Las líneas de células HCC4017 y HBEC30KT fueron amablemente proporcionados por el laboratorio del Dr. John Minna. Este trabajo fue apoyado por los fondos de Cecil H. e Ida verdes al Dr. Li Zhang.

PRECAUCIÓN: Mientras trabajaba con radiactividad, tomar las precauciones adecuadas para evitar la contaminación del experimentador y el entorno. Deshágase de todos los desechos siguiendo las directrices locales de seguridad radiológica. 1. Preparación de las células <ol><li> Células de semillas en 3,5 cm placas de tal manera que la confluencia alcanza el 80% -90% en el día de ensayo. <ol><li> Tenga en cuenta que la siembra de confluencia para las células depende del tipo celular y su tasa de crecimiento. Cuando el tratamiento de las células con un reactivo para un cierto número de días, semilla de células de modo que la confluencia es 80% -90% en el día de la medición de hemo. Si el número de células obtenido a partir de 3,5 cm placas es insuficiente, utilizar placas de 6 cm con la misma cantidad de ALA radiactivo como en el siguiente paso. Nota: El uso de placas individuales se recomienda porque es más fácil de manejar platos individuales. </li></ol></li><li> Un día antes de la medición hemo, añadir 0,1-0,3 Ci [14 C] 5-ALA y ALA frío para llegar a un final Concentración de 20 M del total ALA a cada placa de cultivo en un ataque área de trabajo para trabajar con materiales radiactivos y poner las placas de nuevo en la incubadora. Idealmente, se incuba con ALA radiactivo durante 16 horas. Nota: radiomarcado 5-ALA requiere puede variar entre líneas celulares. Se requiere un recuento radiactivo por minuto (cpm) de al menos 100 para reducir al mínimo el error asociado con el conteo. Es aconsejable para determinar una cantidad mínima de [14 C] 5-ALA requerida para las líneas celulares estudiadas. Para la mayoría de experimentos 0,1-0,3 Ci es suficiente para obtener una buena medición. La adición de frío ALA es opcional. </li></ol> 2. El hemo Extracción <ol><li> Coloque las placas de cultivo de células en hielo y llevarlos a la zona en condiciones de trabajar radiactividad. <ol><li> Realizar todo el proceso de extracción y evaporación en una campana a prueba de explosiones. Debido a que el éter almacenado puede explotar, utilizar el éter en pequeñas botellas y evaporar los líquidos restantes, no almacene en el éteruna botella abierta durante más de un mes. No utilice acetona cerca de llamas abiertas y calentadores, ya que es altamente inflamable. Acetona tienda que contiene reactivos en botellas de vidrio, ya que disuelve plástico de cultivo de tejidos. </li></ol></li><li> Aspirar el medio utilizando una pipeta. Lavar las células una vez con 1 ml de PBS 1x frío. Aspirar PBS. </li><li> Añadir 1 ml de PBS 1x frío a las placas y recoger las células en la parte inferior de la placa utilizando una goma de policía. Transferir las células recogidas de cada plato a un tubo ml preenfriado 2 etiquetados. Recoge todas las células en tubos de 2 ml. Nota: Utilice un policía de caucho fresco para cada placa para raspar las células de cada placa. Para cada placa que requeriría cuatro 2 ml tubos, un tubo de 1,5 ml y un vial de centelleo. </li><li> Centrifugado a 15.000 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Saque PBS utilizando una pipeta, dar un breve centrifugado y retire el PBS residual. Resuspender las células en 100 l de PBS 1x. Vortex para volver a suspender las células y mantener en hielo. </li><li> Tome 10 y# 956; l desde el paso 5 y la transferencia a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar en hielo para medir la concentración de proteínas. Nota: tampón de lisis celular, debe añadirse a las células y se mantuvo en hielo para medir la concentración de proteínas más tarde. </li><li> Haga girar los 90 l restantes de la etapa 5 a 5.