr><tr><td> termociclador </td></tr><tr><td> espectrofotómetro </td></tr><tr><td> rotador </td></tr><tr><td> electroforesis en gel de proteína y aparato de transferencia </td></tr><tr><td> Imán </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Los principales equipos utilizados en este estudio Los principales equipos utilizados en este estudio.. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> En kit de transcripción in vitro </td></tr><tr><td> ARN biotinilado </td></tr><tr><td> Girar la columna para la recuperación de fragmentos de ADN y ARN </td></tr><tr><td> perlas magnéticas de estreptavidina </td></tr><tr><td> anticuerpo monoclonal de ratón Hur </td></tr><tr><td> De cabra anti-IgG de ratón-HRP </td></tr><tr><td> -Nucleasa libre de agua de calidad de biología molecular </td></tr><tr><td> solución salina tampón fosfato </td></tr><tr><td> RNasa inhibidor </td></tr><tr><td> inhibidor de la proteasa </td></tr><tr><td> Pfu ADN polimerasa </td></tr><tr><td> solución de tiocianato de guanidinio-fenol ácido </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Principales Reactivos utilizados en este estudio reactivos principales utilizados en este estudio.. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tampón de la estructura del ARN 2x </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 0,2 M KCl </td></tr> &lt;tr&gt; <td> MgCl2 20 mM </td></tr><tr><td> DTT 2 mM </td></tr><tr><td> 0,8 U / l inhibidor de RNasa </td></tr><tr><td> tampón A </td></tr><tr><td> NaOH 0,1 M </td></tr><tr><td> 0,05 M NaCl </td></tr><tr><td> tampón B </td></tr><tr><td> 0,1 M NaCl </td></tr><tr><td> 1x W &amp; B (de unión y de lavado) tampón </td></tr><tr><td> 5 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td></tr><tr><td> 1 x tampón hipotónico </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> KCl 10 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 2 mM </td></tr><tr><td> DTT 1 mM </td></tr><tr><td> PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> inhibidor de la proteasa 1x </td></tr><tr><td> 1x tampón de aislamiento Nuclear </td></tr><tr><td> 25 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> KCl 150 mM </td></tr><tr><html><td> MgCl2 2 mM </td></tr><tr><td> DTT 1 mM </td></tr><tr><td> 0,5% IGEPAL (o 0,25% IGEPAL para la elución de las prácticas comerciales restrictivas) </td></tr><tr><td> PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> inhibidor de la proteasa 1x </td></tr><tr><td> 0,4 U l / inhibidor de RNasa (o 40 U / ml de RNasa inhibidor para la elución de las prácticas comerciales restrictivas) </td></tr><tr><td> 1 x tampón de elución </td></tr><tr><td> biotina 2 mM en PBS 1x </td></tr></tbody></table> . Tabla 3: Soluciones principales utilizados en este estudio tampón 2x estructura del ARN (ver sección 1.7); Tampón A (ver sección 2.3); Tampón B (ver sección 2.4); 1x W &amp; B (de unión y de lavado) tampón (ver secciones 2.2, 2.5, 2.7); 1 x tampón hipotónico (ver sección 4.3); 1x tampón de aislamiento nuclear (ver secciones 2.8, 4.6, 5.3, 5.4); 1x tampón de elución (ver nota siguiente sección 5.4). lways &quot;&gt; <tbody><tr><td> Plantilla y cebadores </td><td colspan="2"> secuencias </td></tr><tr><td> T7-oligo-AR </td><td colspan="2"> 5&#39;-TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCT GGG CTT TTT TTT CTT TCT TCT TCT TTT CTT CTC TCT TCT TCC CTC CCT AGC TTA TGA CCG TGG CAG TCT 3 &#39; </td></tr><tr><td> T7-AR-F </td><td colspan="2"> 5&#39;-CTA ATA CGA CTC ACT ATA G -3 &#39; </td></tr><tr><td> T7-AR-R </td><td colspan="2"> 5&#39;-CTG AGA CCA CGG TCA TAA GC-3 &#39; </td></tr><tr><td> hluc (+) - T7-sonda-F </td><td colspan="2"> 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGCCCCTGCTAACGACATTTACAACGAG-3 &#39; </td></tr><tr><td> hluc (+) - sonda-R </td><td colspan="2"> 5&#39;-CATAATCATAGGGCCGCGCACACAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Secuencias de la plantilla y los cebadores para la amplificación por PCR T7-oligo-AR:. Plantilla de ADN para la amplificación por PCR (véase la sección 10.1); T7-AR-F: cebador directo para la amplificación por PCR (ver sección 1.1); T7-AR-R: cebador inverso para la amplificación por PCR (ver sección 1.1); hluc (+) - T7-sonda-F: cebador directo para la amplificación por PCR (ver sección 1.2); hluc (+) - sonda-R: cebador inverso para la amplificación por PCR (ver sección 1.2).

