Parte 1. Prepare el área quirúrgica <ol><li> Si se trabaja con reactivos de riesgo biológico (por ejemplo, los vectores retrovirales), la cirugía debe ser realizada dentro de un gabinete de bioseguridad II (BSC). El microscopio de retrodispersión ultrasonido (UBM) debe sentarse al lado de la BSC, con el transductor en el interior del BSC, y en su lugar por un soporte de motor controlado en un escenario especialmente diseñado quirúrgica. Los componentes necesarios para construir el escenario se muestra en el video se muestran en línea. Esta lista, junto con imágenes de la etapa desde varios ángulos (a petición), en caso de permiso de construcción. </li><li> La apertura y cierre de la laparotomía (procedimiento quirúrgico en el que se corta la cavidad abdominal abierta para permitir el acceso a los órganos internos) se realiza generalmente en una almohadilla absorbente con soporte de plástico. Antes de la cirugía todas las herramientas necesarias (por ejemplo, navajas, tijeras quirúrgicas, pinzas, cargado autoclip aplicador, etc) y materiales (por ejemplo, PBS, suturas, anestésicos, el titular del ratón y placa superior, etc) deben ser esterilizados y colocados en el área quirúrgica. Limitar la cantidad de tiempo que la incisión se abra es importante para maximizar las posibilidades de éxito con la cirugía. Todo el manejo de los animales debe realizarse con guantes que han sido desinfectados con una solución MB-10, o su equivalente. Desinfección repetida se debe realizar cuando sea necesario para asegurar que los guantes estériles. </li></ol> Parte 2. Anestesia del ratón <ol><li> Llene una jeringa de 1 cc con la solución anestésica que contiene una parte Nembutal (50 mg / ml de pentobarbital) a 4 partes filtrada esterilizada 25 mg / ml sulfato de magnesio en PBS. Esto dará como resultado una solución que es de 10 mg / ml de pentobarbital y 20 mg / ml de sulfato de magnesio. Cada ratón para pesar cada sujeto, y se inyecta con 90 mg de pentobarbital por kg de peso corporal (por ejemplo, un ratón de 28 g se inyecta con 250 l). </li><li> Se inyecta en el abdomen (intraperitoneal IP,) de un ratón embarazadas en el día embrionario (E) 9.5 (puede utilizar otras edades, según sea necesario) que penetra la piel y los músculos abdominales. Permitir 8-12 minutos para que el ratón deje de responder. Anestesia adecuada debe ser confirmado por la postura relajada del animal, y la falta de movimiento en respuesta a la cola y aprieta el dedo del pie. Pellizcando suavemente entre las uñas de los dedos es muy sensible, y la falta de respuesta a los pellizcos ponga de manifiesto que los animales es lo suficientemente anestesiado. Tenga en cuenta incluso los animales que son completamente insensibles a pellizca la cola y los pies puede a veces un poco nerviosa en respuesta a la incisión quirúrgica inicial. Sin embargo, esta es una respuesta refleja y no indica una anestesia inadecuada. A base de petróleo bálsamo oftálmica se debe aplicar a los ojos del ratón para evitar que se seque durante la cirugía. </li><li> Puesta en marcha del área quirúrgica y la máquina de ultrasonido a la espera de convertirse en el ratón anestesiado. Dado que el uso de retrovirus o lentivirus requiere BSL2 de contención, como se ha dicho que las inyecciones virales se debe realizar en un gabinete de bioseguridad II. Además, todas las soluciones y los materiales desechables que entra en contacto con el virus, deben ser descontaminadas con una solución de lejía al 10%. Los instrumentos quirúrgicos y equipos de ultrasonido deben ser tratados con una solución desinfectante, como MB-10 ( <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ), o su equivalente utilizada por la instalación en cuestión. </li></ol> Parte 3. La exposición de los embriones <ol><li> Si es posible (dependiendo de las limitaciones de las instalaciones de animales y dado el espacio disponible), es preferible que el área de preparación quirúrgica en un lugar separado de la zona quirúrgica. Esto minimizará las posibilidades de contaminación cruzada entre animales. Para iniciar la cirugía, el lugar del animal sobre su espalda en una superficie absorbente estéril y lavar la zona abdominal a fondo con etanol al 70%. Tratamientos pre-quirúrgica más extensa puede ser empleado (por ejemplo, las rondas sucesivas de Betadine y el 70% se lava etanol), pero en nuestra experiencia esto no es necesario para este tipo de cirugía de roedores supervivencia. Usando una maquinilla de afeitar de doble filo, afeitar el vello del abdomen en un área de aproximadamente 1 pulgada de ancho y largo de 1,5 pulgadas. Use movimientos cortos de rápido con la navaja en un ángulo de aproximadamente 45 °. Es importante que el área quirúrgica adecuadamente tratadas, pero no sometido a la humedad excesiva, ya que esto puede dar como resultado escalofriante innecesario del animal, y, posiblemente, la hipotermia. </li><li> Usando tijeras quirúrgicas bien hacer una una &quot;incisión longitudinal a través de la piel, y luego a través del músculo abdominal del animal (corte a través de la celebración de tejido conectivo de la piel al músculo le ayudará con la segunda incisión). Tenga en cuenta que toda la atención procedimiento debe Es necesario asegurarse de que los instrumentos quirúrgicos siguen siendo estéril, y el tratamiento con desinfectante se debe realizar cuando sea necesario (es decir, si la información sobre herramientas en contacto con no-sterile material). </li><li> Utilizando unas pinzas con cuidado sacar cuernos uterinos, y registrar el número de embriones a cada lado. Dejando dos embriones adyacentes expuestos (selección