Diese Arbeit wurde von Singapur NRF Gemeinschaft (NRF-2011NRF-NRFF001-025) sowie CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) finanziert.

HINWEIS: Die RNA von Interesse im Rahmen dieser Studie ist ein Fragment von AR 3&#39;UTR. 1. Herstellung von Biotin-markierter RNA <ol><li> Um die RNA zu erhalten, T7-AR-Oligos durch PCR, gefolgt von in vitro Transkription unter Verwendung eines kommerziellen Kits und nach den Anweisungen des Herstellers 11 amplifizieren. HINWEIS: T7-AR-F und T7-AR-R: Primer für die PCR sind in Tabelle 4 aufgeführt. </li><li> Für nicht-spezifische Bindungskontrolle, amplifizieren eine Teilsequenz der Glühwürmchen - Luciferase (FL) DNA durch PCR aus psiCHECK-2 - Plasmid, gefolgt von in vitro Transkription. HINWEIS: Primer für die PCR sind in Tabelle 4: hluc (+) - T7-probe-F und hluc (+) - Sonde-R Tabelle 4 Sequenzen von Template und Primer für die PCR - Amplifikation... </li><li> Für eine 50 &amp; mgr; l PCR-Reaktion, mischen 50 ng DNA (Oligo oder Plasmid), 4 ul dNTPs (2,5 mM jedes einzelnen dNTP), 5 ul 10x Reaktionspuffer, 1 ul 2,5 U / &amp; #181; l DNA-Polymerase, 2 &amp; mgr; l 10 &amp; mgr; M Vorwärtsprimer, 2 ul 10 uM Reverse-Primer und Nuklease-freies Wasser. <ol><li> Führen Sie die PCR-Amplifikation in einem Thermocycler das folgende Programm. Schritt 1: ein Zyklus von 95 ° C für 2 min; Schritt 2: 35 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 72 ° C für 30 sec (AR) oder 60 s (FL); Schritt 3: ein Zyklus von 72 ° C für 10 min. </li></ol></li><li> Synthetisieren biotinylierten RNAs eine in vitro Transcription Kit folgenden Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 11. In diesem Experiment verwenden PCR-Produkte als Matrizen für die RNA-Synthese. Für eine 20 &amp; mgr; l in vitro Transkriptionsreaktion, Mischungs 200 ng PCR amplifizierte DNA, 2 &amp; mgr; l jedes einzelnen NTP, 1 ul 10 mM Biotin-CTP, 2 ul 10x Reaktionspuffer und 2 &amp; mgr; l T7 - RNA - Polymerase. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 4 Stunden. </li><li> Folgende in vitro Transkription, treat Reaktionsmischung mit 1 ul 2 U / &amp; mgr; l DNase bei 37 &amp; #176; C für 15 min Templat-DNA abzubauen. Schließlich wird die biotinylierte RNA auf ein Gesamtvolumen von 60 ul zur anschließenden Reinigung verdünnen. </li><li> Reinige biotinylierten RNAs Salze und nicht eingebauten Nukleotide zu entfernen , indem Reinigungssäulen verwendet folgenden Anweisungen des Herstellers 12. Messen Sie RNA-Konzentration und bei -80 ° C für die nachfolgende Pull-down-Assays. </li><li> Um eine ordnungsgemäße Sekundärstruktur für die RNA von Interesse in der RNA-Protein - Wechselwirkung, Wärme 50 ul biotinyliertes RNA (50 pM) bei 90 ° C für 2 min, Chill auf Eis für 2 min, dann liefern mit 50 ul 2x RNA - Struktur - Puffer (Tabelle 3) und ermöglichen die RNA bei RT für 30 min Falten 13,14. </li></ol> 2. Herstellung von RNA-konjugierten Beads HINWEIS: Verwenden Sie einen Magnetfuß zur Trennung der magnetischen Kügelchen und Überstand. <ol><li> Resuspendieren der Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen in der Originalflasche durch kurze Vortexing folgenden Anweisungen des Herstellers. Übertragen Sie 150 ul resuspendiert Kügelchen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Das Röhrchen wird auf Magneten für 1 min. