Los autores desean agradecer a M. Steczkowski para grabaciones de voz, M. Borczyk para dibujos, A. Trąbczyńska para la producción de virus, M. Ziókowska para el genotipado y A. Mirgos para obtener ayuda con la filmación. KR reconoce la especie de regalo del virus adeno-asociado recombinante (rAAV) que expresa la proteína fluorescente mCherry bajo el control del promotor de CaMK K. Deisseroth. Este proyecto se llevó a cabo en las instalaciones centrales del Laboratorio de Modelos Animales y Laboratorio de Estructura de los tejidos y la función del Centro de Neurobiología del Instituto Nencki de Biología Experimental, con el uso de la infraestructura de la CEPT financiado por la Unión Europea - Fondo Europeo de Desarrollo Regional dentro del Programa operativo &quot;economía innovadora&quot; para el período 2007-2013. Este trabajo fue apoyado por becas de Centro Nacional de Ciencia: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 a KR y Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 a RC

Todos los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Comité Ético local en el Instituto Nencki of Experimental Biology, Academia de Ciencias de Polonia. Nota: Algunas de las escenas en el vídeo asociado se aceleran. Factor de velocidad se indica en estas escenas. 1. Preparación para la Cirugía <ol><li> Esterilizar todas las herramientas, envases de vidrio para líquidos y bastoncillos de algodón en el autoclave. Use guantes prescindibles. Limpiar la mesa de operaciones, el marco estereotáxico y todo lo que le rodea con etanol al 70%. Use una almohadilla quirúrgico estéril para crear un espacio estéril para todo el equipo esterilizado. Cortar espuma de gel en trozos pequeños y remojar en solución salina estéril. Nota: De acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, el etanol es un esterilizante ni un desinfectante de alto nivel. Sólo se debe utilizar como un agente de limpieza / desengrasado de superficies previamente esterilizados. </li><li> Poner el animal en THcámara de inducción de correo y establecer el nivel de isoflurano al 5% y el flujo de oxígeno a 2 l / min. Este procedimiento debe tomar alrededor de 3 min. </li><li> Llevar al animal fuera de la cámara de inducción. Utilice la cola o del dedo del pie aprieta con el fin de asegurar que el animal está completamente sedado. </li><li> El uso de un condensador de ajuste preciso afeitar el pelo de la parte posterior de la cabeza (entre las orejas) hasta los ojos. </li><li> Colocar el animal en el marco estereotáxico y estabilizar la cabeza con barras de oído. </li><li> Establecer niveles de anestesia con isoflurano al 1,5-2% y 0,3 L / min de oxígeno. </li><li> Aplicar el ungüento oftálmico. </li><li> Inyectar la vía subcutánea animal con Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) y Baytril (5 mg / kg) para prevenir la inflamación, el dolor y la infección, respectivamente. </li><li> Inyectar la vía intramuscular animal con dexametasona (0,2 mg / kg) para evitar la hinchazón del cerebro. Nota: Es posible inyectar por vía subcutánea o intraperitoneal dexametasona para prevenir el daño muscular. </li><li> Limpiar la piel con shisopos de algodón terile con Betadine seguidos por 70% de etanol. </li><li> Cambiar los guantes y rociarlas con un 70% de etanol. Nota: Durante el uso de guantes desechables no toque el campo estéril. Toca el único animal con la punta de los instrumentos quirúrgicos estériles e hisopos estériles. </li></ol> 2. Cirugía ventana del cráneo <ol><li> Levantar la piel con pinzas y el uso de tijeras micro incise la piel horizontalmente a lo largo de la base de la cabeza y luego oblicuamente hasta el punto de frente entre los ojos. Retire la tapa de piel. </li><li> Aplique un ungüento de lidocaína con un hisopo estéril en el periostio para evitar el sangrado y el dolor excesivo. </li><li> Use hisopos de algodón estériles o un escalpelo para retirar el periostio. Se seca el cráneo con hisopos estériles. </li><li> El uso de una aguja estéril se aplica densa pegamento de cianoacrilato sobre los bordes de la piel para inmovilizarlos y para evitar el contacto con cemento dental. Espere a que el pegamento se seque. </li><li> Coloque un 3 mm cubreobjetos estéril sobre tque el cráneo anterior a esta sutura. Centre el cubreobjetos en RSC coordenadas: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Marque los bordes cubreobjetos por el rascado la superficie del cráneo con una aguja estéril. Poner el cubre de nuevo en el recipiente estéril con un 70% de etanol. </li><li> Use un taladro dental de alta velocidad con rebabas de pequeño diámetro para delinear un círculo de 3 mm de diámetro. Limpiar el sitio de perforación del polvo de hueso con hisopos de cruce de solución salina estéril. Utilice la espuma de gel y de hisopos para detener el sangrado ocasional y limpiar el hueso. </li><li> En el medio de perforación comprobar el espesor del hueso con unas pinzas finas tocando con suavidad el círculo de hueso y la comprobación de su movilidad. Tenga en cuenta que el hueso es más gruesa en el área de la sutura. Detener la perforación cuando el círculo de hueso es móvil y sólo un par, capa delgada de hueso se deja en la circunferencia. Limpiar el campo operacional de todo el polvo de hueso restante con hisopos salinas de cruce. </li><li> La caída de la solución salina estéril en el área de perforación, que cubre el CIR perforadoCLE. saque con cuidado el círculo hueso con unas pinzas finas y luego suavemente pero con firmeza quitar el hueso levantándolo hacia arriba. Tenga cuidado de no sesgar el círculo de hueso mientras se levanta para evitar posibles daños a la dura. </li><li> Aplique suavemente la espuma de gel empapada en solución salina estéril sobre la duramadre para ayudar a detener el sangrado. Espere hasta que todo el sangrado se detiene por completo. Retirar con cuidado la espuma de gel de no perturbar el proceso de coagulación. Nota: El área