Esta técnica permite una cuantificación precisa y precisa de microorganismos a partir de una población mixta de cepas muy similares utilizando técnicas moleculares rápidas y de alto rendimiento. En última instancia, al permitir comparaciones de aptitud entre cepas. La capacidad de evaluar simultáneamente muchas cepas en una sola piscina reduce sustancialmente la variabilidad de bien a pozo u organismo a organismo, ya que todas las cepas están expuestas exactamente a las mismas condiciones.
La adaptabilidad de esta técnica permite su uso para casi cualquier organismo genéticamente maleable y casi cualquier diseño experimental que requiera una cuantificación precisa de los microbios. Comience este procedimiento con la ingeniería de marcadores genéticos en cromosomas bacterianos, como se describe en el protocolo de texto. Cree un conjunto de ADN genómico que contenga todos los códigos de barras excepto uno.
Utilice esta piscina como diluyente para realizar una serie de dilución con ADN genómico que contiene el único código de barras restante. Preparar reacciones para PCR digital por duplicado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para el uso de una supermezcla PCR digital diseñada para la química basada en sondas. Utilice el ADN genómico agrupado como ADN de plantilla.
Además, agregue la sonda de imprimación 20 X Master Mix como se describe en el protocolo de texto. Preparar las reacciones de control de réplica para PCR digital de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las reacciones de control para cada combinación de sondeos deben constar de Sin controles de plantilla, controles negativos y controles positivos.
Repita estos pasos para crear reacciones PCR digitales para cada muestra de ADN genómico con código de barras. Generar gotas para cada condición de reacción utilizando un generador de gotas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Transfiera las gotas recién creadas a la placa de 96 pozos adecuada.
Utilice puntas de pipeta de 200 microlitrotros en una pipeta multicanal de 5 a 50 microlitrotros. Después de que todas las gotas se han generado y transferido, sellar la placa con un sellador de placa de papel de aluminio. Utilice el ciclor térmico recomendado por el fabricante para realizar las condiciones de ciclismo.
Mientras se realiza el termociclismo, programe el software de análisis de datos con la información de configuración de la placa, como el nombre de la muestra, el tipo de experimento y supermix utilizado. Incluya también el nombre de destino 1 y el tipo de destino 1, así como el nombre de destino 2 y el tipo de destino 2. Una vez completado el termociclismo, transfiera las reacciones completadas al lector de gotas e inicie el proceso de lectura, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cuando se hayan leído todos los pozos y se haya completado la ejecución, abra el archivo de datos QLP utilizando el software de análisis de datos. Seleccione todos los pozos que utilizan la misma sonda de imprimación Mastermix. En la pestaña Droplets, examine el número de gotas analizadas en cada pozo, incluidas las gotas positivas y negativas.
Excluir del análisis cualquier pozo que sea menos de 10.000 gotas totales. Vaya a la pestaña Amplitud 1D y examine las amplitudes de las gotas positivas y negativas. Asegúrese de que comprenden 2 poblaciones distintas.
Dentro del software, utilice la característica de umbral para hacer un corte entre las gotas positivas y negativas para cada sonda que se utilizó. Una vez que se hayan aplicado los umbrales apropiados a todos los pozos, el software calculará el número de copias de ADN en cada reacción. Exporte datos a una hoja de cálculo para facilitar el análisis posterior.
Con estos valores, calcule el número de copia inicial de cada código de barras genómico único de la muestra. Determinar la tasa media de falsos positivos de las reacciones de control negativas y restar este valor de los valores obtenidos en reacciones experimentales. Multiplique los valores según sea necesario, en función de las diluciones que se realizaron al configurar cada experimento.
Ahora, determinar la aptitud relativa de un organismo calculando el índice competitivo o cancelando el índice competitivo a partir de la cuantificación digital basada en PCR de la cepa con código de barras. Realice este paso para cada cepa con código de barras en todos los puntos de tiempo. El ADN genómico que contiene el código de barras AA se diluyó en un fondo de todos los demás ADN genómico con códigos de barras.
El canal 1 representa la sonda FAM para el código de barras AA, mientras que el canal 2 representa la sonda HEX para el código de barras AO. Los resultados de cada sonda se presentan como amplitud fluorescente de gotas individuales y un histograma que representa la frecuencia de intensidad fluorescente de todas las gotas en los pozos seleccionados. Para cada condición, las gotas positivas y negativas deben formar 2 poblaciones distintas.
Las poblaciones deben separarse utilizando la característica de umbrales para definir gotas positivas y negativas. Los valores de umbral variarán dependiendo de los sondeos que se utilizaron, pero todos los pozos que utilizan la misma mezcla de sonda deben tener umbrales idénticos. En el caso de AA que se diluyó, el histograma parece representar sólo la población única porque las gotas positivas son sustancialmente superadas por gotas negativas.
Sin embargo, 2 poblaciones distintas siguen siendo visibles examinando la amplitud fluorescente de las gotas en los paneles izquierdos. A medida que el ADN genómico con código de barras AA se diluyó, hubo una disminución en las gotas positivas, mientras que el número de gotas de AO positivas permanece constante. Una vez que se hayan aplicado los umbrales apropiados a todos los pozos, el software calculará el número de copias de ADN en cada reacción.
Si realizas la PCR de forma rutinaria como parte de tu investigación, puedes realizar esta técnica para evaluar la idoneidad de tu organismo modelo. Este procedimiento se utilizaría normalmente para determinar los resultados finales de los experimentos ascendentes. Su verdadera utilidad es promover la facilidad y versatilidad para cualquier experimento que dependa de la cuantificación bacteriana.
Estamos utilizando esta técnica para evaluar el estado de la salmonela en un modelo murino de infección. Además, esta técnica se está adaptando para su uso con otros microorganismos patógenos en nuestro laboratorio.