de los cuales dos dependen de la configuración de cada lado), el lugar más de los cuernos uterinos de nuevo en el animal. En este contexto, dos embriones serán expuestos en un momento dado y se bañó en PBS, mientras que la madre se quede en su espalda. </li><li> Colocar el animal sobre su espalda en el soporte de plexiglás donde estará durante la cirugía (Figure1A) *. Luego, baje el tejido 10cm placa de cultivo ** (que deben ser desinfectados con MB-10 antes de su uso) hacia abajo sobre la madre, con un par de pinzas de colocarse ligeramente a través de la membrana de silastic verde (hecha con silicona RTV L base de goma, y el agente de curado, Dow-Corning números 3142761 y 2156946 del producto, respectivamente). A medida que baja el plato sobre el animal, el uso del fórceps para sujetar el tejido uterino entre los dos embriones que se inyecta, y suavemente tirar de ellos a través de la membrana. Al mismo tiempo, la placa se reduce completamente hacia abajo en el soporte, y las tachuelas son empujados para mantenerlo en su lugar. Pre-caliente (a 37 ° C) PBS se añade al plato para cubrir completamente los embriones. </li><li> Lugar la fase de inyección que contenga los animales y embriones expuestos en la sonda de ultrasonido (Figure1A) para crear imágenes en tiempo real de los embriones expuestos a través de la pared uterina (Figure1B). La sonda se baja entonces (usando los controles del motor) en el baño de PBS directamente sobre los embriones para obtener imágenes. Las imágenes se pueden obtener cuando la sonda es de aproximadamente 2.3 mm de distancia de los embriones. Es muy importante asegurarse de que la cabeza de la sonda no toque los embriones, ya que oscila de un lado a otro para recoger las imágenes. </li></ol> * El titular de la madre descansa en durante la cirugía puede ser realizada por un taller mecánico. Debe incluir una base de metacrilato de ancho, con dos lados de plexiglás pegado en la parte superior, y un espacio entre ellas (lo suficientemente amplia como para el ratón de forma mientras está acostado boca arriba). Las partes deben tener un suelo del valle de ellos, que se rellena con cera de color negro (por ejemplo, de una bandeja de disección). Que la cera sirve como el material en que se presiona chinchetas para sujetar la placa de PBS que los embriones se bañan en durante la inyección. ** Platos de 10 cm bacteriana debe tener un agujero (aproximadamente 2 cm de diámetro) golpeó fuera del centro de la parte inferior (esto se puede hacer con un portátil de trabajo pesado Punch y de 13/16 º matriz circular pulgadas: <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). Además, dos pequeños agujeros a cada lado del orificio central (alrededor de 1,5 cm de distancia) se debe quemar con una aguja calentada al fuego (o pueden ser hechos con un taladro, por supuesto). Estos agujeros son cubiertas con grasa de vacío y será donde las chinchetas que sujetan la placa en el soporte de impulsar en la cera color negro. La grasa de vacío para evitar que el PBS se escape. Parte 4. Carga de virus en una aguja de microinyección <ol><li> Moda de una aguja de microinyección de un chaflán de 1 mm (diámetro interior) sacó capilar de vidrio. La nitidez de la aguja es fundamental, y trabajar con una aguja lo suficientemente fuerte puede comprometer seriamente la penetración de la pared del útero y el saco amniótico, y puede conducir al fracaso experimental. La aguja afilada se coloca en el soporte de la pipeta, que está conectado mediante un tubo a una microjeringa de 25 l montado en un manual de infusión / extracción de la bomba (otros dispositivos se pueden utilizar para regular la carga y descarga de la aguja, pero esto es lo que se muestra en el video). Para obtener la respuesta óptima (para evitar la expansión y compresión asociadas con un sistema de llenado de aire), la microjeringa, el tubo y la aguja debe estar lleno de aceite mineral. </li><li> Antes de cargar la aguja asegurarse de que no haya burbujas de aire en el sistema de la jeringa hasta llegar a la punta de la aguja. A continuación, retroceder un pequeña burbuja de aire (1-2 mm de longitud) en la aguja antes de comenzar a cargar el virus. Esta bolsa de aire ayuda a mantener la separación entre el virus y el aceite mineral. La acción viral para ser inyectada debe contener polibreno a una concentración final de 0,08 mg / ml (para más información sobre la producción de virus, consulte las referencias 1, 2). Tenga en cuenta que concentran las poblaciones de antirretrovirales en general, contienen una cantidad significativa de partículas, que contiene la mayor parte del material infeccioso, por lo que no se puede filtrar a cabo sin un cinco - a la caída de 10 veces en el título. Además, dependiendo de la preparación, la acción viral puede ser viscoso a partir del ADN genómico de las células lisadas de embalaje (especialmente cierto si se utiliza 293 células para generar MLV / VSV virus pseudotyped). Si la alícuota del virus es viscoso, una pequeña cantidad de DNasa I puede y debe ser añadido para aflojar las acciones, o la carga de la aguja será extremadamente difícil. A<html> gota de la acción viral (80-10 l) se debe colocar en una hoja estéril de parafina en la preparación para la carga de la aguja. Luego, utilizando la bomba de la retirada, con cuidado la carga de la atención de la aguja para evitar pagar los zuecos. Coloque la aguja con peso en la posición micromanipulador en la zona de inyección, teniendo cuidado de no romper la aguja en los embriones, o la sonda de ultrasonido. Tenga en cuenta que si por alguna razón que la aguja se carga mucho antes de la