de sutura es muy vascularizada, por lo que el sangrado en este punto podría ser profundos. Es esencial que esperar el tiempo suficiente para que el sangrado se detenga completamente. Es útil para mantener la espuma de gel empapada en solución salina enfriada colocándola en hielo. </li></ol> 3. Inyección de virus <ol><li> Coloque la bomba de infusión a la torre estereotáctica y conectar el controlador. </li><li> Insertar la aguja 35G en la jeringa. Enjuague la jeringa 10 veces con etanol para esterilizarla y 10 veces con solución salina estéril para eliminar los restos de correoTHANOL. Eliminar las burbujas de aire de la jeringa. Inserte la jeringa en la bomba. Nota: Considere el uso de otros desinfectantes. </li><li> Descongelar una dosis única de rAAV2 / 1 mCherry preparación (se recomienda 10 12 pfu) y mantenerlo en hielo. Llene la jeringa con la solución de virus. </li><li> Centrar la aguja en el bregma y luego insertar suavemente en el hipocampo utilizando las siguientes coordenadas: AP-2, ML +/- 1,0, -1 DV. Estas coordenadas se encuentran cerca del borde de la craneotomía. Esperar durante 5 minutos para que el tejido se estabilice. </li><li> Inyectar 0,7 l de la solución rAAV2 / 1 mCherry a razón de 50 nl / min. Esperar 10 min para que el virus se adsorbe completamente. Retire con cuidado la aguja. Seque con espuma de gel si se presenta sangrado. Repita con el sitio contralateral. </li></ol> 4. craneal ventana de implantación <ol><li> Coloque el cubreobjetos estéril, seca en la parte superior de la duramadre en el marco del círculo perforado. Mantenga el cubreobjetos con el forceps para aplanar suavemente la duramadre y llevar cubreobjetos &#39;bordes más cerca de la superficie del cráneo. Nota: Es posible que el cubreobjetos interrumpe el coágulo y se restablece el sangrado. Si ese es el caso, levantar el cubre objetos, colocarlo en el alcohol, secar y volver al paso 2.9. </li><li> Usando una aguja estéril aplicar el pegamento de cianoacrilato densa en los bordes de recubrimientos de vidrio para la fijación a la calavera. Espere a que el pegamento se seque. </li><li> Coloque una barra de fijación (tuerca M2 o un diseño hecho a medida) en la parte frontal del cráneo. Aplique el pegamento de cianoacrilato sobre los bordes de la barra. Espere a que el pegamento se seque. <ol><li> Colocar el gancho de fijación en una posición que permita el posicionamiento horizontal de la ventana del cráneo durante el diagnóstico por sesión. Colocarlo tan distantes como sea posible de la ventana. Si se coloca demasiado cerca de la ventana, la barra y el tornillo de conexión con el titular de la medida pueden suponer un obstáculo para el objetivo durante el proceso de formación de imágenes. </li></ol></li><li&gt; preparar el acrílico dental y aplicarlo sobre la superficie del cráneo alrededor del vaso. Es útil para formar una forma de cráter alrededor de la ventana. Se va a crear una cavidad para agua aplicada posteriormente para obtener imágenes con el objetivo de agua. </li><li> Crear un casquillo con el acrílico dental, que cubre el resto de la zona operativa, bordes de la piel, bar fijación, reforzando el cráter alrededor de la ventana craneal. Espere a que el cemento dental se endurezca. </li><li> Retire el animal del marco estereotáxico y ponerlo en la cámara de recuperación. </li><li> Espere a que el animal se recupere de la cirugía, mientras que la observación de las funciones fisiológicas. </li><li> Aplicar analgesia postoperatoria (carprofeno, 10 mg / kg) y el tratamiento de antibióticos (Baytril, 5 mg / kg) durante 48 horas. </li></ol> 5. Imaging <ol><li> Iniciar el Ti: Zafiro láser, encienda el microscopio. El sistema usado en este experimento está equipado con un láser de dos fotones, sistema OPO y PMT dual GaAsP. </li><li> El sacrificio del animal en el Inducy cámara de inducir la anestesia. </li><li> Retire el animal de la cámara de inducción y el lugar de la máscara de anestesia de gas bajo el microscopio. Disminuir el flujo de oxígeno a 0,3 L / min y la concentración de isoflurano al 1,5-2%. </li><li> Fijar el animal al pie del microscopio personalizado con un tornillo M2 (u otro sistema de medida). Nivelar la ventana del cráneo. Nota: Es posible utilizar el sistema de fijación de la cabeza del fabricante microscopio, aunque la trama personalizada específica da mejores resultados (mejora de la estabilidad de la cabeza, posicionamiento constante en varias sesiones durante un experimento crónica). </li><li> El uso de los ajustes del microscopio de campo amplio y un centro de objetivo de baja magnificación de la vista en uno de los lados de la corteza retroesplenial y enfocarla en la superficie cubreobjetos. </li><li> Aplicar una gota de agua en el pozo de acrílico en forma de cráter. Cambiar a un objetivo de inmersión en agua a larga distancia. Mover el objetivo hacia la ventana del cráneo hasta que el menisco con aguanecta la muestra y objetiva. </li><li> Cambiar a la configuración de dos fotones y comenzar a escanear la parte superior a la inferior muestra el uso del zoom más bajo. El cruce de la duramadre será visible como un reflejo de la señal no específica alta. </li><li> Ajuste la configuración de adquisición de microscopio en ambos canales (GFP y mCherry) de acuerdo con la intensidad de señal de las células fluorescentes con el fin de cubrir todo el rango dinámico. </li><li> Después de encontrar una neurona adecuada (con el árbol dendrítico separado de otras células) realizar una exploración inicial usando sólo el filterset GFP con zoom más baja y la distancia z de 5 micras. </li><li> Obtener una proyección máxima de la pila de escaneado e imprimirlo para las anotaciones (utilizando colores invertidos). </li><li> Ajuste el zoom a un valor que permita a la imagen de los detalles morfológicos deseados. Imagen entera del árbol dendrítico en los canales de GFP y mCherry utilizando máxima proyección como guía. </li></ol>

