Apoyo de la EB007279 subvenciones y HL081273 de los EE.UU. NIH se agradece.

1. Descripción general del protocolo de medición de oxígeno (Esta sección no tiene ningún tipo de acción, pero es crucial para entender el resto del documento. Puede ser filmado, por ejemplo, como una secuencia de diapositivas de un Punto de unos pocos de energía, acompañado por la voz.) 1.1) La sonda se introduce en el medio de interés, por ejemplo, se inyecta en la sangre o los líquidos intersticiales de un animal. 1.2) El objeto (la superficie de los tejidos) se ilumina con la luz de longitud de onda apropiada con el fin de promover la investigación sobre su estado excitado triplete. Normalmente, la excitación se produce a través del mecanismo de un fotón. Sin embargo, en el caso de la especial de dos fotones mayor sondas, la excitación se puede hacer a través del mecanismo de dos fotones, lo que permite el uso de las sondas en las aplicaciones de la microscopía de alta resolución. De un fotón de excitación general, ofrece una resolución espacial de menos, pero requiere más simple de instrumentación y se puede utilizar en un solo punto de medición con LED de fibra óptica basada phosphorometers. 1.3) La fosforescencia emitida por la sonda se origina en el estado triplete de larga vida. La molécula de la sonda debe estar especialmente diseñados para dar un alto rendimiento cuántico del estado triplete y emiten fosforescencia en lugar de la fluorescencia. Mientras que en el estado triplete, la sonda puede experimentar encuentros colisión con las moléculas de oxígeno, que puede desactivar el estado de triplete - &quot;. Temple&quot; de un proceso llamado En ausencia de oxígeno, la vida útil del estado triplete, y por lo tanto de la decadencia de la fosforescencia, es τ 0. En presencia de oxígeno, la vida fosforescencia (τ) se reduce como consecuencia de la extinción. Existe una relación directa entre el tiempo de vida del estado triplete y la cantidad de oxígeno en el ambiente. Esta es la bien conocida relación de Stern-Volmer, que conecta la vida (τ) de la fosforescencia de la concentración de oxígeno [O 2] (o la presión parcial de oxígeno PO 2): <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="ecuación" /> En los sistemas biológicos, el oxígeno es de lejos el extintor más efectivo de la fosforescencia, que hace que el método de enfriamiento fosforescencia muy selectiva al oxígeno. 1.4) Con el fin de medir el tiempo de vida t, los fotones emitidos fosforescente se han agrupado en el tiempo. Por ejemplo, después del impulso de excitación, 200 fotones pueden ser recogidos en los primeros 15 microsegundos, 150 fotones recogidos en los próximos 15 microsegundos, y así sucesivamente, hasta que no se recogen los fotones. Los números de los contenedores en función del tiempo dará la decadencia fosforescencia, que se analiza para obtener el tiempo de vida τ. En las imágenes, este procedimiento se aplica en cada pixel de la imagen, dando lugar a mapas de toda la vida fosforescencia. Las mediciones de tiempos de vida no son sensibles a la heterogeneidad de la distribución de la sonda a través del objeto, que es común para las muestras biológicas. Por lo tanto, las vidas único informe sobre el oxígeno. Τ vidas se convierten en las concentraciones de oxígeno mediante la relación de Stern-Volmer. 2. La construcción de sondas fosforescente Sondas fosforescente para mediciones de oxígeno en los sistemas biológicos consisten en cromóforos fosforescente (núcleos), encapsulado en jaulas construidas de dendrímeros - polímeros hiper muy regular [3]. Dendrímeros proteger a los núcleos de las interacciones con el medio ambiente y el control de la velocidad de difusión de oxígeno a los núcleos, lo que permite optimizar la sensibilidad y el rango dinámico de las sondas (q constante k en la relación de Stern-Volmer). Las terminales de los dendrímeros son modificados con polietilenglicol químicamente inerte hidrofílico (PEG) los grupos, por lo que las sondas altamente soluble en agua y la prevención de su interacción con macromoléculas biológicas. Núcleos fosforescentes de las sondas se Pt o Pd complejos de porfirinas y las porfirinas π extendida. π-extendido porfirinas son las porfirinas en el que los anillos de pirrol se funden con fragmentos aromáticos externo. π-extensión permite el ajuste de las propiedades espectroscópicas de las sondas para satisfacer las