Teil 1. Bereiten Sie den OP-Bereich <ol><li> Wenn die Arbeit mit biologisch Reagenzien (zB retrovirale Vektoren), sollte die Operation innerhalb eines Biosafety II Gehäuse (BSC) durchgeführt werden. Die Ultraschall-Backscatter-Mikroskop (UBM) sollte neben der BSC zu sitzen, mit dem Wandler im Inneren des BSC, und in Position gehalten von einem Motor gesteuert Unterstützung auf einem speziell entwickelten chirurgischen Bühne. Die benötigten Komponenten auf die Bühne in dem Video zu sehen zu konstruieren sind on line aufgeführt. Diese Liste, zusammen mit Bildern von der Bühne aus verschiedenen Blickwinkeln (auf Anfrage), sollten die Genehmigungsauflagen Bau. </li><li> Das Öffnen und Schließen der Laparotomie (Eingriff in die Bauchhöhle aufgeschnitten, um den Zugang zu den inneren Organen ermöglichen wird) ist in der Regel auf eine saugfähige Unterlage mit Kunststoffträger durchgeführt. Vor der Operation alle notwendigen Tools (zB Rasierer, chirurgische Scheren, Pinzetten, geladen autoclip Applikator, etc) und Materialien (z. B. PBS, Nahtmaterial, Narkosemittel, die Maus Halter und die darüber liegenden Platte, etc.) sollte sterilisiert werden und platziert in die OP-Bereich. Begrenzung der Höhe der Zeit wird der Schnitt offen ist für die Maximierung der Chancen auf Erfolg mit der Operation wichtig. Alle tierischen Behandlung sollte mit Handschuhen, die mit MB-10-Lösung, oder das Äquivalent wurden desinfiziert durchgeführt werden. Wiederholte Desinfektion sollte durchgeführt werden, wie benötigt wird, um sicherzustellen, dass die steril sind. </li></ol> Part 2. Maus Anästhesie <ol><li> Füllen Sie eine 1 cc Spritze mit dem Narkosemittel Lösung mit 1 Teil Nembutal (50 mg / ml Pentobarbital) auf 4 Teile gefiltert sterilisiert 25 mg / ml Magnesiumsulfat in PBS. Dies wird in einer Lösung, die 10 mg / ml Pentobarbital und 20 mg / ml Magnesiumsulfat führen. Jede Maus individuell gewichtet werden sollen, und injiziert mit 90 mg Pentobarbital pro kg Körpergewicht (zB würde ein 28 gm-Maus mit 250 ul injiziert werden). </li><li> Inject in den Bauchraum (intraperitoneal, IP) einer schwangeren Maus an embryonalen Tag (E) 9.5 (können auch andere Zeiten als notwendig) eindringt sowohl die Haut und Bauchmuskeln. Lassen Sie 8-12 Minuten für die Maus, um nicht mehr reagiert. Eine adäquate Anästhesie sollte durch die entspannte Haltung des Tieres bestätigt werden, und der Mangel an Bewegung in Reaktion auf Schwanz und Zehen drückt. Gently Kneifen zwischen den Fingernägeln ist sehr empfindlich, und das Fehlen jeglicher Reaktion auf eine solche Kneifen zeigt an, dass die Tiere ausreichend betäubt ist. Beachten Sie auch Tiere, die völlig unempfänglich für Schwanz und Zehen drückt sich einige Male leicht zucken in Reaktion auf den ersten chirurgischen Eingriff. Allerdings ist dies eine reflexive Reaktion und kein Hinweis auf unzureichende Anästhesie. Petroleum-basierte Augenheilkunde Balsam sollte die Augen der Maus eingesetzt werden, um zu vermeiden Trocknung während der Operation. </li><li> Set-up der OP-Bereich und dem Ultraschallgerät während des Wartens auf die Maus, um sich betäubt. Da der Einsatz von Retroviren oder Lentivirus erfordert BSL2 Eindämmung, wie oben das virale Injektionen angegeben ist, muss in einem Biosafety II Cabinet durchgeführt werden. Darüber hinaus sollten alle Lösungen und Einweg-Materialien, die in Kontakt mit dem Virus kommt mit einem 10% Bleichmittel-Lösung dekontaminiert werden. Die chirurgischen Instrumente und Ultraschallgeräten sollte mit einer sterilisierenden Lösung wie MB-10 (behandelt werden <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ) oder einen gleichwertigen, von der Anlage in Frage verwendet. </li></ol> Teil 3. Die Exposition der Embryonen <ol><li> Wenn möglich (abhängig von den Zwängen des jeweiligen Tierhaltung und verfügbarer Speicherplatz) ist es bevorzugt, die OP-Vorbereitung in einer separaten Position aus dem OP-Bereich haben. Dies minimiert die Chancen für eine Kreuzkontamination zwischen den Tieren. Zur Einleitung der Operation, statt das Tier auf seinen Rücken auf einer sterilen absorbierenden Oberfläche und waschen Sie die Bauch-Bereich gründlich mit 70% Ethanol. Weitere umfangreiche präoperative Behandlungen eingesetzt (zB aufeinander folgende Runden Betadine und 70% Ethanol gewaschen) werden, sondern in unserer Erfahrung ist dies nicht notwendig für diese Art von Nagetier Überleben Chirurgie. Mit einem Double Edge Rasierer rasieren die Haare aus dem Bauch in einem Bereich von ca. 1 cm breit und 1,5 Zentimeter lang. Verwenden Sie kurze schnelle Bewegungen mit dem Rasiermesser in etwa einem 45 ° Winkel. Es ist wichtig, dass die OP-Bereich entsprechend behandelt werden, aber nicht zu starke Benetzung ausgesetzt, da dies zu einer unnötigen Kühlung des Tieres führen kann und möglicherweise sogar Hypothermie. </li><li> Mit feinen chirurgische Scheren einen 1 &quot;Längsschnitt durch die Haut zuerst, und dann durch die Bauchmuskulatur des Tieres (Schneiden durch Bindegewebe hält die Haut auf den Muskel mit dem zweiten Schnitt-Hilfe). Beachten Sie, dass während des gesamten Verfahrens ist darauf zu unternommen, um sicherzustellen, dass die chirurgischen Instrumente steril bleiben, und die Behandlung mit Desinfektionsmittel sollte durchgeführt werden, wie benötigt werden (dh wenn die Tooltips in Kontakt mit nicht-ste kommenrile Material). </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig herausziehen Uterushörner, und notieren Sie die Anzahl der Embryonen auf jeder