<ol>
	<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window.">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li><li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex.">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex.">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input.">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation.">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li><li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat.">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li></ol>

Los autores (KL, MR, KR) tienen derechos de patente pendientes (PL410001) para el marco Holder utilizada en este artículo.

En el presente trabajo se presenta un protocolo para la utilización simultánea de dos fotones de imágenes in vivo de las entradas sinápticas y las metas post-sinápticas en RSC a través de una ventana del cráneo. El procedimiento de implantación consiste en varios pasos clave. En primer lugar, el animal se anestesió profundamente y se fija en el marco estereotáctico, entonces el cráneo sobre RSC se adelgaza con un taladro a lo largo de las líneas circulares marcados y se retira el hueso circular. Después se detiene la hemorragia, la rAAV2 / 1 mCherry se inyecta en el hipocampo, y la cubierta de vidrio se fija en el cráneo sobre el área perforado. Por último la barra de fijación está asegurado en la cabeza y el animal se coloca en la cámara de recuperación de 48 hr. Después de aproximadamente 2-3 semanas necesarios para la expresión del virus, la RSC puede ser visualizado. El protocolo de formación de imágenes se compone de los siguientes pasos. En primer lugar, el animal se anestesia y se fija bajo el microscopio. El foco se establece a continuación, utilizando el microscopio de campo amplio, el sistema es conmutadoencend da en el modo de dos fotones y los canales de interés (GFP) y mCherry se visualizan. La técnica presentada ofrece una mejora importante con respecto a los protocolos descritos anteriormente. En el enfoque estándar, sólo un tipo de una etiqueta podría ser detectado. Podría ser utilizado para imagen local proyecciones axonales y árboles dendríticas, pero no hay estudios de conectividad de largo alcance fuera posible. Mediante la combinación de dos proteínas fluorescentes que habilitado el seguimiento simultáneo de elementos pre y postsinápticos. Esto permite a largo plazo en el seguimiento in vivo de las conexiones sinápticas putativos. Con el fin de obtener los resultados óptimos en el procedimiento descrito, es importante prestar atención a varios pasos críticos. Durante la elevación del círculo de hueso en el paso 2.8 cualquier daño a la duramadre puede causar inflamación y afectar la transparencia de la ventana craneal. paro insuficiente de sangrado en el paso 2.9 o en cualquier otro paso del procedimiento se traduce en la sangre accumulation debajo de la ventana y reduce significativamente el campo de visión. Después de inyectar el virus es de vital importancia que esperar por lo menos 10 min antes de retirar la aguja, para que el virus de infundir en el tejido sólo en el sitio de la inyección. Se limita la posibilidad de infección no deseada de la corteza con el virus durante la extracción de la aguja. El área de la transfección viral debe ser examinado con un análisis histológico post hoc del tejido cerebral. Cualquier expresión mCherry en las células a lo largo de la traza de la aguja debe ser evitado. El tiempo de recuperación estándar es de 3 semanas. Este período es suficiente para que el virus para alcanzar la expresión estable en las proyecciones sinápticas y para la ventana craneal para curar completamente y estabilizar. Los animales deben ser alojados individualmente con el fin de evitar la extracción del implante ventana del cráneo por los compañeros de jaula. El uso de una jaula ampliada podría considerarse con el fin de evitar el daño accidental de la ventana craneal por golpear las barras de metal. una fijación estable del mouSE bajo el microscopio es esencial. Cualquier movimiento de la cabeza, incluyendo los movimientos de respiración, puede causar una reducción significativa en la calidad de las imágenes obtenidas. También es útil para colocar la ventana del cráneo horizontalmente hacia el objetivo, para limitar posibles problemas con la adquisición de la misma atención para todo el plano de la ventana. criterios claros para la resolución de espinas y boutons deben aplicarse. Generalmente, boutons se definen como inflamaciones axonales que tienen un diámetro de al menos 3 veces más grande que la fibra anterior 7. Las espinas se definen como protuberancias