necesidades de una aplicación de imagen en particular (por ejemplo, frente a la microscopía tomografía). A modo de ejemplo, se describe la síntesis de tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (PDAR 4 TBP) [4]. PDAR 4 TBP tienen bandas de absorción de gran alcance en el extremo rojo del espectro de la fosforescencia y fuerte, muy adecuado para la medición bioquímica de oxígeno. La síntesis de los cuatro PDAR PDD consta de los siguientes pasos: 2.1) Preparación de tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) por Lindsey condensación [5] de tetrahydroisoindole con benzaldehídos sustituido. Para una solución 0,01 M de tetrahydroisoindole (1 eq) en CH &lt;sub&gt; 2 CL 2, el aldehído aromático (1 eq) se añadió en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente BF 3 O xEt 2 (0,2 eq) se añadió, y la mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 h. DDQ (1 eq) se añadió, y la mezcla se deja toda la noche con agitación continua. La solución se lavó con un 10% aq Na 2 SO 3, el 10% aq Na 2 CO 3, 5% HCl aq y finalmente con salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na 2 SO 4, luego se concentró en el vacío. El residuo se recristaliza en CH 2 Cl 2 - terc-butil éter para dar mezcla de Ar 4 TCHP como polvo de color verde. Los rendimientos son alrededor del 50%. 2.2) La inserción de Pd para obtener PDAR 4 TCHPs. Porfirinas base libre (1 eq) fueron tratados con PdCl2 o Pd (OAc) 2 (1,2 eq) en reflujo CH 3 CN en presencia de exceso de Et3N (20 eq). La conversión fue supervisado por espectroscopia UV-vis (disolvente CH 2 Cl 2-AcOH) y se considera completo después de la banda de Soret de 468-472 nm en el dictado desaparecido. La mezcla se deja enfriar, se diluye con CH 2 Cl 2 y se filtra a través de una delgada capa de Celite para eliminar Pd (0). El disolvente se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando CH 2 Cl 2 como solvente. Fracción de color rojo oscuro se recogió, se evaporó el disolvente para dar destino PDAR 4 TCHPs en rendimiento casi cuantitativo. 2.3) PDAR 4 TBP fueron preparados por la oxidación de PDAR 4 TCHPs con el exceso de 2 veces de DDQ (16 eq) en THF a reflujo. Durante el reflujo, el color cambia de rojo oscuro a verde oscuro. El disolvente se evaporó, el ​​residuo se diluyó con CH 2 Cl 2, se lava con aq 10% Na 2 SO 3, agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na 2 SO 4 y se concentró en el vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (eluyente CH 2 Cl 2). La primera fracción de color verde oscuro se recogió, se concentró en vacío para dar un 85-90% de polvo de color azul-verde de PdAr4TBP. 2.4) grupos éster periférica de Pd tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) se hidroliza con 10 veces el exceso de KOH en 1% (v / v) de agua / THF a temperatura ambiente. El disolvente se decantó del precipitado de las sales de potasio forma de derivados de ácidos carboxílicos de la PdAr4TBP. Los sólidos se disuelven en agua, se agita durante 2 horas adicionales, se acidifica con conc. HCl a pH ~ 5.4. El precipitado obtenido se aisló por centrifugación, se lava con agua y se seca al vacío. La protección de dendrones. Cada rama individual del dendrímero se llama dendrón. Dendrones la protección se construye a partir de aril-glicina bloques de construcción (AG). Dendrones AG puede ser fácilmente sintetizado a partir de materias primas baratas y aislado de alta pureza y el rendimiento por cromatografía de métodos libres. Síntesis de la generación 2 (G2) AG-dendrón se compone de los siguientes pasos: 2.4) Síntesis de los bloques de construcción, protegido con Boc 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide y glycineamide 3,5-dibutoxycarbonylphenyl, utilizando el método de Fischer haloacyl haluro. 2.5) El acoplamiento de los bloques de construcción con CDMT / NMM química de péptidos de acoplamiento. 2.6) desprotección del grupo amino focal agitando la solución de la dendrón G2 en TFA durante 2 horas a temperatura ambiente 2.7) Para el montaje de la dendrones mayor generación, acoplamiento / desprotección pasos se repiten. Dendrímero montaje se logra mediante el acoplamiento de la dendrones desprotege para PdAr4TBP (o porfirina otros) utilizando la química de acoplamiento HBTU / DIPEA. 