El estudio fue apoyado en parte por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer, el Centro para la Investigación del Cáncer.

El protocolo descrito se emplea de acuerdo con las normas de NIH sobre el uso de muestras de tejidos humanos. 1. Preparación de Tejido <ol><li> Antes de comenzar, obtener muestras de tejidos humanos de acuerdo a la Junta de Revisión Institucional (IRB) protocolos. </li><li> Elija el tipo de bloque de tejido / célula y el correspondiente método de procesamiento [fijado en formol e incluido en parafina (FFPE), congelados, o etanol-fijo incluido en parafina (EFPE)]. La fijación en formol proporciona histología óptimo, seguido por la fijación de etanol y flash congelado. Sin embargo, los métodos de procesamiento de fijación y tejidos pueden afectar el ADN, el ARN y cantidad de las proteínas y de calidad para el análisis molecular de aguas abajo y se deben considerar. </li><li> Corte las secciones de bloque de tejido / célula en el tipo de diapositiva (vidrio, vidrio de la membrana o membrana estructura de metal) de su elección. Análisis SIVQ funciona igual de bien en los tres tipos de diapositivas. Tenga en cuenta que el método de pseudo-cubreobjetos (descrito más adelante) con xilenos y ethanol no se puede realizar en las diapositivas de la membrana estructura metálica ya que el deslizamiento debe ser invertido en el escenario. </li><li> Seleccionar una mancha de tejido química-o basado en IHC para identificar las células de interés desde el fondo. Tenga en cuenta que los métodos de tinción también pueden afectar el ADN, ARN, y la calidad y cantidad de la proteína de tejido. Pruebe el tejido después de la tinción para evaluar la calidad de línea de base de biomoléculas antes de proceder con el protocolo. SIVQ-LCM se ha realizado en portaobjetos de tejido / citología teñidas con: inmunohistoquímica (IHC) con DAB 15, inmunofluorescencia, rojo rápido, de novo rojo, azul de toluidina, y hematoxilina y eosina (H &amp; E) (datos no publicados). </li></ol> 2. Espécimen Imaging <ol><li> Carga se desliza sobre la etapa motorizada del instrumento microdisección y lanzar el software relacionado. Seleccione las casillas de verificación para designar las posiciones de las diapositivas cargadas y asegurar los archivos de imágenes capturadas se guardan en formato JPEG. </li><li> Optimizar el imcalidad edad ajustando el brillo y enfoque de la imagen en la pantalla, usando la ruedecilla de enfoque manual o por medio de software del instrumento de disección. <ol><li> El uso de la caja de herramientas de imagen dentro del software del instrumento de disección, establezca adecuadamente la ganancia de brillo de la lámpara y la cámara. Los valores de ejemplo son el brillo = 60 y la ganancia = 220, con el difusor. </li><li> Enfoque manualmente o con la función de enfoque automático en el software. </li></ol></li><li> Captura de una imagen de visión en miniatura de la diapositiva para proporcionar una hoja de ruta para el proceso de disección. <ol><li> Para obtener una calidad óptima de la imagen de una diapositiva uncoverslipped, utilizar el difusor por debajo del condensador en el instrumento, o bien, añadir una pequeña cantidad (~ 30 l) de etanol o xileno para mejorar el índice refractario (pseudo-cubreobjetos). Al utilizar xilenos, ser conscientes de que están deben utilizar medidas de seguridad tóxicos y adecuados, incluyendo el uso de una campana de humos y bata de laboratorio protectora, gafas protectoras y guantes. </li><li> NO coloque el tapón LCM en la diapositiva hasta que la solución de etanol o xilenos ha desaparecido por completo o el polímero de la tapa será distorsionada. </li></ol></li><li> Navegar por el tobogán y capturar imágenes de las áreas a ser diseccionados a 10X, 20X o 40X. Si es necesario, mejorar la imagen con software como Autocorrección (en Microsoft Office Picture Manager) como se ha descrito previamente 22. Las imágenes deben ser capturadas en formato jpeg para que puedan volver a ser adquiridos por el software de selección automatizado. </li></ol> 3. Análisis del algoritmo de la Imagen <ol><li> Transferencia de imágenes capturadas desde el instrumento microdisección a la carpeta SIVQ. Instale y abra los paquetes de software ArcturusXT, AutoScan y SIVQ en el ordenador conectado al instrumento de disección. Para el acceso al software SIVQ, por favor póngase en contacto con el Dr. Ulises Balis (ulysses@med.umich.edu). </li><li> Abrir SIVQ y cargar la imagen capturada (jpeg) de interés. &lt;/ Li&gt; <li> Navega hasta el área de interés y / o ajustar el tamaño de las ventanas de exhibición (Visor 5 y 6). En el software SIVQ, Viewport 5 muestra la imagen pre-procesamiento y Viewport 6 muestra la imagen post-procesamiento 16. </li><li> Elija el tamaño del vector del anillo y el número de anillos que se utilizarán. </li><li> Seleccione la función de imagen de predicado para ser capturado por clic derecho sobre él en Viewport 6. </li><li> Haga clic en &quot;Scan&quot; para analizar la imagen. </li><li> Ajustar la probabilidad estadística de imagen coincidente utilizando las dos barras deslizantes. La barra superior ajusta la especificidad global de vectores, y se utiliza para excluir el área de la exploración inicial (con