claramente distinguibles desde el eje de dendritas que contiene una cabeza bulbosa. Además división en poblaciones de fina, rechoncha, champiñones y espinas ramificadas es posible 3. Debido a la resolución axial relativamente pobre de la microscopía de dos fotones, el análisis de las espinas que se proyectan a lo largo del eje óptico debe evitarse 3. Con el fin de distinguir claramente boutons espinas y funcionales, un post hoc immunolabelingse puede realizar con el fin de identificar marcadores pre y postsinápticos 7. Aunque el protocolo presentado resultó ser la más favorable en nuestros diseños experimentales, es posible modificarla con el fin de adaptarse a diferentes objetivos experimentales. A veces es más adecuado utilizar anestesia inyectable (como la ketamina-xilasina) en lugar de isoflurano, pero es importante para ajustar adecuadamente la dosis, teniendo en cuenta las diferencias en la susceptibilidad al fármaco entre los ratones de diferentes cepas, la edad y el sexo. Es posible utilizar un trépano en lugar de uno esférica para la perforación, pero podría aumentar el riesgo de daños a la dura. La solución salina estéril se puede sustituir con éxito con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), pero es importante para mantenerla estéril en todo momento durante la preparación y funcionamiento. ACSF es estable durante 3-4 semanas después de la preparación, y si se produce cualquier contaminación antes de este tiempo debe desecharse inmediatamente. Diferentes DE FIJACIÓN cabezaen los dispositivos se pueden aplicar, dependiendo del diseño experimental, incluyendo la posibilidad de observar el ratón despierto bajo el microscopio de dos fotones. Como cualquier otra técnica, éste también tiene sus limitaciones. El microscopio de dos fotones permite la visualización del cerebro tejido hasta 500 micras de profundidad de la superficie dura. Para el examen de las estructuras cerebrales profundas modificaciones adicionales deben aplicarse. El protocolo permite el acceso a la mayor parte de RSC, pero la parte de la estructura oculta bajo el seno sagital superior todavía no es accesible. La resolución del microscopio de dos fotones no es suficiente para la identificación de una sinapsis específica, así como el análisis morfológico detallada de las espinas dendríticas. técnicas adicionales, tales como la microscopía electrónica correlativa se deben aplicar con el fin de confirmar la existencia de una estructura de sospecha. También es importante mencionar que esta es una técnica quirúrgica relativamente difícil y no es recommended para un operador inexperto. La técnica presentada puede ser aplicado en una amplia gama de experimentos. Puede ser modificado para la investigación de diferentes regiones del cerebro accesibles con el microscopio de dos fotones. Se permite la monitorización simultánea de axonal y alteraciones dendríticas durante la variedad de estados fisiológicos y patológicos, incluyendo los procesos cognitivos y el envejecimiento o la progresión de enfermedades neurológicas y trastornos psiquiátricos. Permite el uso de promotores específicos de células para visualizar proyecciones que se originan en subconjuntos neuronales definidas con precisión. También se puede ajustar para adaptarse a los protocolos de experimentos en animales despiertos y se comportan. Además, las proteínas sensibles al pH del calcio o pueden ser expresados ​​en el cerebro con el fin de visualizar no sólo la morfología neuronal, sino también los cambios en la actividad de las células y la función. Otra posible modificación del enfoque es el uso de un serotipo diferente rAAV para la expresión mCherry. El quimérico pr 2/1 serotipoovides sólida expresión en el sitio de la inyección con un inicio bastante rápida (2-3 semanas). Los niveles mCherry permanecieron estables durante al menos 12 semanas después de la aparición inicial y no se detectó el etiquetado retrógrada en nuestros experimentos. Con el fin de obtener el etiquetado retrógrada, un serotipo diferente podría ser utilizado, tal como rAAV9. Las sesiones de formación de imágenes se pueden realizar en cualquier frecuencia, sin embargo, al menos, intervalo de 24 h se recomienda con el fin de permitir la recuperación adecuada del animal después de la anestesia. Si se aplica correctamente, esta técnica permite la realización de múltiples sesiones de formación de imágenes de la misma región en el transcurso de varios meses. Para los experimentos a largo plazo (más de 6 meses), un sistema Cre / loxP se puede utilizar con la recombinasa entregado con el vector de AAV en una línea de GFP ratón floxed.