2.8) En primer lugar, los grupos de protección Boc-se eliminan de la dendrón. Por ejemplo, protegido con Boc dendrón G3 (0,58 g) se disolvió en TFA (15 ml), y la mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. El ácido se elimina por evaporación rotatoria, rindiendo el dendrón como TFA-sal. El residuo seco se disolvió en NMP (10 ml) y unas gotas de DIPEA se han añadido, para calmar las huellas de TFA. 2.9) Antes de iniciar la reacción de acoplamiento, es fundamental que se disuelva completamente la porfirina. Por ejemplo, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) se disolvió en seco NMP (65 ml) mediante calentamiento a 140 º C durante 10 minutos, bajo corriente de nitrógeno. 2.10) La solución se enfrió a temperatura ambiente, HBTU (0,211 g) se añadió, y la mezcla se agitó durante 5 min. 2.11) DIPEA (0,35 ml) se añadió a la mezcla de una parte, inmediatamente seguido por la adición de la solutiel de TFA-sal de la dendrón en NMP (véase el punto 2.8), y la mezcla se deja toda la noche con agitación. 2.12) La mezcla se vierte en un 3% aq. NaCl (350 ml), y el precipitado resultante se recogió por centrifugación y se lava con agua, metanol, y Et O 2 por la suspensión repetitivas / centrifugación para obtener el objetivo de porfirina-dendrímero. 2.13) para hidrolizar los grupos éster periférica, el dendrímero se trató primero con NME 4 OH (~ 5 mm) en DMSO / MeOH durante 20-60 min período, seguido por la eliminación del disolvente completa. Este procedimiento nos permitió generar dendrímeros con un número suficiente de grupos carboxilato para dar solubilidad acuosa. Para completar la hidrólisis, el dendrímero fue tratado con NaOH acuoso 0,1 N (noche). Como resultado, pura porfirina-dendrímero ácidos carboxílicos pueden ser aislados en los rendimientos de 80-95%. Modificación de la periferia del dendrímero. En este punto, a partir de la misma porfirina-dendrímero, ya sea de uno o sondas de dos fotones pueden ser sintetizadas. En el primer caso, todos los grupos carboxilo periféricos se modifican con las unidades de PEG - una metodología conocida como PEGilación. En este último caso, varios grupos carboxilo son los primeros, junto con cromóforos antena de dos fotones (cumarina-343) modificado con etilendiamina (EDA) enlazadores, seguido por PEGilación de los carboxilos restantes [6]. Los dendrímeros fueron pegilado con monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av.. MW 1000) con HBTU / DIPEA química de acoplamiento. 2.14) a una solución de la dendrón en NMP (o DMF) (1-10 mM) el exceso de 1.25 veces de HBTU se añadió, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Exceso de 6.25 veces de DIPEA se añadió, seguido por la adición inmediata de un exceso de 1,25 veces el de m-PEG-NH2. La mezcla de reacción se agitó durante 2 días a temperatura ambiente. Éter dietílico se añadió a la mezcla de reacción, el precipitado formado se separa por centrifugación y re-precipitado de THF por la adición de éter dietílico. 2.15) Final de la purificación se logró con la cromatografía de exclusión por tamaño de la recogida de la fase del frente primero. Pegilado porfirina-dendrímero se disolvió en una pequeña cantidad de THF (~ 15 ml) y se carga en la parte superior de una columna cromatográfica rellena con poliestireno SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). La columna se eluyó con pura THF, y la banda de color oscuro en movimiento con la parte delantera fue recogida. 2.16) THF se retiró en un evaporador rotatorio, y el material restante se secó en el vacío. 3. Caracterización de la sonda Caracterización fotofísicas incluye mediciones de los espectros de la sonda de absorción y emisión, la fosforescencia vida τ 0 y Stern-Volmer oxígeno enfriamiento constantes k q en condiciones fisiológicas. 3.1) Los espectros de absorción y emisión se obtienen en condiciones ambientales utilizando instrumentación estándar (espectrofotómetro y fluorímetro constante). ~ 1 M de las soluciones de la sonda se utilice. 3.2) A continuación, el gráfico de calibración de Stern-Volmer se obtiene. Esta es la medida más importante, porque nos permite relacionar la vida útil de la sonda a la concentración de oxígeno. 3.3) Una solución de la sonda en tampón PBS (pH 7,2) se coloca en una cubeta especial cilíndrica, que se coloca dentro de la cámara de temperatura controlada, situada dentro de una jaula de luz impermeable con puertos de fibra óptica de excitación y emisión. Las fibras se ponen en contacto con la cubeta interior de la cámara en la geometría en ángulo recto. 