una sensibilidad tal como se define por la variable &quot;Estadística&quot; seleccionado) que puede representar área incluida excesiva. Por el contrario, la corredera inferior se utiliza para aumentar la sensibilidad, después se lleva a cabo una exploración, con la intención de aumentar la superficie que se clasifica como un partido. Estos dos controles deslizantes UTIlizar la variable &quot;Stat&quot; como el umbral inicial de sensibilidad de referencia. </li><li> Para guardar la imagen, haga clic en &quot;guardar como jpeg&quot; (imagen se guarda en c :/ vq_test carpeta / fotos). </li><li> Analizar la imagen con el algoritmo. La salida del algoritmo de análisis debe resultar en una imagen anotado para que sea utilizado en SIVQ-LCM. En la actualidad, la versión actual del núcleo del motor SIVQ está en fase beta de pruebas versión con la expectativa de que la versión de producción completo (Q1 disponibles 2014) incorporará un kit de desarrollo de software completo (SDK) y la interfaz de programación de aplicaciones (API) para la integración simplificada de filtros espaciales generados por el usuario y las etapas de procesamiento de datos de flujo de trabajo corriente abajo con el motor de juego de anillo central. Este SDK se distribuye con un conjunto completo de la documentación. <ol><li> Asegúrese de que el mapa de calor SIVQ se cambia a un color rojo uniforme. </li></ol></li><li> Exportar la imagen. Es esencial volver a insertar las coordenadas de posición en el post-análisis de imágenes jpeg con un editor hexadecimal para pegar en la cabecera del archivo de la imagen original de instrumento de disección. Los datos correspondientes se pueden encontrar entre &quot;Inicio de Imagen&quot; marcador (0xFF, 0xd8) y el primer &quot;Definir Cuantificación Tabla&quot; marcador (0xFF, 0xDB). </li></ol> 4. Microdissection <ol><li> Coloque la tapa del LCM en el centro de la región de interés, donde se capturaron las imágenes para el análisis SIVQ. </li><li> Calibrar y control de calidad (QC) los láseres de UV / IR y optimizar los parámetros, incluyendo la energía, la duración, las ubicaciones de láser, y la velocidad de corte de UV (tal como se recomienda por el fabricante). Realizar estas calibraciones antes de volver a importar la imagen analizada. </li><li> AutoScanXT abierto (software de selección automatizada) e importar la imagen analizada desde c :/ vq_test carpeta / fotos. </li><li> Capacitar al software de selección automatizado para reconocer la anotación SIVQ y crear el mapa de la disección. <ol><li> Para crear un traiarchivo ning, seleccione cuatro regiones de interés (marcados con &quot;círculos azules&quot;) en la &quot;pintura roja&quot; de la imagen analizada SIVQ. </li><li> Seleccione las áreas de fondo (marcados con &quot;cuadros rojos&quot;) que no se van a diseccionado. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Analizar&quot; para generar el archivo de entrenamiento, que se pueden guardar para usos posteriores. </li></ol></li><li> Realizar microdisección mediante el (UV) láser de infrarrojos apropiado (IR) y / o ultravioleta. <ol><li> Copie las áreas seleccionadas en la imagen &quot;en vivo&quot;. </li><li> En la caja de herramientas &quot;microdissect&quot;, seleccione la captura IR apropiada o botones de corte UV. </li></ol></li><li> Después de la disección está completa, mueva el tapón LCM a la estación de control de calidad y la captura de una imagen de los tejidos / células disecadas. Otro enfoque consiste en colocar la tapa en un área en blanco de la diapositiva antes de mudarse a la estación de control de calidad, lo que permite al usuario tomar fotografías con distintos aumentos. </li><li>Captura de una imagen de la zona de tejido de interés después de microdisección para evaluar la eficiencia de elevación. </li><li> Si las células deseadas han sido disecados correctamente, haga clic en el botón &quot;estado actual&quot; en el software ArcturusXT y quitar el tapón LCM para iniciar el procedimiento de extracción molecular para el análisis de aguas abajo. </li></ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons.">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIVQ-aided+laser+capture+microdissection:+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling.">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).</li><li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Invariant+Vector+Quantization:+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology.">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13 (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm.">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification.">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ.">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB:+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies.">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37 (2011).</li><li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples.">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Microarrays+(IMA):+Digital+Pathology's+Missing+Tool.">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li><li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments.">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li></ol>

