وأيد هذه الدراسة في جزء من برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، ومركز أبحاث السرطان.

كان يعمل بروتوكول صفها وفقا للقواعد المعاهد الوطنية للصحة على استخدام عينات الأنسجة البشرية. 1. إعداد الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البداية، الحصول على عينات الأنسجة البشرية وفقا لمجلس المراجعة المؤسسية (IRB) البروتوكولات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار نوع من كتلة الأنسجة / خلية والمقابلة طريقة معالجة [الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE)، والمجمدة، أو الثابتة الإيثانول (EFPE) جزءا لا يتجزأ من البارافين]. يوفر التثبيت الفورمالين الأنسجة الأمثل، تليها تثبيت الإيثانول وفلاش المجمدة. ومع ذلك، يمكن تثبيت والأنسجة طرق المعالجة تؤثر على الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، وكمية البروتين والجودة للتحليل الجزيئي المصب وينبغي النظر فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المقاطع كتلة الأنسجة / خلية على نوع الشريحة (الزجاج، والزجاج الغشاء، أو إطار معدني الغشاء) في الاختيار. تحليل SIVQ يعمل بشكل جيد على قدم المساواة على جميع أنواع الشرائح الثلاث. يرجى ملاحظة أن الطريقة الزائفة ساترة (موضح أدناه) مع الزيلين وايثانرأ لا يمكن أن يؤديها على الشرائح غشاء إطار معدني منذ يجب مقلوب الشريحة على المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد وصمة عار الأنسجة الكيميائية أو بناء IHC لتحديد الخلايا من الاهتمام من الخلفية. ملاحظة يمكن أن تؤثر أيضا على أساليب تلطيخ DNA، RNA، ونوعية البروتين وكمية من الأنسجة. اختبار الأنسجة بعد تلطيخ لتقييم جودة خط الأساس من الجزيئات الحيوية قبل الشروع في البروتوكول. وقد تم تنفيذ SIVQ-LCM على شرائح الأنسجة / علم الخلايا ملطخة: المناعية (IHC) مع DAB 15، المناعي، والأحمر بسرعة، دي نوفو الأحمر، الأزرق طولويدين، والهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E) (بيانات غير منشورة). </li></ol> 2. عينة التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الشرائح على خشبة المسرح الآلية الصك تسليخ مجهري وإطلاق البرامج ذات الصلة. حدد خانات الاختيار لتعيين مواقف الشرائح تحميل الملفات والتأكد من الصورة الملتقطة هي ليتم حفظها بتنسيق JPEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين ايمجودة العمر عن طريق ضبط السطوع وتركيز الصورة على الشاشة، وذلك باستخدام إما عجلة التركيز اليدوي أو من خلال برامج الصك تشريح لل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أدوات الصورة داخل البرنامج أداة تشريح، وضبط سطوع المصباح وكاميرا ربح مناسب. القيم هي المثال سطوع = 60 وكسب = 220، مع الناشر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركز إما يدويا أو مع ميزة التركيز التلقائي في البرنامج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة نظرة عامة المصغرة في الشريحة لتوفير خارطة طريق لعملية تشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على جودة الصورة المثلى لشريحة uncoverslipped، واستخدام الناشر أدناه المكثف على الصك، أو إضافة كمية صغيرة (~ 30 ميكرولتر) إما الإيثانول أو الزيلين لتحسين مؤشر الحرارية (الزائفة ساترة). عند استخدام الزيلين، أن ندرك ويجب استخدام تدابير السلامة السامة والسليم لها، بما في ذلك استخدام غطاء الدخان ومعطف المختبر واقية، ونظارات العيون، وقفازات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تضع غطاء على الشريحة LCM حتى حل الإيثانول أو الزيلين وتطهيرها بالكامل أو سيتم مشوهة البوليمر على الغطاء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التنقل الشريحة والتقاط الصور من المجالات التي سيتم تشريح في 10X، 20X، 40X أو التكبير. إذا لزم الأمر، وتعزيز صورة مع البرمجيات مثل التصحيح التلقائي (في Microsoft Office مدير صورة) كما هو موضح سابقا 22. يجب التقاط الصور بصيغة JPEG للسماح لهم أن أعيد استيراد في البرنامج اختيار الآلية. </li></ol> 3. تحليل خوارزمية للصورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القبض على نقل الصور من أداة تسليخ مجهري إلى المجلد SIVQ. تثبيت وفتح حزم البرمجيات ArcturusXT، اوتوسكان وSIVQ على الكمبيوتر تعلق على صك تشريح. للوصول إلى البرنامج SIVQ، يرجى الاتصال بالدكتور يوليسيس باليس (ulysses@med.umich.edu). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مفتوحة SIVQ وتحميل الصورة التي تم التقاطها (JPEG) من الفائدة. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى مجال الاهتمام و / أو ضبط حجم نوافذ العرض (منفذ العرض 5 و 6). في البرنامج SIVQ، منفذ العرض 5 يظهر الصورة السابقة للتجهيز ومنفذ العرض 6 يظهر الصورة بعد المعالجة 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار حجم ناقلات حلقة وعدد الحلقات التي سيتم استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد ميزة الصورة الأصلية ليتم القبض عن طريق النقر على الحق في ذلك في إطار العرض 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر &quot;مسح&quot; لتحليل الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الاحتمال الإحصائي للصورة مطابقة باستخدام اثنين من قضبان الانزلاق. شريط العلوي يضبط خصوصية الشاملة ناقلات، ويستخدم لاستبعاد المنطقة من الفحص الأولي (مع حساسية على النحو المحدد من قبل &quot;ستات&quot; متغير مختارة) التي قد تمثل المنطقة شملت المفرطة. على العكس، يستخدم أقل المنزلق لزيادة الحساسية، وبعد إجراء الفحص، بقصد زيادة المساحة التي تصنف على كونها المباراة. كل من هذه الضوابط المنزلق التهاب المسالك البوليةليز على &quot;ستات&quot; المتغير كما عتبة حساسية خط الأساس الأولي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحفظ الصورة، انقر فوق &quot;حفظ ك JPEG&quot; (يتم حفظ الصورة الآن في ج :/ vq_test مجلد / صورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الصورة مع الخوارزمية. الناتج من تحليل الخوارزمية يحتاج أن ينتج في صورة مشروحة لذلك لاستخدامها في SIVQ-LCM. في الوقت الحاضر، والإصدار الحالي من المحرك الأساسي SIVQ هو في مرحلة تجريبية إصدار الاختبارات مع توقع أن النسخة الإنتاج الكامل (متاح