3.4) La cubeta se cierra con un tapón, en la que una alta sensibilidad de tipo Clark electrodo de oxígeno (CK-electrodo de oxígeno) se inserta. El tapón también contiene dos puertos de la aguja de entrada y salida de argón. El electrodo se sumerge en la solución, mientras que las agujas se limitan a proporcionar para la circulación de flujo de gas por encima de la superficie de la solución. Al principio, el argón no está conectado a la entrada. 3.5) La temperatura se ajusta al valor deseado (normalmente 36-37 ° C) y la solución se deja en agitación para el equilibrio. 3.6) La fibra de excitación se conecta al puerto de excitación de un phosphorometer digital, operado por una PC. La fuente de luz en el phosphorometer es un LED de alta potencia, cuya producción es controlada por una kHz D 333 / A bordo. La fibra de emisión está conectado a otro puerto óptico de la phosphorometer, que está acoplado a un APD altamente sensible al infrarrojo (fotodiodo de avalancha). La salida del diodo se amplifica y se introduce en el A / D del canal de la tarjeta de control mismo, lo que permite la sincronización entre la excitación y los canales de emisión. 3.7) El software de control almínimos de generación de pulsos de excitación de la longitud deseada (por ejemplo 5 o 10 ms), seguido por la recolección de la decadencia fosforescencia durante cualquier período arbitrario elegido (generalmente 2-3 ms). Tiempo para una medición de toda la vida solo es típicamente 0,5-1 s, sin embargo, las mediciones se pueden obtener con la mayor rapidez 20.10 por segundo. 3.8) La salida del electrodo de oxígeno se amplifica y se dirigió a otro un consejo / D en el mismo PC. Este es un tablero de baja frecuencia (1 kHz máx), que se utiliza para registrar el electrodo de corriente en determinados periodos de tiempo. El programa para la grabación de los datos de electrodos se ejecuta simultáneamente con el software phosphorometer. 3.9) Una vez que la temperatura de la solución es equilibrado, tanto en el phosphorometer y los programas de electrodos se inician al mismo tiempo para realizar las mediciones cada 10 s. Sus resultados son registrados de forma sincrónica en dos archivos separados. Después de eso, el argón se conecta al puerto de entrada en el tapón de la cubeta. 3.10) como el argón fluye sobre la superficie de la solución agitada, poco a poco reemplaza al oxígeno. Esto se traduce en una disminución de la corriente del electrodo y un incremento en la duración de la fosforescencia, que se mide por el phosphorometer. Por lo general, el oxígeno se desplaza forma la solución del todo después de 2 h, tiempo durante el cual los datos están totalmente automáticamente registrado en los archivos. 3.11) Después de la final de la carrera de titulación, los datos del electrodo y la vida fosforescencia se importan a un programa de análisis estándar (Origen Miocrocal por ejemplo). La corriente del electrodo depende linealmente de la concentración de oxígeno, y para el electrodo utilizado es prácticamente cero en el cero de oxígeno. A presión atmosférica, pO 2 es conocida (alrededor de 150 mm Hg). Por lo tanto, los datos de electrodo puede ser convertido directamente en la escala de oxígeno, y la trama de la vida de fosforescencia inversa vs PO 2 puede construir. Esta parcela está equipado con una línea recta por el método de mínimos cuadrados para dar el kq bloqueo del oxígeno constante como su pendiente. Vida fosforescencia t0 se obtiene a partir del mismo corte (como la inversa de la intersección) o directamente desde la medición a cero oxígeno. 3.12) Si es necesario, la valoración se repite con una solución de la sonda en la presencia de albúmina - una proteína presente en el plasma de la sangre en altas concentraciones, - con el fin de emular las condiciones que se encuentran en el sistema experimental real (la sangre de un animal en vivo). La obtención de Stern-Volmer parcelas deberán ser idénticas si el dendrímero es la protección de la sonda y así aislar a los grupos de la sonda PEG de los contactos con la albúmina. De lo contrario, la sonda y las proteínas en la sangre va a interactuar, y que dará lugar a una alteración de Stern-Volmer trama, haciendo que la ambigüedad en la medición de oxígeno. Así obtenido constantes de calibración se utilizan en experimentos de imagen donde las concentraciones de oxígeno son un desconocido a priori.