Michael R. Emmert-Buck es un inventor de patentes de los NIH que cubren láser captura microdissection y recibe los pagos en forma de regalías a través del Programa de Transferencia de Tecnología de NIH.

Se presenta un protocolo para la aplicación de SIVQ-LCM a microdissect células epiteliales immunostained de FFPE tejido mamario humano. El uso de un algoritmo de análisis de imágenes, tales como SIVQ, reduce la cantidad de manos sobre el tiempo requerido para el proceso de microdisección. Este es un avance potencialmente importante para el campo desde el tiempo del operador y esfuerzo es típicamente el paso limitante de la velocidad para la disección precisa de las células de interés. En el presente protocolo, se adaptó específicamente nuestro procedimiento al instrumento ArcturusXT, aunque es probable que sea posible adaptar SIVQ y otros algoritmos para otros instrumentos de microdisección disponibles en el mercado también. Además de mejorar la eficiencia, este nuevo enfoque puede permitir a los usuarios que son expertos no histopatología para realizar microdisección. Finalmente, el uso de un algoritmo para conducir el proceso de microdisección puede permitir una mayor reproducibilidad de sitio a sitio mediante la eliminación de la subjetividad de usuario en la identificación de células o<html> interés f. Mientras SIVQ exhibe amplia adaptabilidad a múltiples clases de imagen materia, incluyendo la histología, es importante reconocer que no es la intención de servir como una herramienta de procesamiento / segmentación universal de la imagen, sino más bien, como una alta eficiencia de la selección de primer plano de primer paso herramienta. Utilizado de esta capacidad, tiene alta utilidad para predecir si o no una clase particular de la materia imaginería es adecuado para aproximaciones numéricas de segmentación. Cuando SIVQ tiene éxito, existe un alto poder predictivo que sea: a) un enfoque de análisis de imagen / segmentación más refinada y específica será un gran éxito y / o b) una, SIVQ vector máquina seleccionada optimizado será efectiva en la prestación de una clínica- solución de flujo de trabajo listo. En cualquier circunstancia, el uso de SIVQ sirve como una herramienta de triaje eficaz para identificar la materia imaginería que plantea soluciones computacionalmente tratables en términos de segmentabilidad primer plano. ntent &quot;&gt; Mientras que hemos descrito anteriormente el uso del protocolo SIVQ-LCM sólo para experimentos de microarrays expresión de ARNm 15, creemos que el protocolo es aplicable a la mayoría de los ensayos moleculares aguas abajo, y puede ser particularmente útil para los ensayos moleculares que requieren un gran número de células, tales como la proteómica Para estos estudios, grandes cantidades de células necesitan para ser adquiridos debido a la incapacidad para amplificar las proteínas.. Además, la llegada de las tecnologías más recientes, como Next-Gen Sequencing (NGS), hace hincapié en la necesidad de comenzar con la mayor de una muestra pura como sea posible. La capacidad para SIVQ-LCM para aislar células a través de ambas características morfológicas y / o cualidades de tinción podría permitir la capacidad de aislar más fácilmente las poblaciones de células puras. Es fundamental contar con el tejido preparado adecuadamente para obtener resultados reproducibles, tanto para el análisis SIVQ y microdisección. Para las condiciones óptimas para el LCM es mejor realizar disecciona en un ambiente de baja humedad y mantener adecuadamente deshidrated tejido. Además, asegurar que la tinción del tejido es reproducible. Por último, la familiaridad con el instrumento de disección es esencial para el éxito de SIVQ-LCM. El protocolo SIVQ-LCM que aquí se presenta es el primer paso hacia la microdisección semi-automatizada, que puede tener aplicaciones en el futuro los ensayos clínicos ya que los métodos de disección actuales no son fácilmente capaz de manejar grandes cargas de trabajo. En resumen, creemos que SIVQ-LCM es una nueva incursión en el campo de la microdisección automatizado y proporciona un punto de partida para que los investigadores y desarrolladores de algoritmos pueden mejorar aún más la tecnología.

