Name: gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform
Uploaded: 2016-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
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Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM y SGF), R01 AI054928 (SGF) y R01 DE017088 (SGF).

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional del Instituto de Investigación Biomédica de Los Ángeles (protocolo 011 000) y se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el tratamiento ético de los animales. Los ratones fueron enjaulados en un centro acreditado por AAALAC ubicado en el campus de Harbor-UCLA Instituto de Investigación y Educación. Un veterinario a tiempo completo que se especializa en medicina de animales de laboratorio supervisó su cuidado. Se proporcionó enjaulamiento y la cría de acuerdo con las directrices de la publicación Servicio de Salud Pública &quot;Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio&quot;. Cada intento se hizo para tratar los ratones con humanidad. La supervivencia y la salud de los ratones se controló tres veces al día. Obviamente, ratones letárgicos enfermos fueron separados del grupo y se sacrificaron para minimizar el sufrimiento. Los ratones fueron sacrificados por sobredosis de pentobarbital (210 mg / kg), según lo recomendado por el Grupo sobre Euthanasia de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria. 1. Preparación de tejidos, reactivos e instrumentos <ol><li> Utilice macho Balb / c ratones pesando 20-22 de g para todos los estudios. Inocular tres ratones por grupo experimental por vía intravenosa con 1 x 10 6 levadura en fase C. albicans células. Sacrificar animales y los riñones de la cosecha en puntos específicos de tiempo después de la infección. Coloque cada riñón en un tubo de tapón de rosca, encaje congelación en nitrógeno líquido, y se almacenan a -80 ° C para la extracción de ARN más tarde 6. Nota: Los experimentos con animales se llevaron a cabo como se describe en detalle en Xu et al 6.. </li><li> Preparar los siguientes reactivos e instrumentos antes de retirar los riñones de la -80 ° C congelador: <ol><li> Abra un kit de extracción de RNA total. Añadir 2-mercaptoetanol (1% v / v) para amortiguar RLT y mezclar bien (preparar 2 ml para cada muestra). </li><li> Preparar fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25: 24: 1 (necesita 600 l de cada muestra). </li><li> Tubos de etiquetas de tipo M de homogeneización (M-tubo) y el enfriamiento en hielo. </li><li> Etiqueta 2 ml tornillo tubos de tapa, y añaden aproximadamente 300 cuentas Zirconia mu l a cada tubo. </li><li> Verificar los instrumentos están disponibles: disociador tejido, BeadBeater, centrífuga de mesa con adaptadores para tubos de 50 ml y placas de 96 pocillos, fotómetro. </li></ol></li></ol> 2. Extracción de ARN a partir de tejidos infectados <ol><li> Retire los tubos que contienen riñones de -80 ° C congelador y poner en hielo. Añadir 1,2 ml de tampón RLT con 2-mercaptoetanol a cada riñón. Decantar riñón con tampón en un tubos de homogeneización de tipo M. </li><li> Homogeneizar el riñón usando un disociador de tejido en la pre-cargado RNA_02.01 ajuste. </li><li> Centrifugar a 1000 xg durante 1 min en una centrífuga de mesa a TA. </li><li> Transfiera 600 l homogeneizado al tubo de tapón de rosca que contiene perlas de óxido de zirconio. Guarde el homogeneizado restante en el hielo. </li><li> Añadir 600 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25: 24: 1 alos tubos desde el paso anterior. </li><li> Cierre las tapas herméticamente y agitar en BeadBeater durante 3 minutos en un 4 ° C cámara frigorífica. </li><li> Centrifugar los tubos a 15.000 xg durante 5 min en una habitación