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	<li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence.">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li><li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems.">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li><li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins.">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li><li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited:+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions.">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li><li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen.">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li></ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Abreviatura</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Nombre y apellidos</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-methylpyrrolidinone</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Ácido trifluoroacético</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropiletilamina</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfato</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimetilsulfóxido</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-cloro-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

synthesis and calibration of phosphorescent nanoprobes for oxygen imaging in biological systems

La medición de oxígeno por temple fosforescencia [1, 2] se compone de los siguientes pasos: 1) la sonda se introduce en el medio de interés (por ejemplo la sangre o el líquido intersticial), 2) el objeto está iluminado con luz de longitud de onda adecuada para excitar la sonda en su estado triplete, 3) la fosforescencia emitida se recoge, y su evolución en el tiempo se analiza para obtener el tiempo de vida fosforescencia, que se convierte en la concentración de oxígeno (o presión parcial, pO<sub&gt; 2</sub&gt;). La sonda no debe interactuar con el entorno biológico y, en algunos casos a ser 4) excretado por el medio a la finalización de las mediciones. Cada uno de estos pasos impone requisitos en el diseño molecular de las sondas fosforescente, que constituyen el único componente invasivo del protocolo de medición. Aquí hacemos una revisión del diseño de nanosensores dendríticas fosforescente para mediciones de oxígeno en los sistemas biológicos. Las sondas consisten en Pt y Pd porfirina basada en polyarylglycine (AG) dendrímeros, modificar periféricamente con polietilenglicol (PEG) de residuos. Para la eficacia de dos fotones de excitación, terminales de los dendrímeros se puede modificar con dos fotones cromóforos antenas, que captan la energía de excitación y canalizarla a los núcleos de triplete de las sondas a través de intramolecular FRET (transferencia de energía por resonancia de Förster). Se describen las propiedades clave fotofísicas de las sondas y presentar los protocolos de calibración detallada.

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Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Se presentan los principios de la medición de oxígeno por temple fosforescencia y revisión del diseño de la porfirina basada en nanosensores dendríticas para obtener imágenes de oxígeno en los sistemas biológicos.

Síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en sistemas biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

synthesis-calibration-phosphorescent-nanoprobes-for-oxygen-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K vistas.  University of Pennsylvania. Se presentan los principios de la medición de oxígeno por temple fosforescencia y revisión del diseño de la porfirina basada en nanosensores dendríticas para obtener imágenes de oxígeno en los sistemas biológicos.

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

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Utilizando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desarrollar herramientas de diagnóstico

Investigación

Biología

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

La normalización nació para tomografía de fluorescencia de proyección óptica de imágenes de todo corazón

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Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

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Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

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Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

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The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Resonancia de spin electrónico micro imágenes en vivo de las especies para la asignación de oxígeno

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de<em&gt; Plasmodium</em&gt; rhoptry Proteínas

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.