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. HINWEIS: In der RNA Pull-down-Assays, wenn erneut suspendiert Perlen aus Originalfläschchen Aliquotierung, verwenden 50 ul Perlen für einen Test durch Western-Blot gefolgt, und 200 &amp; mgr; l Perlen für einen Test von MS gefolgt. </li><li> Waschen Perlen einmal durch Resuspendieren Wulst Pellet mit 1 ml der empfohlenen 1x W &amp; B des Herstellers (Bindungs- und Wasch) Puffer (Tabelle 3), gefolgt von den Röhrchen 5 Minuten bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. </li><li> Zu inaktivieren RNase on beads, wasche zweimal Perlen, jeweils durch Resuspendieren bead Pellet mit 400 ul Puffer A Puffer A ist eine alkalische Lösung , die 0,1 M NaOH und 0,05 M NaCl (Tabelle 3). Drehen Sie das Rohr für 2 Minuten bei Raumtemperatur in einem Rotator. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. </li> &lt;li&gt; Zum Entfernen NaOH aus Perlen, zweimal waschen Perlen, jedes Mal durch Resuspendieren Wulst Pellet mit 400 ul Puffer B (Tabelle 3), gefolgt von der Röhre 2 min bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. </li><li> Resuspendieren Wulst Pellet mit 300 ul 2x W &amp; B-Puffer, geteilt Perlen gleichmäßig und Transfer in drei 1,5-ml-Röhrchen (100 &amp; mgr; l Kügelchen pro Röhrchen). Versorgen Sie die Kügelchen enthaltende Röhrchen mit 100 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser, biotinyliert 100 ul FL RNA und 100 ul biotinyliertes AR 3&#39;UTR RNA sind. </li><li> Inkubieren jedes Wulstes Mischung für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rotation. Die Röhrchen auf Magnet für 1 min. Entsorgen Sie alle Überstand. Halten Sie Perle Pellets. </li><li> Zweimal waschen Perlen, jeweils durch jedes Wulstes Pellet mit 400 ul 1x W &amp; B-Puffer erneut suspendiert, gefolgt von Röhrchen für 5 min bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. </li><li> Die Röhrchen auf Magnet für 1 min. Entsorgen Sie alle Überstand. Resuspendieren jede Wulst pellet mit 50 ul Kernisolationspuffer (Tabelle 3). </li></ol> 3. Preadipozyten Isolierung und Adipogenese Induction <ol><li> Wie in 5 in früheren Veröffentlichungen beschrieben, sezieren Preadipozyten aus dem interskapulären braunen Fettpolster (C57BL6 Wildtyp - Mäusen, 3 Wochen alt). </li><li> Wachsen und in vitro Differenzierung der Präadipozyten 5. Zellen sind bereit für nachgeschaltete Anwendung 4-5 Tage nach Beginn der Differenzierung. </li></ol> 4. Herstellung von Zellysat von Primary Adipozyten HINWEIS: Stellen Sie sicher, alle Verfahren von Zelllysat Zubereitung auf Eis, und alle Puffer auf Eis gekühlt. Pre-Chill-Dounce-Glas Homogenisator auf Eis. <ol><li> Wachsen und unterscheiden Preadipozyten in 15 cm - Schalen 5 (siehe Abschnitt 3.2). Jedes Gericht bietet ausreichend Zellen für eine RNA-Pull-Down-Assay. Am Tag 4 oder 5. Tag der Differenzierung, der Verwerfungszellkulturmedium, und waschen ceLLS einmal mit 1x PBS. </li><li> Zur Ernte Zellen, fügen Sie 10-15 ml 1x PBS zu den Zellen, kratzen Zellen in einem 50-ml-Röhrchen und Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 200 g für 5 min bei RT zu sammeln. Überstand verwerfen unter Verwendung von 1 ml Pipette. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 2 ml hypotonischen Puffer (Tabelle 3), und für 15 min Zellen auf Eis inkubieren. Transfer-Zellen zu einem 15 ml-Dounce-Glas-Homogenisator und Scherzellen mechanisch auf Eis mit 20 Schlägen. </li><li> Pellet Zellkerne durch Zentrifugation bei 3.300 xg für 15 min bei 4 ° C. Halten Sie Kerne Pellets auf Eis für die weitere Verwendung (siehe Abschnitt 4.6). Überstand in 1,5 ml-Röhrchen, fügen 3M KCl gegen den Überstand zu einer Endkonzentration von 150 mM zu erhalten, und Schleudern bei 20.