fría 4 ° C. </li><li> Transferir con cuidado la fase acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezclar bien con un volumen igual de etanol al 70%, a continuación, cargar en la columna de centrifugación (carga dos veces). </li><li> Lavar la columna de centrifugación una vez con 700 RW l de tampón, seguido por dos veces con 500 l de tampón RPE. Centrífuga un minuto extra en un tubo de recogida seco para eliminar el líquido residual en la columna de centrifugación. Realice todos los pasos de la centrifugación a 8000 x g. </li><li> Eluir el ARN con 50 l H 2 O. Medir la concentración de ARN en OD 260 utilizando un espectrofotómetro. </li></ol> 3. El uso de perfiles de expresión génica Digital Bar-codificación <ol><li> Conjunto de códigos Descongele reportero (tubo verde cap) y conjunto de códigos de captura (tubo gris cap) en hielo. </li><li> Añadir 130 l de tampón de hibridación a la reporter conjunto de códigos, invierta para mezclar y centrifugar. </li><li> Añadir 20 l de la mezcla a cada uno de los tubos de reacción 12. </li><li> Añadir 10 g de RNA total de tejido (en un volumen de 5 l) a cada tubo. Mezclar con la pipeta. </li><li> Añadir 5 l captura de juego de códigos a cada tubo. Mezclar volteando el tubo seguido de un rápido giro hacia abajo. </li><li> Se incuban las reacciones a 65 ° C en un termociclador con tapa calentada O / N (~ 18 h). </li><li> Retire un cartucho de muestra de -20 ° C y deje que se caliente a temperatura ambiente. </li><li> Retire dos placas de reactivos de 4 ° C y centrifugar a 670 xg durante 2 min en una centrífuga de mesa. </li><li> Configure la estación de la preparación siguiendo las instrucciones paso a paso en la pantalla, seleccione la opción de alta sensibilidad. </li><li> Retire las reacciones del termociclador y cargar inmediatamente en la estación de la preparación. Seleccionar para ejecutar el programa de alta sensibilidad (3 h). </li><li> Cuando el programa de la estación de preparación, retire el cartucho y sellar los carriles con una cinta adhesiva transparente. Apcapa de aceite mineral a la parte inferior del cartucho (para la generación de un solo nCounter solamente, las generaciones posteriores no requieren este paso), a continuación, cargar el cartucho en el analizador digital. </li><li> Configurar el analizador digital de seguir las instrucciones paso a paso en la pantalla, seleccione la opción de escaneo de alta resolución. </li><li> Seleccione la opción (600 campos) de alta resolución, ejecute el programa de exploración (~ 4,5 h). </li><li> Cuando el programa de exploración es completa, descargue los resultados (o optar por recibir los resultados por correo electrónico), e importar datos en bruto en el software del fabricante. El software comprueba automáticamente la calidad de los datos y aumentar banderas si la calidad de los datos caen fuera del rango normal. Realizar ajuste técnico utilizando la función integrada (opcional, siga las instrucciones en el software), a continuación, exportar los datos como un archivo de Excel. </li><li> Normalizar los datos utilizando uno de los métodos siguientes: recuento total de todos los genes en el conjunto de códigos; uno o unos pocos genes de control interno; significado geometricogenes altamente expresados ​​(véase el debate). </li><li> Calcular los valores medios de expresión para cada gen (si el experimento se hizo en réplicas o triplicado), a continuación, calcular la relación de los niveles de expresión entre los diferentes grupos experimentales. </li><li> (opcional) Analizar y visualizar los resultados de perfiles de funciones integradas en el software nSolver o un programa de la agrupación como MultiExperiment Visor 10. </li></ol>