Watch this Scientific Journal Video about Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture at JoVE.com

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Un protocolo desplegable ARN se optimiza aquí para la detección de interacciones entre proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) y no codificante, así como los ARN de codificación. Un fragmento de ARN de receptor de andrógenos (AR) se utilizó como un ejemplo para demostrar cómo recuperar su RBP de lystate de adipocitos marrones primarios.

La detección de las proteínas de unión a ARN por<em&gt; In Vitro</em&gt; ARN desplegable de adipocitos Cultura

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

23.5K vistas.  Duke-NUS Medical School.  Un protocolo desplegable ARN se optimiza aquí para la detección de interacciones entre proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) y no codificante, así como los ARN de codificación. Un fragmento de ARN de receptor de andrógenos (AR) se utilizó como un ejemplo para demostrar cómo recuperar su RBP de lystate de adipocitos marrones primarios. 

Video: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Investigación

Biología

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the calcium-binding protein known as calmodulin (CaM)1,2. CaM is involved at multiple levels in almost all cellular processes, including apoptosis, metabolism, smooth muscle contraction, synaptic plasticity, nerve growth, inflammation and the immune response. A number of proteins help regulate these pathways through their interaction with CaM. Many of these interactions depend on the conformation of CaM, which is distinctly different when bound to Ca2+ (Ca2+-CaM) as opposed to its Ca2+-free state (ApoCaM)3.
While most target proteins bind Ca2+-CaM, certain proteins only bind to ApoCaM. Some bind CaM through their IQ-domain, including neuromodulin4, neurogranin (Ng)5, and certain myosins6. These proteins have been shown to play important roles in presynaptic function7, postsynaptic function8, and muscle contraction9, respectively. Their ability to bind and release CaM in the absence or presence of Ca2+ is pivotal in their function. In contrast, many proteins only bind Ca2+-CaM and require this binding for their activation. Examples include myosin light chain kinase10, Ca2+/CaM-dependent kinases (CaMKs)11 and phosphatases (e.g. calcineurin)12, and spectrin kinase13, which have a variety of direct and downstream effects14.
The effects of these proteins on cellular function are often dependent on their ability to bind to CaM in a Ca2+-dependent manner. For example, we tested the relevance of Ng-CaM binding in synaptic function and how different mutations affect this binding. We generated a GFP-tagged Ng construct with specific mutations in the IQ-domain that would change the ability of Ng to bind CaM in a Ca2+-dependent manner. The study of these different mutations gave us great insight into important processes involved in synaptic function8,15. However, in such studies, it is essential to demonstrate that the mutated proteins have the expected altered binding to CaM.
Here, we present a method for testing the ability of proteins to bind to CaM in the presence or absence of Ca2+, using CaMKII and Ng as examples. This method is a form of affinity chromatography referred to as a CaM pull-down assay. It uses CaM-Sepharose beads to test proteins that bind to CaM and the influence of Ca2+ on this binding. It is considerably more time efficient and requires less protein relative to column chromatography and other assays. Altogether, this provides a valuable tool to explore Ca2+/CaM signaling and proteins that interact with CaM.

Calmodulin (CaM) pull-down assay is an effective way to investigate the interaction of CaM with various proteins. This method uses CaM-sepharose beads for efficient and specific analysis of CaM-binding proteins. This provides an important tool to explore CaM signaling in cellular function.

Desplegable de proteínas de unión a calmodulina

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

En la transcripción in vitro y la nivelación de mRNA de luciferasa Gaussia Seguido por transfección de células HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Mejorada del Norte Blot Detección de los Pequeños ARN Especies en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments for T2D, more physiologically relevant in vitro adipocyte models are required. This study describes a new technique to isolate and culture mature human adipocytes. This method is entitled MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture), and compared to other adipocyte in vitro models, MAAC possesses an adipogenic gene signature that is the closest to freshly isolated mature adipocytes. Using MAAC, adipocytes can be cultured from lean and obese patients, different adipose depots, co-cultured with different cell types, and importantly, can be kept in culture for 2 weeks. Functional experiments can also be performed on MAAC including glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis. Moreover, MAAC responds robustly to diverse pharmacological agonism and can be used to study adipocyte phenotypic changes, including the transdifferentiation of white adipocytes into brown-like fat cells.

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membrane mature adipocyte aggregate culture (MAAC) is a new method to culture mature human adipocytes. Here we detail how to isolate adipocytes from human adipose and how to set up MAAC.

Aislamiento y cultivo de adipocitos maduros humanos utilizando cultivos agregados de adipocitos maduros de membrana (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...