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation vorsichtig entfernen lipidlayeron oben unter Verwendung von 1 ml Pipette und sammeln Überstand als zytoplasmatische Zellysat. </li><li> Resuspendieren Kerne Pellet in 1 ml Kernisolationspuffer (siehe Abschnitt 4.4). Transfer Kerne in ein 15 ml-Dounce-Glas-Homogenisator unter Verwendung von 1 ml-Pipette und Scherkerne mechanisch auf Eis mit 100 Hüben. Kerntrümmer Pellet durch Zentrifugation bei 20.000 xg für 15 min bei 4 ° C und sammle Überstand als Kern zellulären Lysats. </li><li> Entweder verbinden die Kern- und Cytoplasma-Zellysaten oder jede Fraktion getrennt zu verwenden, für die nachfolgende Pull-Down-Anwendung. In diesem Beispiel Experiment wurden diese zwei Fraktionen von Zell-Lysat in einem Volumenverhältnis von 1: 1. </li><li> Hinzufügen RNase Inhibitor zu diesem Lysat unfraktioniertem Zelle zu einer Endkonzentration von 0,5 U / &amp; mgr; l zu erhalten. Beiseite 100 ul Zelllysat als Eingangskontrolle für Western - Blot - 15. </li></ol> 5. Bindung und Elution von RBP <ol><li> Split Zelllysat in drei gleiche Aliquots (1 ml Zelllysat in einem 1,5-ml-Röhrchen), und Inkubation mit leeren, FL RNA-konjugierten und AR 3&#39;UTR RNA-konjugierte Kügelchen (siehe Abschnitt 2.8), jeweils für 3 Stunden bei 4 ° Cmit Rotation. </li><li> Die Röhrchen auf Magnet für 1 min. Sammeln Überstand einer 1 ml Pipette, gefolgt von RNA-Isolierung aus dem Überstand RNA Ganzheitlichkeit zu bestätigen. Isolieren RNA durch eine Säure Guanidiniumthiocyanat-Phenol - Lösung nach den Anweisungen des Herstellers verwendet (Tabelle 2). Bewerten Sie die RNA Intakt durch die Analyse von 28S und 18S-Untereinheiten der ribosomalen RNA. Halten Wulst Pellets auf Eis. </li><li> Waschen Sie die magnetischen Kügelchen sechs Mal, jedes Mal durch Resuspendieren jedes Wulstes Pellet mit 1 ml Kernisolierungspuffer, enthaltend 40 U RNase-Inhibitor und 0,25% IGEPAL, gefolgt von Röhrchen für 2 min bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. Verwenden Sie einen Magnetfuß zur Trennung der magnetischen Kügelchen und Überstand. Entsorgen Sie alle Überstand. Halten Wulst Pellets auf Eis. </li><li> Verwenden Sie folgende Schritte, um RNA-Protein-Komplexe, die aus Perlen für Western-Blot-eluieren. Zunächst resuspendieren jeder Wulst Pellet in 75 ul Kernisolationspuffer; Dann fügen Sie 25 ul 4x Western-Blot-Laden buffer (enthaltend SDS) mit einem Gesamtvolumen von 100 ul zu erhalten. Schließlich sieden Perlen in 100 ul dieser Lösung bei 95 ° C für 5 min. HINWEIS: Verwenden Sie folgende Schritte RNA-Protein-Komplexe, die aus Perlen für MS zu eluieren. Schritt 1: resuspendieren jedes Wulstes Pellet in 100 &amp; mgr; l Elutionspuffer (Tabelle 3); Schritt 2: bead Proben für 2-3 h bei Raumtemperatur unter Rotation inkubieren; Schritt 3: Zentrifuge und sammeln proteinhaltige Überstand; Schritt 4: Proteinlösungen 20-30 ul vor der Vorlage für MS konzentrieren. </li><li> Zentrifuge jeweils 100 &amp; mgr; l Kügelchenprobe bei 12.000 xg für 30 sec bei 4 ° C und sammle den Überstand. Aliquot 15 ul Überstand für Western-Blot-Analyse (siehe Abschnitt 6.1 und 6.2). Sonde die resultierende Membran mit dem verdünnten HuR monoklonalen Maus-Antikörper (1: 1000 Verdünnung), über Nacht. </li></ol> 6. Western Blotting für die Überprüfung der RBP <ol><li> Separate RBPs durch SDS-PAGE unter Verwendung von Standardtechniken. </li><li> Führen wirVerwendung von Standardtechniken Heck-Blotting durch Sondieren für die RBPs mit der RNA von Interesse verbunden. Hinweis: In dieser Demo-Experiment, monoklonale HuR Maus-Antikörper für die Immunnachweis von HuR Protein verwendet wurde. </li><li> Inkubieren der resultierenden Membran mit dem verdünnten HuR Antikörper (1: 1000 Verdünnung) in 5% w / v fettfreie Trockenmilch, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 bei 4 ° C unter leichtem Schütteln über Nacht. Waschen Sie die Membran dreimal mit 1x TBST. Inkubieren Membran mit dem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 Stunde (anti-Maus-IgG-HRP der Ziege). Waschen Sie die Membran. Entwickeln und Aufzeichnungssignal. </li></ol>