microscopía de dos fotones revolucionó la observación de la actividad cerebral en vivir y comportarse animales. Desde su introducción en 1990, rápidamente ganó popularidad y ahora se implementa como uno de los enfoques más interesantes e innovadores en el examen de numerosos aspectos de la actividad cerebral in vivo 1,2. Estas aplicaciones incluyen las mediciones de flujo de sangre, la activación neuronal (por ejemplo, utilizando indicadores de nivel de calcio o genes tempranos inmediatos de expresión) y la morfología de las células neuronales. Un número creciente de laboratorios utilizan microscopios de dos fotones, la aplicación de la técnica en todo el mundo científico como un nuevo estándar para las imágenes del cerebro in vivo. El método estándar consiste en la implantación de la ventana del cráneo (un agujero redondo en el cráneo cubierto con una tapa de vidrio) sobre el barril o la corteza visual del cerebro del ratón 3. A continuación, dependiendo del protocolo experimental, el mouse somete a una serie de visualización y las sesiones de entrenamiento de comportamiento, lo que permite controlar los cambios en la actividad cerebral y la morfología neuronal en el tiempo 4,5. En ambos casos la craneotomía sólo afecta el hueso parietal, sin cruzar las suturas. Se cree ampliamente que el principal inconveniente de la técnica es su limitada aplicación a cortezas fácilmente accesibles, tales como el barril o de la corteza visual. La implantación de la ventana del cráneo sobre otras regiones plantea muchas dificultades, debido a un sangrado excesivo y / u obstáculo espacial. En este artículo se propone la implantación de la ventana del cráneo por encima de la corteza retroesplenial (RSC) como otra posible zona de interés para los dos fotones en la microscopía in vivo 6. RSC es un elemento importante del circuito cerebral responsable de la formación de la memoria espacial. Anatómicamente, RSC es una parte de una red neuronal de conexión cortical, del hipocampo, y las regiones talámicas 7. Esmuy involucrado en una serie de comportamientos, tales como el aprendizaje espacial y la extinción, así como la navegación espacial 6. Con el fin de visualizar los cambios morfológicos de las neuronas que utilizamos una línea de ratón transgénico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el promotor thy1. En estos ratones, GFP se expresa en aproximadamente el 10% de las neuronas en el cerebro que permiten una visualización clara de los axones y dendritas corticales utilizando microscopía de dos fotones 8. Otra innovación que proponemos es la inyección de un serotipo recombinante adeno-asociado virus 2/1 (rAAV2 / 1) que codifica una proteína fluorescente de color rojo (mCherry) bajo un promotor específico de neuronas CaMKII 9 en las estructuras más profundas del cerebro que se proyectan hacia RSC , tales como el hipocampo. La expresión de rAAV2 / 1 mCherry en el hipocampo de ratón Thy1-GFP permite la visualización simultánea de elementos pre y postsinápticos del Hippocampo-Cortical 10 sinapsis. La expresión impulsada por el rAAV de mCherry requiere dos a tres semanas para la proteína para alcanzar el nivel suficiente en los terminales axonales. Este período es consistente con el tiempo usual requerido para la recuperación de la craneotomía.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drug</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>AErrane 8DG9623</td>
			<td>5-2% pre-operative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>AErrane 8DG9623</td>
			<td>1.5-2% during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexametasone</td>
			<td>Scan Vet</td>
			<td>Dexasone 2mg/ml</td>
			<td>0.2 mg/kg intramuscular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2.50%</td>
			<td>5 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tolfedine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>4%</td>
			<td>4 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butomidor</td>
			<td>Richter Pharma</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>2 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>KRKA-Polska</td>
			<td>Rycarfa 50mg/ml</td>
			<td>10 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Jelfa</td>
			<td>Lignocainum</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Jelfa</td>
			<td>20 mg/g</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Spongostan dental; REF MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Dedra</td>
			<td>Lubrithal</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA glue</td>
			<td>Pelikan Daniel</td>
			<td>20G Huste</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>SpofaDental</td>
			<td>Duracryl Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>HSE-64-0720</td>
			<td>3 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Sigmed</td>
			<td>Keystone KVet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation bar</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>M2 or M3 screw nuts could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Renex</td>
			<td>PN-7B-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BM.183.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>KOZO</td>
			<td>XTL6445T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder frame</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Upright Axio Examiner Z1</td>
			<td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus</td>
			<td>gift from K. Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