Q1) 2014 ستضم مجموعة كاملة تطوير البرمجيات (SDK) واجهة برمجة التطبيقات (API) للتكامل مبسطة المرشحات المكانية المقدم من المستخدمين وخطوات سير العمل معالجة البيانات المصب مع المحرك الأساسي حلقة مطابقة. وسيتم توزيع هذا SDK مع مجموعة كاملة من الوثائق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن heatmap SIVQ يتم تغيير إلى لون أحمر موحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير الصورة. فمن الضروري لإعادة ترسيخ-الإحداثيات الموضعية في عمعاهدة الفضاء الخارجي تحليل صورة JPEG باستخدام محرر HEX للصق في رأس الملف من الصورة أداة تشريح الأصلي. ويمكن الاطلاع على البيانات المناسبة بين &quot;بداية الصورة&quot; علامة (عشرية 0xFF، 0xD8) وأول &quot;تعريف الجدول تكميم&quot; علامة (عشرية 0xFF، 0xDB). </li></ol> 4. تسليخ مجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء LCM في مركز المنطقة من الفائدة، حيث تم القبض على الصور لتحليل SIVQ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة وضبط الجودة (QC) الليزر الأشعة فوق البنفسجية / الأشعة تحت الحمراء وتحسين المعلمات، بما في ذلك الطاقة، والمدة، مواقع ليزر، وسرعة القطع الأشعة فوق البنفسجية (على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة). تنفيذ هذه المعايرة قبل إعادة المستوردة للصورة تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مفتوحة AutoScanXT (البرمجيات الاختيار الآلي) واستيراد الصورة تحليلها من ج :/ vq_test مجلد / بلدان جزر المحيط الهادئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدريب البرنامج الاختيار الآلي للاعتراف الشرح SIVQ وخلق خريطة تشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء تريملف نينغ، حدد أربع مناطق من الفائدة (تميزت &quot;الدوائر الزرقاء&quot;) على &quot;طلاء أحمر&quot; من SIVQ صورة تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد المناطق الخلفية (تميزت &quot;المربعات الحمراء&quot;) التي هي في عدم تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر &quot;تحليل&quot; لإنشاء ملف التدريب، والتي يمكن حفظها لاستخدامات لاحقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تسليخ مجهري باستخدام (UV) وأشعة الليزر المناسب والأشعة تحت الحمراء (IR) و / أو الأشعة فوق البنفسجية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ مناطق مختارة على &quot;العيش&quot; الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;microdissect&quot; الأدوات، حدد التقاط الأشعة تحت الحمراء المناسبة أو أزرار القطع الأشعة فوق البنفسجية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تشريح كاملة، حرك غطاء LCM إلى محطة مراقبة الجودة والتقاط صورة للتشريح الأنسجة / الخلايا. نهج آخر هو وضع غطاء على منطقة خالية في الشريحة قبل نقله إلى محطة مراقبة الجودة، وهذا يتيح للمستخدم التقاط الصور في تكبير مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">التقاط صورة للمنطقة الأنسجة من الاهتمام بعد تسليخ مجهري لمواصلة تقييم ورفع الكفاءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان قد تم تشريح الخلايا المطلوب بنجاح، انقر على زر &quot;المرحلة الحالية&quot; في البرنامج ArcturusXT وإزالة الغطاء LCM للشروع في إجراء استخراج الجزيئية لتحليل المصب. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue.">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. (8), (2007).</li><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature. 1, 586-603 (2006).</li><li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors:+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases.">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical &amp; experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Silvestri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+pathway+biomarker+analysis+of+human+cancer+reveals+requirement+for+upfront+cellular-enrichment+processing.">Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).</li><li>Eberle, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoguided+laser+assisted+microdissection+techniques+for+DNA+methylation+analysis+of+archival+tissue+specimens.">Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC medical genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC medical genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissected+mucosa+versus+whole+tissue+specimens+for+assessment+of+radiation-induced+dynamic+molecular+and+pathway+changes+in+the+small+intestine.">Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine.</a> PloS one. 8, e53711 (2013).</li><li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons.">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIVQ-aided+laser+capture+microdissection:+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling.">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).</li><li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Invariant+Vector+Quantization:+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology.">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13 (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm.">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification.">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ.">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB:+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies.">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37 (2011).</li><li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples.">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Microarrays+(IMA):+Digital+Pathology's+Missing+Tool.">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li><li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments.">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li></ol>