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	<li>Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis.">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis.">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li><li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+exploits+three-dimensional+genome+architecture+to+spread+across+the+X-chromosome.">The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome.</a> Science. 341 (6147), 1237973 (2013).</li><li>Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+transcriptional+regulatory+circuit+drives+thermogenic+adipocyte+differentiation.">A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation.</a> Mol Cell. 55, 372-382 (2014).</li><li>Alvarez-Dominguez, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development.">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li><li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HADHB,+HuR,+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression.">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li><li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+of+HuR+and+poly(C)-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3&#180;+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA.">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3&#180; untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li><li>K&#246;nig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-RNA+interactions:+new+genomic+technologies+and+perspectives.">Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives.</a> Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).</li><li>Ferr&#232;, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+protein-lncRNA+interaction.">Revealing protein-lncRNA interaction.</a> Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).</li><li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia.">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li><li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases.">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes.">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome.">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements.">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins.">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li></ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

lncRNAs und RBPs haben eine lebenswichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit, aber die molekularen Mechanismen dieser Moleküle schlecht verstanden werden. Identifizierung von Proteinen, die mit lncRNA Molekülen interagieren ist ein wichtiger Schritt in Richtung auf die Regulationsmechanismen aufzuklären. Anreicherung von RBPs durch die RNA-Pull-Down-Assay-System wird in-Lösung auf Basis von Erfassung von komplexen interagieren, so dass Proteine, die aus einem Zelllysat selektiv extrahiert werden können biotinylierte RNA Köder gebunden an Streptavidin magnetische Kügelchen verwendet wird. Mehrere andere Verfahren wie Chirp, CHART und RAP kann das gleiche Ziel zu erreichen, aber diese Methoden mehr Aufwand nimmt als die RNA - Pull-down - Technik 16,17,18 einzurichten. Die Stärke der RNA-Pull-down ist, dass es ein relativ einfaches Protokoll ist und einfach durchzuführen. Sowohl CHIRP und RAP einen Vernetzungsschritt umfassen, die natürlicherweise RNA-Protein-Komplexe und den Aufbau eines vollständigen Satz von Antisense-Oligonukleotiden vorkommende bewahrt (90 nucleotides lang in RAP und 20 Nukleotide lang in Chirp) , um das gesamte Ziel - RNA 16,17,18 Fliesen. RNA-Faltung ist ein kritischer Schritt in der RNA-Pull-down-Assays. Die Hauptbeschränkung dieses Protokolls ist es, dass die Ziel - RNAs in vitro synthetisiert werden und nicht richtig in native Struktur gefaltet werden kann , die richtige zu ermöglichen , mit seiner RBP (en) zu binden. Falsch gefaltete nicht-native RNAs können entweder scheitern RNA-Protein - Wechselwirkungen zu bilden und funktionelle Assays ungültig oder Form Wechselwirkungen , die nur in vitro unter nicht - physiologischen Bedingungen auftreten. Obwohl das Pull-Down - Protokoll hier beschrieben ein gut anerkanntes Verfahren zur RNA angenommen 13,14 Faltung (Abschnitt 1.7 sehen), ist es nicht für andere RNA - Transkripte richtige Faltung garantiert. RNA - Pull-down wird oft mit RIP als komplementärer Ansatz gekoppelt , um die RNA (s) durch die RBP von Interesse 19 gebunden zu erkennen. Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Entfernung von Lipidfraktion aus GesamtzellLysat, da die hohe Lipid Hülle und Fülle in reifen Adipozyten stellt eine große technische Herausforderung dar (siehe Abschnitt 4.5). Das hier beschriebene Protokoll ist besonders für die Verwendung mit Adipozyten entwickelt. Jedoch können die Grundkomponenten dieses Protokolls und der Stringenz aller Puffer verwendet verändert und für die Anwendung auf andere Zellkulturmodellen angepasst werden. Für Gewebe , die hohe endogene RNase haben, verschiedene RNA - Pull-down - Protokolle angewendet werden kann. RNA-Pull-down, die RNAs von Interesse verwendet die dazugehörigen RBPs zu identifizieren, ist eine effektive und effiziente Technik, um die zentralen Funktionen und Mechanismen von lncRNAs zu sondieren, die eine breite Palette von Rollen in menschlichen Zellen haben. Die zukünftige Entwicklung von RNA-basierten Erfassung, einschließlich RNA Pull-Down wird Herausforderungen benötigt werden, um Adresse mit der Definition der Komponenten, Montage und Funktion von RNA-Protein-Komplexe, sowie ausreichend RBPs von niedrigen reichlich RNA-Protein-Komplexe für MS zu erzeugen.