inyección que ha de ocurrir que puede ser útil para extraer una pequeña cantidad de aire en la punta, que puede ser dado de alta antes de comenzar las inyecciones. Esta bolsa de aire puede proteger contra la acción viral de secado en la punta de la aguja (un hecho que casi siempre hacen que la aguja con peso inútil). </li></ol> Parte 5. El ultrasonido de inyección viral guiadas <ol><li> La imagen en tiempo real creado por la sonda de ultrasonido se visualiza en el monitor de vídeo, y pueden ser utilizados para guiar la aguja de microinyección en el embrión. El uso de este sistema de virus pueden ser inyectados en el saco amniótico en E8.5 o bien el saco amniótico o el sistema ventricular de E9.5-E11.5 (Figure1B). Esta es la parte más difícil del procedimiento y requiere una cantidad significativa de las manos en la experiencia de maestros (del orden de 50-20 horas, dependiendo del investigador). La punta de la aguja es evidente en la imagen de la ecografía como el punto más brillante en la pantalla, y debe ser visto en movimiento, de acuerdo con los ajustes de la posición de la sonda (utilizando los controles del motor y en los aviones y la z, y el control manual de la x avión). Es muy importante que la dirección de oscilación de la sonda será paralela a la longitud de la aguja. Esto asegurará que la punta de la aguja permanece en el plano de la imagen en movimiento a la posición de la inyección en el embrión. </li><li> El embrión debe ser posicionado de tal manera que la región de destino (en este caso el ventrículo del cerebro anterior) es fácilmente visible y se puede acceder a la aguja con la menor cantidad de material de útero en el camino de la inyección. Además, es muy importante no inyectar a través de la placenta. Una vez que la región del cerebro objetivo está alineado con la dirección de avance de aguja (usando la perilla en el micromanipulador), la aguja debe ser sólo tocar la pared uterina, y luego un golpe rápido corto primero debe penetrar en el tejido. Un enfoque similar se utiliza para penetrar en el saco amniótico y luego al cerebro. En algunos casos, el investigador y con experiencia puede golpear el ventrículo en un solo movimiento, sobre todo si la aguja es muy fuerte. La mecánica del movimiento de la sonda, la aguja, y los embriones (moviendo la madre sobre el escenario), requieren experiencia práctica para dominar. </li><li> Una vez que el número deseado de embriones se ha inyectado, cerca de la pared abdominal, con 5,0 puntos de seda. La mecánica de la sutura no son específicos para este tipo de cirugía. Finalmente, el uso autoclips veterinarios para la piel de primera necesidad a más de los puntos de sutura en el músculo abdominal. La sutura de la piel no es recomendable porque el ratón se regaña a los puntos de sutura. La analgesia se debe aplicar a la zona de la incisión para reducir la cantidad de dolor experimentado por el ratón, ya que despierta. Se recomienda que una solución de bupivacaína al 0,25% se inyecta (0,8 ml / kg, o de 2 mg / kg) por vía subcutánea cada pocos milímetros a lo largo del sitio de la incisión. </li><li> Mientras que el ratón se recupera Ponga el animal en un papel absorbente en una jaula limpia que contenga un paquete de gel (para facilitar la alimentación e hidratación). Colocar la jaula en un conjunto de diapositivas caliente a 37 ° C para mantener la temperatura corporal. Cuando despertó, coloque el ratón y el paquete de gel en una jaula limpia y volver a la rejilla de los animales. </li><li> Al día siguiente, el ratón para comprobar cualquier sangrado vaginal, las contracciones abdominales, y / o una mirada angustiada en general, todos los cuales indican el aborto. Si este es el caso, la eutanasia el ratón inmediatamente. El cabello bien peinado y un aspecto saludable en general indican una recuperación exitosa de la cirugía. Los embriones inyectados pueden ser sacrificados embrionaria o post-parto para su posterior análisis. Si el virus se expresa un gen, tales como la fosfatasa alcalina humana (PLAP) o GFP, una tinción a conocer rincones de la infección viral positivo (Figure1C). </li></ol> Resultados representante Embriones inyectados pueden ser sacrificados 1-2 días después de la inyección hasta el final a la edad adulta. Si el virus se expresa un gen, como PLAP o GFP, entonces reportero de la expresión sirve para identificar las células infectadas por virus y clones de las células. Por ejemplo, se muestra en la Figura 1C es una sección de tejido de un cerebro postnatal que fue infectado en el útero en E9.5 con un vector retroviral que expresan PLAP. Las células infectadas se visualizan como racimos púrpura después de la tinción histoquímica. Además de identificar las células infectadas por virus, reportero de la expresión permite examinar la morfología celular y la posición, así como el estado de la expresión génica. nt &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Inyección viral en los ventrículos del cerebro anterior E9.5 ratón. A. El animal anestesiado se coloca en el escenario de la inyección. Dos embriones se exponen y se coloca debajo de la sonda de ultrasonido que se indique (flecha). La aguja de microinyección lleno de virus se encuentra cerca de los embriones y se alinearon con la sonda de ultrasonido. B. captura de pantalla una imagen de ultrasonido en tiempo real de un embrión de ratón E9.5. V, en el ventrículo, AS, el saco amniótico, la Universidad de Washington, la pared uterina. C. Los embriones fueron inyectados con un virus que expresan PLAP en E10.5. Tinción histoquímica para PLAP revela la ubicación de los eventos de infección viral.