مايكل ر إيميرت-باك هو المخترع على براءة اختراع عقد NIH-يغطي الليزر التقاط تسليخ مجهري ويتلقى المدفوعات القائمة على الملوك من خلال برنامج نقل تقنية المعاهد الوطنية للصحة.

نقدم بروتوكول لتطبيق SIVQ-LCM إلى microdissect الخلايا الظهارية immunostained من FFPE أنسجة الثدي البشري. استخدام خوارزمية تحليل الصور، مثل SIVQ، يقلل من كمية التدريب العملي على الوقت اللازم لعملية تسليخ مجهري. هذا يمثل تقدما مهما محتملا للحقل منذ وقت مشغل والجهد هو عادة الحد من معدل خط...

وضعت أصلا في منتصف 1990s، التقاط الليزر تسليخ مجهري (LCM) تمكن المستخدم من التقاط أدق خلايا معينة أو المناطق الخلوية من قسم الأنسجة النسيجية عن طريق التصور المجهرية 1، 2. العديد من الدراسات المقارنة بين التحليل الجزيئي للLCM مقابل الورطات الأنسجة توضيح قيمة الأسلوب 3-12. بالإضافة إلى ذلك، هناك ثلاثة منشورات بروتوكول الفيديو على التكنولوجيا المتوفرة للعرض 13، 14. ومع ذلك، على الرغم من قيمته ثبت، ويمكن أن تكون مملة LCM وشاقة عندما يكون الهدف من الفائدة هو السكان الخلية المتفرقة في قسم الأنسجة غير المتجانسة، أو عندما يطلب أعداد كبيرة من الخلايا للتطبيقات المصب محددة مثل البروتينات. العبء الملقى على عاتق المشغل الإنسان أدت بنا إلى وضع نهج تشريح شبه الآلي للLCM من خلال الجمع بين قوية خوارزمية تحليل الصور لتوجيه عملية LCM 15. &lt;ع الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; وبالتعاون مع جامعة ميتشيغان، مختبرنا في المعاهد الوطنية للصحة مددت وضعت سابقا وذكرت ثابتة مكانيا ناقلات تكميم (SIVQ) خوارزمية بطريقة تسمح لها شبه أتمتة عملية الاختيار الأنسجة الذاتية لل تسترشد تسليخ مجهري، وبالتالي إتاحة أداة مع الطبيب الشرعي أو عالم الحياة في الاعتبار. ثابتة مكانيا ناقلات تكميم (SIVQ) هو خوارزمية التي تسمح للمستخدم ببساطة &quot;فوق&quot; على ميزة النسيجية التي تهم إنشاء عصابة ناقلات (ميزة صورة أصلية) التي يمكن استخدامها للبحث في صورة النسيجية بأكمله، وضبط عتبة الإحصائية حسب الحاجة 16-21. خريطة الحرارة الناتجة يعرض نوعية المباريات إلى ميزة الصورة الأصلية الأولية ويتم تحويلها لاحقا إلى لون واحد (الأحمر) خريطة الشرح التي يمكن استيرادها إلى الصك LCM. ثم يتم استخدام البرنامج الاختيار الآلي، AutoScanXT، لرسم خريطة مقرهاعلى الشرح SIVQ في توجيه القبض على الخلايا المستهدفة من عينة الأنسجة. يصف بروتوكول مفصلة أدناه تنفيذ SIVQ في سير العمل تسليخ مجهري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Positive Charged Glass Slides</td>
			<td style="width:84px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4951Plus-001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Xylenes, ACS reagent, &#8805;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">247642</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td>
			<td style="width:84px;">The Warner-Graham Company</td>
			<td style="width:119px;">6.505E+12</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LCM0211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">ARCTURUSXT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">AutoScanXT Software</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td>