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	<li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-infecting+fungal+transcriptome.">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li><li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq.">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection.">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).</li><li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host.">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li><li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis.">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo.">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li><li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4:+a+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li></ol>

This protocol is developed in the laboratory of Dr. Aaron P. Mitchell at Carnegie Mellon University. The publication of this manuscript is sponsored by NanoString Technologies.

Este protocolo ha sido desarrollado para optimizar el perfil transcripcional de infectar a microbios utilizando una plataforma nanoString nCounter. Todo el procedimiento, desde la recogida de tejidos para los datos de expresión, requiere menos de 48 hr. Las manos a la vez es de alrededor de 4 horas para 12 muestras. Una variable clave en este protocolo es la cantidad de tampón RLT añadido al tejido en el primer paso. El exceso de tampón diluirá el homogeneizado y conducir a disminuir la concentración de ARN, mientras que muy poco tampón puede conducir a la formación de geles viscosos después de la etapa de extracción con fenol-cloroformo y no dejan fase acuosa para la recuperación de ARN. Los volúmenes óptimos determinados empíricamente de RLT buffer para tejidos de ratón (asumiendo tamaños típicos) son: riñón (1,2 ml), lengua (1,0 ml) y pulmón (2,0 ml). Para los patógenos microbianos, especialmente éstos cultivan en forma filamentosa, el paso de talones golpeando ayuda a romper la pared celular de espesor para liberar totalmente contenido celular. En la etapa de elución, con el fin de aumentar el final de ARNla concentración, la primera ronda de eluato se puede añadir de nuevo a la columna y eluir una segunda vez. Aproximadamente 100 g de ARN total de tejido pueden ser recuperados de una columna RNeasy spin (~ 2 g / l x 50 l). Si se necesita mayor cantidad de ARN, una segunda preparación se puede hacer desde el homogeneizado de tejido restante. No tire del homogeneizado restante hasta que la concentración de ARN se ha medido, por si acaso. Dependiendo del modelo de la infección, el tamaño del inóculo y la cepa del agente patógeno, el porcentaje de ARN patógeno en el ARN total del tejido varía de 0% -2%, y típicamente está comprendido en el intervalo de 0,05% -0,5%. Por ejemplo, 10 g de ARN total de tejido de C. albicans infectado riñón podría generar recuentos primas igual a la de 10 ng de pura C. albicans ARN a partir de un cultivo in vitro (10 ng / 10 g = 0,1%). Debido a que el porcentaje de ARN patógeno en RNA total de tejido varía en una amplia gama, es difícil saber la cantidad de pathogen ARN en una cantidad dada de ARN total. Para evitar la pérdida de masa conjunto de códigos (por 250 genes x 192 reacciones, el costo por reacción es alrededor de $ 200) en muestras con ARN de patógenos por debajo del nivel de detección, una etapa de control de la calidad del ARN se puede realizar para determinar el nivel de ARN de patógenos dentro de cada muestra. Esto se puede hacer por cualquiera de Q-RTPCR o un pequeño conjunto de códigos que contiene unos pocos genes de limpieza. La normalización usando genes de patógenos es un paso crítico antes de que los perfiles de expresión se pueden comparar entre muestras diferentes. Hay tres métodos comúnmente utilizados para la normalización. 1. Utilizar los recuentos totales de todos los genes en el conjunto de códigos. 2. Utilice uno o unos pocos genes &#39;limpieza&#39;. 3. Utilice la media geométrica (N º raíz del producto de n números) de los genes altamente expresados. Para un gran conjunto de códigos (&gt; 100 genes) que contiene sondas seleccionadas al azar, utilizando el recuento total para la normalización puede ser una buena opción, ya que los recuentos totales de un gran número de genes no relacionados pueden religiosasreflejar totalmente la cantidad de entrada RNA. Para un pequeño conjunto de códigos (&lt;100 genes) que contienen las sondas se centraron en un proceso específico (como el crecimiento de las hifas, dado que los genes de crecimiento hifal tienden a ser co-regulado), la elección de uno o unos pocos genes de limpieza como el control para la normalización es esencial. TDH3, un gen metabólico enérgicamente expresado, ha servido bien como control para muchos experimentos. El tercer método es un híbrido de método 1 y 2, con énfasis para la igualdad de la contribución de los genes altamente expresados. Aunque la plataforma nCounter no está en todo el genoma, que permite la cuantificación del nivel de expresión para un máximo de 800 genes en un solo ensayo. Por lo tanto, la elección de los genes más informativos para analizar es crítica para el éxito de la elaboración de perfiles. Se han utilizado dos enfoques para seleccionar para las sondas. El primer enfoque es &quot;basada en el conocimiento&quot;. Información expresión Datos publicados y funcional está compilado para la detección de genes que son de interés potencial de la corrienteestudiar, tales como los genes de respuesta ambientales 6-9. Este enfoque permite una fácil comparación de perfiles de datos in vivo a muchos conjuntos de datos existentes, por lo tanto, proporcionar un contexto para la interpretación de datos. El segundo enfoque es &quot;la exploración basada&quot;. Una categoría de genes en un genoma de microbios, como todos los genes que especifican los factores de transcripción, quinasas o proteínas de la pared celular son elegidos por las sondas. Este enfoque permite la identificación de factores de virulencia novedosos y descubrimiento de nuevas relaciones de regulación en función de la in vivo de datos de perfiles 6.