<ol>
	<li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range.">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li><li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li></ol>

Inyecciones virales con ayuda de ultrasonido se puede realizar a partir de E8.5-E11.5, donde sólo se puede inyectar en el saco amniótico en E8.5, mientras que tanto el saco amniótico y el sistema ventricular se puede inyectar de E9.5-E11.5. Cuando se realiza correctamente, las partículas virales se inyecta en el sistema ventricular con ayuda de ultrasonido tienen acceso a las células que recubren el sistema ventricular y, por tanto, pueden infectar a las diferentes estructuras del cerebro anterior (corteza cerebral, ganglios basales, diencéfalo, ojos, etc), el cerebro medio , y rombencéfalo (Figure1C). Virus se inyecta en el saco amniótico tiene acceso a las células en el exterior del embrión. Además de los virus, la guía del ultrasonido también se puede utilizar para inyectar las células en el embrión en desarrollo. Por lo tanto, esta técnica ofrece múltiples opciones para elegir (período de tiempo de desarrollo, estructura, virus / células) en el diseño de un experimento. Es fundamental que el virus inyectado o células expresan un reportero para una fácil identificación de las células infectadas / inyectado. Históricamente, los humanos fosfatasa alcalina placentaria (PLAP) o GFP se han utilizado. Por experiencia, hemos encontrado PLAP puede ser un gen muy útil debido a que ambos PLAP histoquímicas y tinción inmunohistoquímica produce una sola célula precisa y definida mancha que permite analizar la morfología celular y la posición, y para llevar a cabo un análisis clonal. Dado que la expresión de GFP viral puede ser débil, un reportero GFP puede no ser ideal para la tinción de los tejidos, pero es útil si se quiere obtener células individuales de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS).