Seite. Beim Verlassen zwei benachbarten Embryonen ausgesetzt (Auswahl, von denen zwei von der Konfiguration auf jeder Seite abhängen wird), legen die meisten der Uterushörner wieder in das Tier. In diesem Zusammenhang werden zwei Embryonen zu einem bestimmten Zeitpunkt ausgesetzt werden und badete in PBS, während die Mutter bleibt auf dem Rücken. </li><li> Legen Sie das Tier auf seinem Rücken in die Plexiglas-Halterung, wo es während der Operation (Abbildung 1a) wird *. Als nächstes niedriger die 10cm Gewebekulturschale ** (mit MB-10 vor desinfiziert werden sollten, um zu verwenden) nach unten über die Mutter, mit einer Pinzette leicht durch die grünen Silastic Membran (unter Verwendung von L RTV-Silikon-Gummi-Unterlage und legte Härter; Dow-Corning Produkt-Nummern 3142761 und 2156946, jeweils). Wie Sie die Platte weiter unten über das Tier, verwenden Sie die Zange, um die Gebärmutter-Gewebe zwischen den beiden Embryonen injiziert werden Griff, und ziehen Sie sie durch die Membran. Zur gleichen Zeit wird die Platte ganz nach unten auf den Halter, abgesenkt und die Reißzwecken sind eingedrückt, um es in Position zu halten. Vorgewärmten (37 ° C) PBS wird dann an das Gericht hinzugefügt, um vollständig zu bedecken die Embryonen. </li><li> Ort der Injektion der Bühne mit den Tier-und exponierten Embryonen unter der Ultraschallsonde (Abbildung 1a), um Echtzeit-Bildgebung des exponierten Embryonen durch die Gebärmutterwand (Abbildung 1B) zu schaffen. Die Sonde wird dann abgesenkt (mit dem motorisierten Kontrollen) in die PBS-Bad direkt über die Embryonen, die abgebildet werden. Bilder erhalten, wenn die Sonde beträgt etwa 2-3 mm entfernt von der Embryonen werden. Es ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass der Tastkopf nicht die Embryonen getroffen, wie sie hin und her pendelt, um Bilder zu sammeln. </li></ol> * Die Inhaber der Mutter ruht in während der Operation kann leicht durch eine Werkstatt vorgenommen werden. Es sollte eine breite Basis aus Plexiglas, mit zwei Plexiglas Seiten auf geklebt, und ein Raum zwischen ihnen (breit genug für die Maus, um fit im Liegen auf dem Rücken). Die Seiten sollten einen Talboden aus ihnen heraus, die dann mit schwarzem Wachs (zB von einer Dissektion Fach) gefüllt ist. Das Wachs dient als Material, in das Reißzwecken gedrückt halten Sie die Platte von PBS, dass die Embryonen in sind während der Injektion gebadet werden. ** 10cm bakterielle Gerichte sollten ein Loch (ca. 2cm Durchmesser) aus der Mitte der Unterseite (dies kann mit einem Heavy Duty Tragbare Punsch und einem 13/16 th Zoll Runddüse getan werden gestanzt: <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). Darüber hinaus sollten zwei kleine Löcher auf beiden Seiten des Loch in der Mitte (ca. 1,5 cm entfernt) mit einer Flamme erwärmt Nadel (oder sie könnten mit einem Bohrer natürlich gemacht werden) verbrannt werden. Diese Löcher werden dann mit Vakuum-Fett bedeckt werden und wo die Reißnägel, dass die Platte auf den Halter zu halten durch in den schwarzen Wachs zu drücken. Die Vakuum-Fett ist die PBS ein Auslaufen zu verhindern. Teil 4. Loading Virus in eine Mikroinjektionsnadel <ol><li> Mode ist ein Mikroinjektionsnadel durch Abschrägung ein 1mm (Innendurchmesser) gezogen Glaskapillare. Die Schärfe der Nadel ist von entscheidender Bedeutung, und die Arbeit mit einem unzureichend spitzen Nadel kann ernsthaft gefährden Durchdringung der Gebärmutterwand und der amnionic sac, und kann auf experimentelle Versagen führen. Der geschärfte Nadel wird dann in den Pipettenhalter, die über Schläuche zu einem 25 ul Mikrospritze in einem Handbuch Infusion / Entnahme Pumpe (andere Geräte verwendet werden, um das Be-und Entladen der Nadel zu regeln, aber dies ist das, was angebracht ist gelegt gezeigt, in dem Video). Für eine optimale Reaktionsfähigkeit (auf die Expansion und Kompression mit einer luftgefüllten System verbunden zu vermeiden), sollte der Mikroliterspritze, Schläuche, und die Nadel mit Mineralöl gefüllt werden. </li><li> Vor dem Laden der Nadel stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in das System von der Spritze den ganzen Weg bis zur Spitze der Nadel. Dann ziehen wieder eine kleine Luftblase (1-2 mm lang) in die Nadel vor dem Start zur Viruslast. Dieses Luftpolster hilft bei der Erhaltung Trennung zwischen dem Virus und der Mineralölindustrie. Die virale Lager, die injiziert werden sollen Polybren bei einer Endkonzentration von 0,08 mg / ml (für weitere Informationen über Virus-Produktion finden Sie Referenzen 1, 2) enthalten. Beachten Sie, dass konzentrierte retroviralen Aktien enthalten in der Regel eine erhebliche Menge an Feinstaub, die die Mehrheit der infektiöses Material enthält, und so kann nicht ohne eine 5 gefiltert werden - bis 10-fache drop in Titer. Auch abhängig von der Zubereitung kann die virale Lager werden viskosen aus der genomischen DNA der lysierten Verpackung Zellen (vor allem bei Verwendung von 293-Zellen zu MLV / VSV pseudotypisiert Virus zu erzeugen). Wenn der Aliquot-Virus ist zähflüssig, eine kleine Menge von DNAse I kann und sollte hinzugefügt, um die Lager zu lösen, oder das Laden der Nadel wird äußerst schwierig. A<html> Tropfen des viralen Bestand (8-10 mL) sollte auf einer sterilen Stück Parafilm in Vorbereitung Nadel Laden platziert werden. Dann, mit dem Rückzug Pumpe sorgfältig Belastung der Nadel Aufmerksamkeit auf Holzschuhen zu vermeiden. Setzen Sie den geladenen Nadel in den Mikromanipulator Position in der Einstichstelle, darauf