Dinámica de la expresión génica contiene información vital acerca de cómo una célula responde a los cambios ambientales. En el caso de un microbio infeccioso, datos de expresión génica podrían proporcionar información clínicamente relevantes sobre cómo un patógeno se adapta al entorno infección y causa daños a la máquina. En las últimas dos décadas, los estudios de expresión génica tanto in vitro como in vivo han generado gran cantidad de datos y sentado una base para la comprensión de la biología de la infección 3.1. Sin embargo, las tecnologías de perfiles actuales, incluyendo microarrays y RNAseq, no son óptimos para el perfilado de la expresión génica patógeno durante la infección. Alojar RNA constituye una porción abrumadora (normalmente&gt; 99%) del ARN total aislado de muestras de tejidos infectados. El ARN de acogida contribuye al alto fondo en microarrays, y domina la secuencia se lee de RNAseq. Aislamiento de células del patógeno del tejido infectado, en teoría, puede ayudar a enriquecer el ARN de patógenos, pero plantea ademásproblemas cols: requiere grandes cantidades de tejido infectado; el procedimiento puede ser tedioso; y lo más importante, es difícil de conservar el estado o la integridad de ARN nativa durante el largo proceso. Con el fin de generar datos más completos y precisos sobre la expresión de genes de patógenos durante las infecciones reales, nos propusimos desarrollar un protocolo que permite la cuantificación fiable y rentable de especies de ARN minoría en una población mixta de ARN. NanoString nCounter es una plataforma de reciente desarrollo que hace la medición multiplexado directa de la expresión génica utilizando pares de sondas digitales con código de barras 4, 5. Esta plataforma tiene un nivel de sensibilidad comparable a la de QRT-PCR, pero no requiere amplificación enzimática. La tecnología no es el genoma, que permite la detección de hasta 800 genes diferentes en cada ensayo. Por lo tanto, es crítico para seleccionar los genes informativos como sondas para perfiles. Aquí utilizamos perfiles de expresión génica estudio de un zumbido importanteun patógeno, Candida albicans, durante una infección invasiva como ejemplo, para demostrar: 1) Los detalles técnicos de los procedimientos experimentales (protocolo), 2) La sensibilidad, reproducibilidad y el rango dinámico de este método (resultados representativos), y 3) Importante Consideraciones para el diseño y realización de experimentos basados ​​en este protocolo (discusión). Este protocolo se puede adaptar fácilmente para diversos patógenos y se ha aplicado con éxito en un número de modelos de infección 6-9.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M tube</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia beads</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Analysis system</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Gene Expression Codesets</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Analysis tool</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform

Para la mayoría de los patógenos de mamíferos, perfiles de expresión génica estudios se han limitado por las dificultades técnicas para cuantificar con precisión transcritos de genes de patógenos a partir de tejidos infectados. Patógeno RNA constituye una pequeña porción del ARN total aislado de muestras de tejidos infectados. Tanto microarrays y tecnologías RNAseq tienen dificultades para generar confiable lee para los genes de patógenos débilmente expresadas. Las cepas mutantes de patógenos con una reducción en la proliferación in vivo plantean un reto aún mayor. Aquí se describe un protocolo de perfiles vivo en la expresión génica que es muy rápido, extremadamente sensible y altamente reproducible. Hemos desarrollado este protocolo durante nuestra investigación de los hongos patógenos de Candida albicans en un modelo murino de candidiasis hematógena diseminada. El uso de este protocolo, hemos documentado cursos de tiempo de regulación dinámica C. la expresión génica albicans durante la infección de riñón, y las características inesperadas descubiertas derespuestas de expresión génica para el tratamiento de drogas antifúngicas in vivo.