			<td style="width:84px;">University of Michigan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCM هو منهجية جديدة بأتمتة ويبسط عملية تشريح الليزر التي تعتمد على المستخدم أكثر تقليدية. انها تهدف الى خلق المتقدمة، تخصيص بسرعة منصة تكنولوجيا تشريح الليزر. في هذا التقرير، ونحن تصف التكامل بين برامج تحليل الصور الثابتة مكانيا ناقل تكميم (SIVQ) على الصك ArcturusXT. يحتوي على نظام ArcturusXT كلا من الأشعة تحت الحمراء (IR) والأشعة فوق البنفسجية (UV) ليزر، مما يسمح للخلية معينة أو تشريح منطقة واسعة. الهدف الرئيسي هو تحسين السرعة والدقة، واستنساخ تشريح الليزر لزيادة الإنتاجية عينة. هذا النهج رواية يسهل تسليخ مجهري كل من الحيوانات والأنسجة البشرية في مجال البحوث وسير العمل السريري.

تم immunostained قسم أنسجة الثدي الإنسان FFPE لcytokeratin AE1/AE3 باستخدام بروتوكول قياسي IHC 23. بعد تلطيخ، وضعت الشريحة الأنسجة على المسرح ArcturusXT وبدأ بروتوكول SIVQ-LCM كما هو موضح أعلاه. منذ الأنسجة لا يمكن لcoverslipped تسليخ مجهري، يمكن للخلايا IHC + ملطخة يكون من الصعب تمييز بصريا (?...

Watch this Scientific Journal Video about SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument at JoVE.com

SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM هو نهج المبتكرة التي يسخر خوارزمية الكمبيوتر، مكانيا ثابتة ناقل تكميم (SIVQ)، لدفع التقاط الليزر تسليخ مجهري (LCM) العملية. سير العمل SIVQ-LCM يحسن كثيرا من سرعة ودقة تسليخ مجهري، مع تطبيقات في كل من البحوث والمرافق الصحية.

بروتوكول SIVQ-LCM لالصك ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K Views.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCM هو نهج المبتكرة التي يسخر خوارزمية الكمبيوتر، مكانيا ثابتة ناقل تكميم (SIVQ)، لدفع التقاط الليزر تسليخ مجهري (LCM) العملية. سير العمل SIVQ-LCM يحسن كثيرا من سرعة ودقة تسليخ مجهري، مع تطبيقات في كل من البحوث والمرافق الصحية. 

Video: SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

بروتوكول للتربية البعوض (A. الغامبية)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

العدلة عزل بروتوكول

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

بروتوكول لإنتاج Tetramer KLRG1

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

بروتوكول لبنية البروتين القائم على الحاسوب والتنبؤات وظيفة

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

A بروتوكول بسيط لاستخراج اليرقات من Hemocytes البرية

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض،<em&gt; بحمى الضنك</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

تعيين بروتوكول لاستخدام الجينات إثراء التحليل لتحديد نموذج الحيوان المناسب للبحوث متعدية

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

بروتوكول المسح الضوئي على مدار الساعة لتحليل الصور: إيماجيج الإضافات

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...