achten, daß die Nadel auf die Embryonen oder die Ultraschallsonde zu brechen. Beachten Sie, dass wenn aus irgendeinem Grund die Nadel ist deutlich vor der Injektion erfolgen soll geladen kann es hilfreich sein, um eine kleine Menge Luft in die Spitze, die vor dem Start können die Injektionen entlassen werden zu zeichnen. Dieses Luftpolster kann gegen das virale Lager Trocknen an der Spitze der Nadel (ein Ereignis, das fast immer machen wird, die geladen Nadel nutzlos) zu schützen. </li></ol> Teil 5. Ultraschall Geführte Viral Injection <ol><li> Die Echtzeit-Bild von der Ultraschallsonde erstellt wird visualisiert auf dem Bildschirm und kann verwendet werden, um die Mikroinjektionsnadel in den Embryo Führer sein. Mit Hilfe dieses Systems Virus kann in der Fruchtblase bei E8.5 injiziert werden oder entweder die Fruchtblase oder das Ventrikelsystem von E9.5-E11.5 (Abbildung 1b). Dies ist der schwierigste Teil des Verfahrens und erfordert eine erhebliche Menge an praktischer Erfahrung zu meistern (in der Größenordnung von 5-20 Stunden, je nach der Ermittler). Die Nadelspitze ist im Ultraschallbild als die hellste Stelle auf dem Bildschirm ersichtlich und sollte gesehen bewegen in Einklang mit den Anpassungen der Sonde Position (mit dem motorisierten Kontrollen in der y-und z-Ebene, und die manuelle Steuerung in die x Ebene). Es ist sehr wichtig, dass die Schwingungsrichtung der Sonde parallel zur Länge der Nadel werden. Dies wird sicherstellen, dass die Nadelspitze in der Bildebene bleibt bei Bewegungen, um es für die Injektion in den Embryo Position. </li><li> Der Embryo ist so positioniert, dass die Zielregion (in diesem Fall das Vorderhirn Ventrikel) gut sichtbar ist, und ist zugänglich für die Nadel mit dem geringsten uterine Material in der Injektion Pfad sein. Darüber hinaus ist es entscheidend, nicht durch die Plazenta zu injizieren. Sobald das Ziel Hirnregion ist mit der Richtung der Nadel Aufstieg (mit dem Knopf an der Mikromanipulator) gefüttert, sollte die Nadel nur Berührung der Gebärmutterwand, und dann eine kurze schnelle jab freuen sollte das Gewebe eindringen. Ein ähnlicher Ansatz wird verwendet, um die amnionic sac und dann das Gehirn eindringen. In einigen Fällen können erfahrene Untersucher den Ventrikel in einer Bewegung getroffen, vor allem, wenn die Nadel ist sehr scharf. Die Mechanik der Bewegung der Sonde, die Nadel und die Embryonen (durch Verschieben der Mutter auf der Bühne), erfordern praktische Übungen zu meistern. </li><li> Sobald die gewünschte Anzahl von Embryonen injiziert wurde, in der Nähe der Bauchdecke mit 5,0 Seidenfäden. Die Mechanik der Naht sind nicht spezifisch für diese Art von Operation. Schließlich verwenden Veterinär autoclips zu heften die Haut zusammen über die Stiche in der Bauchmuskulatur. Naht der Haut wird nicht empfohlen, da die Maus kauen die Maschen. Analgesie sollte der Schnitt-Bereich angewendet werden, um die Stärke der Schmerzen mit der Maus, wie es weckt erfahrenen reduzieren. Es wird empfohlen, eine 0,25% Bupivacain-Lösung (0,8 ml / kg oder 2 mg / kg) injiziert werden subkutan alle paar Millimeter entlang der Inzisionsstelle. </li><li> Während sich die Maus wieder sanft lag das Tier auf saugfähigem Papier in einem sauberen Käfig mit einem Gel-Packung (zur Ernährung und Flüssigkeitszufuhr zu erleichtern). Setzen Sie den Käfig auf eine Folie wärmer eingestellt bei 37 ° C zu halten Körpertemperatur. Wenn geweckt, die Maus und die Gel-Packung in einen sauberen Käfig und zum Tier-Rack. </li><li> Am nächsten Tag überprüfen Sie die Maus für jede vaginale Blutungen, abdominale Kontraktionen und / oder eine allgemeine Distressed-Look, die alle Abtreibung hinweisen. Wenn dies der Fall ist, euthanize die Maus sofort. Gepflegte Haare und eine insgesamt gesunde Aussehen zeigen erfolgreiche Erholung von der Operation. Die injizierten Embryonen können embryonal oder postnatal für die weitere Analyse geopfert werden. Wenn der Virus drückt ein Reporter-Gen, wie menschliche alkalische Phosphatase (PLAP) oder GFP, wird eine Färbung zeigen Bereichen positive Virusinfektion (Abbildung 1C). </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Injizierten Embryonen kann geopfert 1-2 Tage nach der Injektion werden den ganzen Weg bis hin zum Erwachsenenalter. Wenn der Virus drückt ein Reporter-Gen, wie PLAP oder GFP, dann Reporter Ausdruck dient dazu, viral infizierte Zellen und Klone dieser Zellen zu identifizieren. Zum Beispiel, wie in Abbildung 1C ist ein Gewebeschnitt einer postnatalen Gehirns, die in utero an E9.5 mit einem retroviralen Vektor, PLAP infiziert war. Infizierte Zellen visualisiert werden als violette Cluster nach histochemische Färbung. Neben der Identifizierung viral infizierte Zellen erlaubt Reporterexpression man Zellmorphologie und Position, sowie Genexpression Status zu prüfen. nt &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Viral Injektion in die E9.5 Maus Vorderhirn Ventrikel. A. Die narkotisierten Tier auf die Injektion der Bühne platziert. Zwei Embryonen ausgesetzt und unter der Ultraschallsonde, wo (Pfeil) positioniert werden. Die Mikroinjektionsnadel mit Viren gefüllt ist in der Nähe des Embryos liegt und aufgereiht mit der Ultraschallsonde. B. Bildschirm eines Echtzeit-Ultraschall-Bilderfassung von einer E9.5 Maus-Embryo. V, Ventrikel, AS, Fruchtblase, UW, Uteruswand. C. Die Embryonen wurden mit einem PLAP-exprimierenden Virus bei E10.5 injiziert. Histochemische Färbung für PLAP zeigt den Standort der viralen Infektion Veranstaltungen.