Uno de los retos principales para la expresión de genes de patógenos de perfiles in vivo es conseguir suficiente lee de ARN patógeno. Dado el bajo porcentaje de transcripciones de patógenos en el ARN total, gran cantidad de RNA total (&gt; 10 g) tiene que ser utilizada para cada reacción. La plataforma tiene una ventaja única en esta perspectiva: utiliza tanto una sonda de captura y una sonda de informe para aumentar la especificidad, de modo que la abrumadora cantidad de ARN de acogida no causa un significativo nivel de ruido. Como se muestra en la Figura 1 (adaptado de Ref. 6), los recuentos de fondo primas procedentes de una muestra de tejido no infectado (puntos rojos) fueron todas por debajo de 10, mientras que los recuentos primas procedentes de dos muestras de tejidos infectados (puntos azules) eran todos por encima de 10. Expresión de datos generados utilizando este protocolo son altamente reproducible. Como se muestra en la Figura 1 (adaptado de Ref. 6), los recuentos de primas a partir de dos réplicas biológicas (puntos azules, muestras después de la infección de riñón 48 hr) tenía muy good correlación, con valor R cuadrado es igual a 0.945. La plataforma también proporciona suficiente rango dinámico para abarcar los niveles de expresión biológicos naturales (Figura 1, los recuentos en bruto osciló entre 10 y 10 1 6). El uso de una sonda conjunto especificando 248 genes de respuesta ambiental, hemos sido capaces de discernir dos fases de la expresión de genes de patógenos (Figura 2, adaptado de Ref. 6): una respuesta de la expresión génica temprana comprende genes con niveles de ARN significativamente diferentes entre el inóculo y 12 horas muestras después de la infección (P &lt;0,05 y&gt; 2 veces el cambio en la expresión), y una respuesta de la expresión génica tardía comprende genes con niveles de ARN que son significativamente diferentes entre el punto de tiempo de 12 horas a las muestras después de la infección 48 h (P &lt;0,05 y&gt; cambio en la expresión de 2 veces). Estos resultados indican que C. la expresión génica albicans se regula dinámicamente durante INFECTIO invasivan de un huésped mamífero. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> Figura 1. Raw cuenta a partir de tejidos renales infectados y no infectados (adaptado de Ref. 6). Sonda cuenta para dos infectada (después de la infección 48 h, los puntos de datos de color azul) y uno (puntos de datos rojos) no infectadas muestras de riñón se presentan como una dispersión trama. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> Figura 2. Expresión de C. albicans genes de respuesta al medio ambiente durante la infección invasiva (adaptado de Ref. 6). Los cambios en los niveles de expresión durante la invasión de riñón de ratón para 248 C. genes albicans se presentan en un calor mformato ap. Los valores medios de los triplicados biológicas se muestran para la regulación (amarillo) y baja regulación (azul) de los genes a las 12, 24 y 48 horas después de la infección con respecto a los niveles medios de inóculo (0 h). La saturación de color representa la magnitud del cambio de expresión, con la saturación completa en 10 veces la altura o baja regulación. Las porciones del mapa de calor se expanden para ilustrar representante temprano hasta reguladas genes (arriba), genes tardíos (centro), y genes principios regulados hacia abajo (abajo). En estas partes, las muestras individuales se presentan por separado para ilustrar la reproducibilidad. Definimos los cambios de expresión tempranas como diferencias significativas entre el inóculo y 12 muestras hr. Definimos los cambios de expresión finales como diferencias significativas entre las muestras 12 y 48 hr. Importancia refiere a los cambios de&gt; 2 veces y un valor de p &lt;0,05. Los datos para cada muestra se normalizaron a los niveles de ARN de TDH3 gen de control antes se calcularon los valores medios. Nuestros criterios de asignación permiten cierto Dynamicagenes regulados lly caigan en tanto las clases de expresión temprana y tardía. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Perfiles de expresión génica de los microbios Infección de Uso de una Plataforma Digital Bar-codificación

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

gene-expression-profiling-infecting-microbes-using-digital-bar-coding

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K vistas.  Carnegie Mellon University. We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Video: Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

Las perturbaciones de circulación miRNAs en el Síndrome del Intestino Irritable detectó utilizando una plataforma de expresión de genes de multiplexado de alto rendimiento

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Investigación

Genética

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Multiplex detección de bacterias en el complejo de muestras clínicas y ambientales utilizando oligonucleótidos de acoplamiento de microesferas fluorescentes

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Inmunología e Infección

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

Análisis de imágenes de código de barras multiplexadas para inmunoperfilado y caracterización de mapeo espacial en el análisis unicelular de muestras de tejido de parafina

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Investigación sobre el cáncer

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Biología del Desarrollo

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Bioingeniería

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Biología

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

Análisis de transcriptoma de alto rendimiento para investigar las interacciones huésped-patógeno

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

La secuenciación de próxima generación de 16S ARN ribosomal genes Amplicones

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...