Originalmente desarrollado en la década de 1990, la microdisección de captura por láser (LCM) permite al usuario capturar con precisión las células específicas o regiones celulares de una sección de tejido histológico mediante visualización microscópica 1, 2. Muchos estudios que comparan el análisis molecular de LCM contra raspaduras de tejido ilustran el valor del método de 3-12. Además, hay tres publicaciones de protocolo de vídeo sobre la tecnología que están disponibles para su visualización 13, 14. Sin embargo, a pesar de su acreditado valor, LCM puede ser tedioso y laborioso cuando el objetivo de interés es una población de células dispersas en una sección de tejido heterogéneo, o cuando un gran número de células se necesitan para las aplicaciones posteriores específicos como la proteómica. La carga que supone para el operador humano nos ha llevado a desarrollar un enfoque disección semi-automatizado para LCM mediante la combinación de un potente algoritmo de análisis de imágenes para guiar el proceso de LCM 15. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En colaboración con la Universidad de Michigan, el laboratorio en el NIH extendió el previamente desarrollado y reportado espacialmente invariante cuantificación vectorial (SIVQ) algoritmo de una manera que le permita a semi-automatizar el proceso de selección de los tejidos intrínseca a microdisección guiada, con lo que dispone de una herramienta con el patólogo o científico vida en mente. Espacialmente invariantes cuantificación vectorial (SIVQ) es un algoritmo que permite al usuario simplemente &quot;clic&quot; en una característica histológica de interés para crear un vector de anillo (función de imagen de predicado) que se puede utilizar para buscar en toda la imagen histológica, ajustando el umbral estadístico según sea necesario 16-21. El mapa de calor resultante muestra la calidad de los partidos a la función inicial de la imagen predicado y se convierte posteriormente en un solo color (rojo) Mapa de la anotación en la que se puede importar en el instrumento LCM. El software de selección automatizado, AutoScanXT, entonces se utiliza para dibujar un mapa basadoen la anotación de SIVQ guiar la captura de las células diana de la muestra de tejido. El protocolo se detalla a continuación se describe la implementación de SIVQ al flujo de trabajo de microdisección.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Positive Charged Glass Slides</td>
			<td style="width:84px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4951Plus-001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Xylenes, ACS reagent, &#8805;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">247642</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td>
			<td style="width:84px;">The Warner-Graham Company</td>
			<td style="width:119px;">6.505E+12</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LCM0211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">ARCTURUSXT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">AutoScanXT Software</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td>
			<td style="width:84px;">University of Michigan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCM es una nueva metodología que automatiza y simplifica el proceso de disección con láser depende del usuario más tradicional. Su objetivo es crear una avanzada tecnología de la plataforma de disección láser, rápido personalizable. En este reporte se describe la integración del software de análisis de imágenes espacialmente invariante cuantificación vectorial (SIVQ) en el instrumento ArcturusXT. El sistema ArcturusXT contiene tanto un puerto de infrarrojos (IR) y ultravioleta (UV) de láser, lo que permite celular específico o grandes disecciones de la zona. El objetivo principal es mejorar la velocidad, la precisión y reproducibilidad de la disección con láser para aumentar el rendimiento de la muestra. Este nuevo enfoque facilita la microdisección de animales y tejidos humanos en la investigación y los flujos de trabajo clínicos.