A correction to the author list was made to: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs sind Proteine, die bei der Bildung von RNA-Protein-Komplexe in Zellen zur Doppel- oder Einzelstrang-RNA binden und zu beteiligen. RBPs kann eine Vielzahl von RNA-Spezies binden, einschließlich mRNA und lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) und deren Einfluss auf posttranskriptionales Ebenen ausüben. Beide RBPs und lncRNAs sind , sich als neue Aufsichtsbehörden bei adipösen Entwicklung und Funktion 1,2,3. Um zu verstehen, den Mechanismus der RBP- und lncRNA vermittelte Regulation der zellulären Wege, ist es oft notwendig ist, die Wechselwirkung zwischen einem spezifischen RNA-Moleküls und eines oder mehrere RBPs zu erfassen, und manchmal das gesamte Spektrum von Proteinpartner einer RNA zu identifizieren, Transkript. Jedoch kann der Versuch aufgrund des hohen Gehaltes an Lipiden in Adipozyten schwierig sein. Die RNA - Pull-Down - Protokoll hier beschrieben werden eingesetzt 4,5 die Proteinpartner eines spezifischen RNA aus den Adipozyten Lysaten von Primärkulturen zu erhalten. Rationale für dieses Protocol wird wie folgt zusammengefasst. Ein RNA - Köder in vitro aus einem DNA - Template transkribiert ist, Biotin-markierte und konjugiert an Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen 4. Die RNA Köder wird mit Zelllysaten inkubiert für die Bildung von RNA-Protein-Komplexen zu ermöglichen, die anschließend gezogen werden, auf einem Magnettreten. Mehr die RNA - Pull-Down - Protokoll unten beschrieben speziell, verwenden Sie ein RNA - Fragment von AR 3&#39;UTR als Köder HuR Protein, ein universell ausgedrückt RBP gebunden 3&#39;UTR von mRNAs 6,7, von theadipocytelysate der Primärkultur zu erhalten. Um die Bindungsspezifität dieses Assays testen, wurde eine nicht-relevanten RNAas auch blank Streptavidin-Kügelchen als Kontrolle eingeschlossen. Dieses Protokoll ist kompatibel mit Western - Blot oder Massenspektrometrie (MS) die Erfassung eines bestimmten RBP zu bestätigen oder das gesamte Repertoire der erfassten RBPs bzw. 8 zu identifizieren. Verschiedene Techniken sind verfügbar RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchens. Offenbaren RNAs gebunden durch eine gegebene RBP, RIP (RNA Immunpräzipitation) und CLIP (UV-Vernetzung und Immunpräzipitation) angewendet werden kann. Im Gegensatz dazu kann zu identifizieren angewendet werden Proteinpartner eines bestimmten RNA, RNA Pull-Down-Chirp (Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung), CHART (Capture-Hybridisierungsanalyse von RNA-Targets) und RAP (RNA-Antisense-Reinigung). Im Vergleich zu den späteren, RNA-Pull-down-Technik dauert weniger Aufwand einzurichten. Es kann zu erfassen Proteine ​​in vitro verwendet werden , und in vivo. Die in - vivo - Ansatz von RNA - Pull-down, die technisch anspruchsvoller als seine in - vitro - Gegenstück ist, RNA-Protein - Interaktionen bewahrt durch in Zellen Vernetzung erfasst Aptamer-markierte RNAs von Interesse von Zellen und erkennt anschließend gebunden RBPs. RNA - Pull-down kann zu bereichern niedrig reichlich RBPs verwendet werden, und die RNA-Protein - Komplexe zu isolieren und zu identifizieren , die bei der Kontrolle der zellulären Regulation 9,10 diversen funktionalen Rollen haben </sup&gt;.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Major materials used in this study.</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript kit</td>
			<td>&#160;Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin-14-CTP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucAway spin columns&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (1&#215;PBS)</td>
			<td>&#160;HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pfu Turbo DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIsure</td>
			<td>&#160;Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Major equipment used in this study.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend X1R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Rad T100 thermal cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BOECO rotator Multi Bio RS-24&#160;</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 magnet&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) entstehen als regulatorischer Ebene in der Entwicklung und Funktion von Fettgewebe. RBPs spielen eine wichtige Rolle bei der Genregulation bei posttranskritionelle Ebenen durch die Stabilität und Translationseffizienz von Ziel-mRNAs beeinflussen. RNA pull-down-Technik weit verbreitet RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen ist, die notwendig ist, den Mechanismus zugrunde liegende RBPs &#39;sowie lange nicht-kodierenden RNAs&#39; (lncRNAs) Funktion aufzuklären. Jedoch stellt die hohe Lipid Fülle in Adipozyten eine technische Herausforderung, dieses Experiment in der Durchführung. Hier ist eine detaillierte RNA Pull-Down-Protokoll wird für die primäre Adipozyten Kultur optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptors (AR) 3 &#39;untranslatierten Region (3&#39;-UTR), die eine Adenylat-uridylat reichen elementwas verwendet als ein Beispiel enthält, zu zeigen, wie ihre RBP Partner HuR Protein von Adipozyten lystate abzurufen. Das hier beschriebene Verfahren kann um die Wechselwirkungen zu detektieren angewendet werden zwischenRBPs und nicht-kodierenden RNAs sowie zwischen RBPs und kodierenden RNAs.