<ol>
	<li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range.">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li><li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li></ol>

Viral-Injektionen mit Ultraschallkontrolle kann von E8.5-E11.5, wo nur die Fruchtblase bei E8.5 injiziert werden kann, durchgeführt werden, während sowohl die Fruchtblase und ventrikuläre System von E9.5-E11.5 eingespritzt werden kann. Wenn richtig ausgeführt, haben Viruspartikel in das Ventrikelsystem mit Ultraschallkontrolle injiziert Zugang zu den Zellen der ventrikulären System und kann daher die verschiedenen Strukturen des Vorderhirns (Neocortex, Basalganglien, Zwischenhirn, Auge, etc.), Mittelhirn infizieren und Hinterhirn (Abbildung 1C). Virus in die Fruchtblase gespritzt hat Zugriff auf die Zellen an der Außenseite des Embryos. Neben Viren können Ultraschallkontrolle auch verwendet, um Zellen in den sich entwickelnden Embryo zu injizieren. Daher bietet diese Technik mehrere Optionen zur Auswahl (Entwicklungs-Zeit, Struktur, Virus / Zellen) wählen bei der Gestaltung eines Experiments. Es ist wichtig, dass die injizierten Viren oder Zellen ein Reporter für eine einfache Identifizierung des infizierten / injizierten Zellen zum Ausdruck bringen. Historisch gesehen haben die menschliche Plazenta alkalische Phosphatase (PLAP) oder GFP eingesetzt. Aus Erfahrung haben wir festgestellt, PLAP kann eine sehr nützliche Reportergen werden, weil beide PLAP histochemische und immunhistochemische Färbung ergibt sich ein klares und deutliches einzelne Zelle färben, dass man Zellmorphologie und Position analysieren können, und um eine klonale Analyse durchzuführen. Da virale GFP-Expression kann schwach, kann ein GFP-Reporter nicht ideal für die Färbung Gewebe, ist aber nützlich, wenn man einzelne Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) erhalten will.