&quot;Uno de los microscopios backscatter después de ultrasonido puede ser utilizado para este procedimiento. Aunque en el video de la P40 de paradigma médico-se utiliza, el P40 ya no está disponible en el mercado, y ha sido sustituido por el P60, que es de precio similar y puede ser utilizados para la misma aplicación. Los materiales adicionales que se describen para la construcción de la etapa son para uso con el paradigma-de dispositivos médicos (s). Vevo El 2100 viene con el equipo para obtener imágenes de pequeños animales. <ol><li> P60 biomicroscopio de ultrasonido (UBM) de Paradigm-Médico ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> Vevo 2100 de VisualSonics ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> Anestésicos y analgésicos La solución de Nembutal (50 mg / ml de sodio inyectable pentobarbital, producido por Abbott Laboratories) se puede obtener de la Salud Animal Bulter Schein. Tenga en cuenta que esta es una sustancia controlada II y requiere de una Agencia de Control de Drogas (DEA) para obtener la licencia. La solución de bupivacaína (0,25%, producido por Hospira, Inc., entre otros) se puede obtener de un número de distribuidores, incluyendo Moore médico.

ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at e9.5

En la cirugía de la supervivencia en ratones in utero permite la manipulación molecular de la expresión génica durante el desarrollo. Sin embargo, debido a que la pared uterina es opaco durante la embriogénesis temprana, la capacidad de dirigirse a partes específicas del embrión para la microinyección es muy limitada. Afortunadamente, la alta frecuencia de imágenes por ultrasonido permite la generación de imágenes que se pueden utilizar en tiempo real para guiar una aguja de microinyección de embriones en la región de interés. A continuación se describe el uso de imágenes como para guiar la inyección de vectores retrovirales en el sistema ventricular del cerebro anterior del ratón en el día embrionario (E) 9.5. Este método utiliza una laparotomía para permitir el acceso a los cuernos uterinos, y una placa especialmente diseñada que permite a los embriones de host que se bañaba en una solución salina mientras se crean imágenes y se inyecta. Cirugías exitosas a menudo resultan en la mayoría o la totalidad de los embriones inyectados sobrevivir a cualquier punto de tiempo posterior de interés (embrionaria o post-parto). Los principios descritos aquí se pueden utilizar con ligeras modificaciones para realizar las inyecciones en el fluido amniótico de embriones E8.5 (permitiendo así la infección a lo largo de la extensión antero-posterior del tubo neural, que aún no ha cerrado), o en el sistema ventricular del cerebro en E10.5/11.5. Además, a mediados de los años neurogénica (~ E13.5), la ecografía se puede utilizar la inyección directa en regiones específicas del cerebro de una infección viral o el trasplante de células. El uso de la ecografía para guiar en las inyecciones de útero en ratones es una técnica muy poderosa que permite la manipulación molecular y celular de los embriones de ratón de manera que de otra forma sería sumamente difícil si no imposible.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

En la cirugía de la supervivencia en ratones in utero permite la manipulación molecular de la expresión génica durante el desarrollo. A continuación se describe el uso de alta frecuencia, la ecografía para guiar la inyección de vectores retrovirales en el cerebro del ratón en el día embrionario (E) 9.5.

Guiada por ultrasonido microinyección en el cerebro anterior Ratón In Utero En E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

18.0K vistas.  Johns Hopkins University School of Medicine. En la cirugía de la supervivencia en ratones in utero permite la manipulación molecular de la expresión génica durante el desarrollo. A continuación se describe el uso de alta frecuencia, la ecografía para guiar la inyección de vectores retrovirales en el cerebro del ratón en el día embrionario (E) 9.5.

Video: Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Investigación

Neurociencias

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Microinyección insulina hipocampo y<em&gt; En vivo</em&gt; Microdiálisis durante la prueba de memoria espacial

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporación en el ratón C57BL / 6

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Guiada por ultrasonido microinyección en el cerebro anterior Ratón In Utero En E9.5

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