In dieser Demo-Experiment wurde ein AR-RNA-Fragment als Köder verwendet, um seine bindende Protein HuR zu erfassen. Sowohl ein FL RNA Köder, die HuR Protein und ein Aliquot von unkonjugiertem blank Streptavidinbeads dienten als negative Kontrollen nicht relevant ist. RNA-Protein-Wechselwirkungen können entweder im Kern oder Cytoplasma auftreten, und das Pull-Down-Protokoll kann entweder insgesamt oder fraktionierte (Kern- oder cytoplasmatische) Zelllysate angewendet werden. Analyse von Proteinen durch Western-Blot zeigt, dass die Probe von 15 ul unfraktioniertem Zelllysat, da keine Perleneingangskontrolle ergab ein positives Ergebnis (siehe Abschnitt 4.8), was darauf hinweist, dass HuR-Protein in der Adipozyten-Lysat von Maus Primärkultur erkannt wird durch die Verwendung der monoklonale Antikörper ist. Die AR-RNA Elution Fraktion ergab ein positives Ergebnis, was darauf hinweist, dass HuR Protein mit Hilfe der AR-RNA-konjugierten Perlen für die RNA-Pull-Down-Assay in Adipozyten-Lysat erkannt wird. Sowohl die FL-RNA Elution Fraktion und die blank Wulst Probe ergaben negative Ergebnisse, dass unspezifische Wechselwirkungen zwischen FL-RNA-Fragment und HuR Protein anzeigt, sowie zwischen den leeren Perlen und HuR Protein sind von dieser RNA-Pull-down-Ansatz nicht nachweisbar. Ergebnisse dieser zwei negative Kontrollen zeigen auch, dass eine spezifische Wechselwirkung zwischen dem AR-RNA-Fragment und HuR Protein erfolgreich von der RNA-Pull-down hier beschriebene Protokoll erkannt wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54207/54207fig1.jpg" /> Abbildung 1: Western - Blot - Überprüfung von HuR Captured durch die RNA - Pull-down - Assays Eingang: rekonstruierter Zelllysat (zytoplasmatische + Kern Lysat);. Perlen: die Probe aus leeren Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen; FL RNA: Streptavidin mit dem FL-mRNA gebundenen Perlen; AR 3&#39;UTR RNA: Streptavidin-Kügelchen gebunden mit dem AR 3&#39;UTR mRNA; Primäre Antikörper: HuR monoklonalen Maus-Antikörper; Sekundäre Antikörper: Ziege anti-Maus IgG-HRP; Abkürzung, FL: Glühwürmchen - Luciferase, AR: Androgenrezeptor, <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54207/54207fig1large.jpg" target="_blank">bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54207/54207fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zentrifuge </td></tr><tr><td> Thermocycler </td></tr><tr><td> Spektrophotometer </td></tr><tr><td> Rotator </td></tr><tr><td> Protein-Gel-Elektrophorese und Blotapparatur </td></tr><tr><td> Magnet </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Bedeutende Ausrüstung benutzt in dieser Studie Die wichtigsten Geräte in dieser Studie verwendet.. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> In - vitro - Transkription - Kit </td></tr><tr><td> Biotinylierte RNA </td></tr><tr><td> Spin-Säule zur Gewinnung von DNA und RNA-Fragmenten </td></tr><tr><td> Streptavidin magnetische Kügelchen </td></tr><tr><td> HuR monoklonalen Maus-Antikörper </td></tr><tr><td> Ziege-anti-Maus-IgG-HRP </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Molekularbiologie Wasser </td></tr><tr><td> Phosphatpufferkochsalzlösung </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor </td></tr><tr><td> Pfu-DNA-Polymerase </td></tr><tr><td> Säure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Lösung </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Die wichtigsten Verwendete Reagenzien in dieser Studienrichtung Reagenzien in dieser Studie verwendet.. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 2x RNA - Struktur - Puffer </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 0,2 M KCl </td></tr> &lt;tr&gt; <td> 20 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 mM DTT </td></tr><tr><td> 0,8 U / ul RNase Inhibitor </td></tr><tr><td> Puffer A </td></tr><tr><td> 0,1 M NaOH </td></tr><tr><td> 0,05 M NaCl </td></tr><tr><td> Puffer B </td></tr><tr><td> 0,1 M NaCl </td></tr><tr><td> 1x W &amp; B (Bindungs- und Wasch) Puffer </td></tr><tr><td> 5 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td></tr><tr><td> 1x hypotonischen Puffer </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 10 mM KCl </td></tr><tr><td> 2 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 1x Protease-Inhibitor </td></tr><tr><td> 1x Kernisolationspuffer </td></tr><tr><td> 25 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 150 mM KCl </td></tr><tr><html><td> 2 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 0,5% IGEPAL (oder 0,25% IGEPAL für die Elution von RBPs) </td></tr><tr><td> 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 1x Protease-Inhibitor </td></tr><tr><td> 0,4 U / ul RNase-Inhibitor (oder 40 U / ml RNase-Inhibitor für die Elution von RBPs) </td></tr><tr><td> 1x Elutionspuffer </td></tr><tr><td> 2 mM Biotin in 1x PBS </td></tr></tbody></table> . Tabelle 3: Wichtige Verwendete Lösungen in dieser Studie 2x RNA - Struktur - Puffer (siehe Abschnitt 1.7); Puffer A (siehe Abschnitt 2.3); Puffer B (siehe Abschnitt 2.4); 1x W &amp; B (Bindungs- und Wasch) Puffer (siehe Abschnitte 2.2, 2.5, 2.7); 1x hypotonischen Puffer (siehe Abschnitt 4.3); 1x Kernisolationspuffer (siehe Abschnitte 2.8, 4.6, 5.3, 5.4); 1x Elutionspuffer (HINWEIS folgenden siehe Abschnitt 5.4). mmer &quot;&gt; <tbody><tr><td> Template und Primer </td><td colspan="2"> Sequenzen </td></tr><tr><td> T7-AR-Oligo </td><td colspan="2"> 5 &#39;TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCT GGG CTT TTT TTT TCT CTT TCT CTC CTT TCT TTT TCT TCT TCC CTC CCT AGC TTA TGA CCG TGG CAG TCT -3&#39; </td></tr><tr><td> T7-AR-F </td><td colspan="2"> 5 &#39;CTA ATA CGA CTC ACT ATA G-3&#39; </td></tr><tr><td> T7-AR-R </td><td colspan="2"> 5 &#39;AGA CTG CCA CGG TCA TAA GC -3&#39; </td></tr><tr><td> hluc (+) - T7-probe-F </td><td colspan="2"> 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGCCCCTGCTAACGACATTTACAACGAG-3 &#39; </td></tr><tr><td> hluc (+) - Sonde-R </td><td colspan="2"> 5&#39;-CATAATCATAGGGCCGCGCACACAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Sequenzen von Template und Primer für die PCR - Amplifikation T7-AR-Oligo. DNA - Matrize für die PCR - Amplifikation (siehe Abschnitt 10,1); T7-AR-F: Vorwärts-Primer für die PCR-Amplifikation (siehe Abschnitt 1.1); T7-AR-R: Rückwärts-Primer für die PCR-Amplifikation (siehe Abschnitt 1.1); hluc (+) - T7-Sonde-F: Vorwärts-Primer für die PCR-Amplifikation (siehe Abschnitt 1.2); hluc (+) - Sonde-R: Rückwärts-Primer für die PCR-Amplifikation (siehe Abschnitt 1.2).