&quot;Eines der folgenden Ultraschall Backscatter-Mikroskope können für dieses Verfahren verwendet werden. Obwohl in dem Video die P40 von Paradigm-Medical verwendet wird, die P40 nicht mehr im Handel erhältlich und wurde von der P60, die preislich ähnlich ist und ersetzt für die gleiche Anwendung verwendet werden. Die zusätzlichen Materialien für Bühnenbau beschrieben sind für den Einsatz mit Paradigm-Medical-Gerät (s). Die Vevo 2100 kommt mit Ausrüstung für Kleintier-Bildgebung. <ol><li> P60 Ultraschall Biomikroskop (UBM) von Paradigm-Medical ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> Vevo 2100 von VisualSonics ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> Narkose-und Schmerzmittel Die Nembutal-Lösung (50 mg / mL injizierbaren Natrium-Pentobarbital, von Abbott Laboratories hergestellt) kann aus Bulter Schein Tiergesundheit erreicht werden. Beachten Sie, dass diese einen Zeitplan II geregelte Stoff und erfordert ein Drug Enforcement Agency (DEA) mit der Lizenz zu erhalten. Die Bupivacain-Lösung (0,25%; produziert von Hospira, Inc., ua) können aus einer Reihe von Händlern, einschließlich Moore Medical erhältlich.

ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at e9.5

In utero Überleben Chirurgie in Mäusen ermöglicht die molekulare Manipulation der Genexpression während der Entwicklung. Da jedoch die Uteruswand in der frühen Embryogenese undurchsichtig, ist die Fähigkeit, bestimmte Teile des Embryos für die Mikroinjektion Ziel stark eingeschränkt. Glücklicherweise erlaubt Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung die Generierung von Bildern, die in Echtzeit genutzt werden, um eine Mikroinjektionsnadel in den embryonalen region of interest Leitfaden kann. Hier beschreiben wir die Verwendung eines solchen bildgebenden auf die Injektion von retroviralen Vektoren in das Ventrikelsystem der Maus Vorderhirn an embryonalen Tag (E) 9,5 führen. Diese Methode verwendet eine Laparotomie den Zugang zu den uterinen Hörnern und einem speziell entwickelten Platte, die als Host Embryonen erlaubt, in Kochsalzlösung gebadet werden, während sie abgebildet sind und injiziert ermöglichen. Erfolgreiche Operationen oft in den meisten oder allen der injizierten Embryonen überleben zu einem späteren Zeitpunkt Point of Interest (embryonal oder postnatal) führen. Die hier beschriebenen Prinzipien können mit geringen Modifikationen verwendet werden, um Injektionen in den amnionic Flüssigkeit E8.5 Embryonen (wodurch eine Infektion entlang der vorderen hinteren Umfang des Neuralrohrs, die noch nicht geschlossen) durchführen, oder in das Ventrikelsystem des Gehirn E10.5/11.5. Darüber hinaus in der Mitte des neurogenen Alters (~ E13.5), können Ultraschall-Bildgebung direkte Injektion in bestimmten Hirnregionen für die virale Infektion oder Stammzelltransplantation eingesetzt werden. Der Einsatz von Ultraschall-Bildgebung in utero Injektionen in Mäuse Guide ist eine sehr mächtige Technik, die die molekularen und zellulären Manipulation von Maus-Embryonen erlaubt in einer Weise, die sonst äußerst schwierig wenn nicht unmöglich.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero Überleben Chirurgie in Mäusen ermöglicht die molekulare Manipulation der Genexpression während der Entwicklung. Hier beschreiben wir den Einsatz von Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung, um die Injektion von retroviralen Vektoren in Gehirn der Maus am Embryonaltag (E) 9,5 führen.

Ultraschall-gesteuerte Mikroinjektion in der Maus Vorderhirnneuronen In Utero In E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

18.0K Aufrufe.  Johns Hopkins University School of Medicine. In utero Überleben Chirurgie in Mäusen ermöglicht die molekulare Manipulation der Genexpression während der Entwicklung. Hier beschreiben wir den Einsatz von Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung, um die Injektion von retroviralen Vektoren in Gehirn der Maus am Embryonaltag (E) 9,5 führen.

Serie: Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Forschung

Neurowissenschaften

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Hippocampus Insulin Mikroinjektion und<em&gt; In vivo</em&gt; Microdialysis Während Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Vorderhirn Elektrophysiologische Aufzeichnung im Larven Zebrafisch

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...