Una sección de tejido de mama humana FFPE se inmunotiñó para citoqueratina AE1/AE3 utilizando un protocolo estándar IHC 23. Después de la tinción, la diapositiva de tejido se colocó en el escenario ArcturusXT y el protocolo SIVQ-LCM se inició como se describe anteriormente. Dado que el tejido no puede ser coverslipped para microdisección, las células teñidas + IHC pueden ser difíciles de discernir visualmente (Figura 1A). Por lo tanto, para proporcionar una mejor adaptación de índice y una imagen mejorada, se añadieron xilenos a la sección de tejido para crear un pseudo-cubreobjetos 15 (Figura 1B). A continuación, la imagen jpeg fue capturado de la zona pseudo-coverslipped e importarse en SIVQ para el análisis de algoritmos. Una característica imagen predicado (DAB mancha marrón oscuro) seleccionado por el usuario inicia el algoritmo SIVQ para analizar la imagen (Figura 1C). A continuación, el mapa de calor SIVQ se convirtió en una &quot;pintura roja&quot; que es reconocido por el software de selección automatizada (Figura 1D). Los xilenos se dejó evaporar y el mapa de calor SIVQ se importan en el software de selección automatizado (Figura 1 E) y las celdas resaltadas fueron disecados con el láser de infrarrojos. A continuación, la tapa LCM fue trasladado a la estación de control de calidad del instrumento ArcturusXT y una inspección visual para evaluar la eficiencia de la disección (Figura 1F). El tejido restante también fue inspeccionado (Figura 1G) y el mapa de calor SIVQ se importa nuevamente para evaluar la eficiencia de microdisección (Figura 1H). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51662/51662fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51662/51662fig1.jpg" /> Figura 1. SIVQ-LCM de IHC tiñe el tejido mamario FFPE. A) Imagen Uncoverslipped de citoqueratina AE1/AE3 tiñe el tejido mamario FFPE. B) Imagen xilenos recubierto (pseudo-coverslipped) del panel A. <strong&gt; C) SIVQ heatmap genera utilizando un vector de anillo (imagen predicado) capturada del cromógeno marrón. D) El mapa de calor se convierte en un solo color (rojo). En el ArcturusXT, el software AutoScanXT fue entrenado para reconocer la anotación roja. E) El mapa microdisección generada a partir del algoritmo AutoScanXT. F) La imagen de los microdissected células epiteliales de mama en la tapa de LCM. G) Imagen del tejido en la diapositiva después microdisección. H) Superposición del mapa microdisección (panel E) en el área de tejido que se diseca. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51662/51662fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM es un enfoque innovador que aprovecha un algoritmo informático, espacialmente invariante cuantificación vectorial (SIVQ), para conducir el proceso de microdisección láser captura (LCM). El flujo de trabajo SIVQ-LCM mejora en gran medida la velocidad y la exactitud de microdisección, con aplicaciones tanto en la investigación y ajustes clínicos.

Protocolo SIVQ-LCM para el Instrumento ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K vistas.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCM es un enfoque innovador que aprovecha un algoritmo informático, espacialmente invariante cuantificación vectorial (SIVQ), para conducir el proceso de microdisección láser captura (LCM). El flujo de trabajo SIVQ-LCM mejora en gran medida la velocidad y la exactitud de microdisección, con aplicaciones tanto en la investigación y ajustes clínicos. 

Video: SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Investigación

Biología

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Aislamiento de neutrófilos Protocolo

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

Un protocolo para la producción de KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

Un protocolo para la estructura de la proteína por computadora y la función de predicción

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Un protocolo simple para la extracción de hemocitos de orugas silvestres

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocolo para el uso de gen Set enriquecimiento análisis para identificar el modelo Animal adecuado para la investigación traslacional

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

Protocolo de análisis de reloj para análisis de imagen: Plugins de ImageJ

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...