La expresión de GFP en un subconjunto de neuronas en el ratón reportero Thy1-GFP permite imágenes in vivo de las dendritas corticales y proyecciones axonales locales en RSC. La Figura 1A muestra la máxima proyección de una pila de imágenes con múltiples dendritas GFP-positivas visibles. El cuerpo de la célula es oscurecida por una arteria. La Figura 1B muestra una imagen ampliada de un solo plano (zoom digital 3x) de la rama dendrítica se indica en 1A. Los detalles de la morfología dendrítica (espinas, filopodios) son claramente visibles. El canal de GFP se adquiere mediante el filtro de paso de banda de emisión de 500-550 nm. Una inyección de la rAAV2 / 1 mCherry en el hipocampo dorsal permite la visualización de los axones del hipocampo y botones sinápticos que terminan en RSC. Estos terminales pueden ser detectados en el canal mCherry (la emisión de paso de banda de filtro 570 a 610 nm). Figura 1. Dos canales vivo de dos fotones de imágenes de las neuronas del hipocampo de RSC y proyecciones a RSC en. (A) Una visión general de las células que expresan GFP en un fragmento de la RSC (imagen mostrada en colores invertidos). proyección máxima que se muestra de una pila de espesor 100 micras tomada a bajo aumento (zoom digital de 0,7x). (B) plano óptico individual del fragmento indicado en (a) adquiridos a gran aumento (zoom digital 3x) en el canal de GFP. (C) fragmento plano óptico individual se indica en (A) utilizando los ajustes de adquisición mCherry. Véase el Protocolo para los detalles de los filtros de detección. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53528/53528fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex at JoVE.com

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K vistas.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Video: Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Investigación

Neurociencias

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

La detección de la hipoxia Microrregional en corteza cerebral de ratón por la imagen de dos fotones de fluorescencia endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

En Vivo De dos fotones microscopía de terminaciones nerviosas individuales en la piel

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...