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Ein RNA-Pull-down-Protokoll wird für den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteine ​​(RBPs) und nicht-codierende sowie kodierenden RNAs hier optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptor (AR) wurde als Beispiel verwendet, zu zeigen, wie ihre RBP aus lystate primärer braunen Fettzellen zu erhalten.

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

23.5K Aufrufe.  Duke-NUS Medical School.  Ein RNA-Pull-down-Protokoll wird für den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteine ​​(RBPs) und nicht-codierende sowie kodierenden RNAs hier optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptor (AR) wurde als Beispiel verwendet, zu zeigen, wie ihre RBP aus lystate primärer braunen Fettzellen zu erhalten. 

Serie: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Forschung

Biologie

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the calcium-binding protein known as calmodulin (CaM)1,2. CaM is involved at multiple levels in almost all cellular processes, including apoptosis, metabolism, smooth muscle contraction, synaptic plasticity, nerve growth, inflammation and the immune response. A number of proteins help regulate these pathways through their interaction with CaM. Many of these interactions depend on the conformation of CaM, which is distinctly different when bound to Ca2+ (Ca2+-CaM) as opposed to its Ca2+-free state (ApoCaM)3.
While most target proteins bind Ca2+-CaM, certain proteins only bind to ApoCaM. Some bind CaM through their IQ-domain, including neuromodulin4, neurogranin (Ng)5, and certain myosins6. These proteins have been shown to play important roles in presynaptic function7, postsynaptic function8, and muscle contraction9, respectively. Their ability to bind and release CaM in the absence or presence of Ca2+ is pivotal in their function. In contrast, many proteins only bind Ca2+-CaM and require this binding for their activation. Examples include myosin light chain kinase10, Ca2+/CaM-dependent kinases (CaMKs)11 and phosphatases (e.g. calcineurin)12, and spectrin kinase13, which have a variety of direct and downstream effects14.
The effects of these proteins on cellular function are often dependent on their ability to bind to CaM in a Ca2+-dependent manner. For example, we tested the relevance of Ng-CaM binding in synaptic function and how different mutations affect this binding. We generated a GFP-tagged Ng construct with specific mutations in the IQ-domain that would change the ability of Ng to bind CaM in a Ca2+-dependent manner. The study of these different mutations gave us great insight into important processes involved in synaptic function8,15. However, in such studies, it is essential to demonstrate that the mutated proteins have the expected altered binding to CaM.
Here, we present a method for testing the ability of proteins to bind to CaM in the presence or absence of Ca2+, using CaMKII and Ng as examples. This method is a form of affinity chromatography referred to as a CaM pull-down assay. It uses CaM-Sepharose beads to test proteins that bind to CaM and the influence of Ca2+ on this binding. It is considerably more time efficient and requires less protein relative to column chromatography and other assays. Altogether, this provides a valuable tool to explore Ca2+/CaM signaling and proteins that interact with CaM.

Calmodulin (CaM) pull-down assay is an effective way to investigate the interaction of CaM with various proteins. This method uses CaM-sepharose beads for efficient and specific analysis of CaM-binding proteins. This provides an important tool to explore CaM signaling in cellular function.

Pull-down von Calmodulin-bindende Proteine

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments for T2D, more physiologically relevant in vitro adipocyte models are required. This study describes a new technique to isolate and culture mature human adipocytes. This method is entitled MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture), and compared to other adipocyte in vitro models, MAAC possesses an adipogenic gene signature that is the closest to freshly isolated mature adipocytes. Using MAAC, adipocytes can be cultured from lean and obese patients, different adipose depots, co-cultured with different cell types, and importantly, can be kept in culture for 2 weeks. Functional experiments can also be performed on MAAC including glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis. Moreover, MAAC responds robustly to diverse pharmacological agonism and can be used to study adipocyte phenotypic changes, including the transdifferentiation of white adipocytes into brown-like fat cells.

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membrane mature adipocyte aggregate culture (MAAC) is a new method to culture mature human adipocytes. Here we detail how to isolate adipocytes from human adipose and how to set up MAAC.

Isolation und Kultur der menschlichen Reife Adipozyten mit Membran Reife Adipozyten Aggregatkulturen (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...