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C; eliminar completamente PBS utilizando una punta de pipeta 200 l. </li><li> Añadir 300 l de tampón de extracción hemo (ver Lista de Materiales) a cada tubo. Entonces vórtice durante 15 segundos para mezclar y poner en hielo durante 1 min, repetir esto 3 veces. <ol><li> Añadir tampón de extracción hemo (HEB) y agitar el tubo rápidamente para volver a suspender el sedimento, hacer sólo una o dos tubos a la vez porque la pastilla debe resuspendió rápidamente sin quedarse en el HEB durante demasiado tiempo. Una vez HEB se añade a todos los tubos y sedimento se resuspende a continuación, siga el vórtice 15 seg y 1 min en el ciclo de hielo como en el paso 8. Nota pellet que puede no ir completamente en el HEB si la pastilla se deja en el tampón de HEB para una mástiempo y no se resuspendieron rápidamente. </li></ol></li><li> Añadir 1,2 ml de éter dietílico a cada tubo y agitar durante 30 seg. Centrifugado a 15.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Nota: El éter dietílico se queda sin puntas de pipeta rápidamente. Para controlar esto, dietil éter pipeta arriba y abajo una vez o dos veces, haciendo así que ayuda a mantener el éter de dietilo en la pipeta. Repita esto cada vez que se utiliza una punta de pipeta nueva. </li><li> Transferencia de fase superior (éter) con 1 ml de la pipeta a un nuevo tubo de microcentrífuga. Añadir 0,5 ml de HCl 2 N, vórtice de mezclar y giro como en el paso 9. Nota: Es difícil ver la separación entre fases de éter y HCl. Por lo tanto, añadir pequeñas cantidades de azul tripán en solución de HCl 2 N para ser utilizado durante el experimento, lo suficiente como para darle un color azul pálido. Esto le ayudará a distinguir las dos fases. La fase inferior será azul y la fase etérea superior será incoloro. Transferir la fase etérea incoloro superior a un tubo nuevo y desechar la fase inferior HCl (azul). </li><li> Repita el paso 10 de dosmás veces para lavar la fase etérea con HCl 2 N. Transferir sólo la fase de éter arriba a un nuevo tubo durante cada repetición y desechar la fase inferior HCl. </li><li> Después del tercer lavado con HCl, transferir la fase superior con 1 ml de la pipeta a un vial de centelleo. Secar las muestras por evaporación del éter dietílico, manteniendo las muestras en la campana química O / N. </li></ol> 3. Medición de la radiactividad <ol><li> Al día siguiente, añadir 5 ml de líquido de centelleo de las muestras secas desde el paso 2.12. </li><li> Agitar bien para mezclar. Medir la radiactividad usando un contador de centelleo. </li></ol> 4. Cálculos <ol><li> Lisar las células del paso 2.6 utilizando la misma cantidad de tampón CelLytic M (ver Lista de Materiales) y centrifugado a 14.000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Tomar una alícuota del sobrenadante y medir la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteína BCA. La cantidad total de proteína en mg (TP) = (90 * l conc. De proteína en81; g / l) / 1000 Nivel de síntesis del grupo hemo (radiactividad / TP) = pmol / mg de proteína. </li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Heme juega un papel clave en la generación de energía celular a través de la respiración 26. El metabolismo del hemo Altered se sabe que está asociado con varias enfermedades, incluyendo el cáncer 28,41. La inhibición de la síntesis del grupo hemo se sabe que causa la detención del ciclo celular y la apoptosis en células HeLa 26,41. Se ha demostrado que el nivel de la síntesis de hemo alta se asocia con la progresión de las células de cáncer de pulmón 28. Por lo tanto, sería de gran importancia para medir los niveles de biosíntesis de hemo en células bajo diferentes condiciones. El método descrito aquí no cuantificar la cantidad total de hemo, por lo tanto, no proporciona el valor absoluto de hemo presente en las células. Hay una variedad de métodos colorimétricos y kits disponibles para medir las cantidades totales de hemo en las células. Por ejemplo, heme puede ser extraído de las células y las mitocondrias en una mezcla de acetona y HCl y se mezcla con 50% (v / v) de acetonitrilo. Después, la mezcla se puede aplicara una columna C18 Bondclone 3,9 x 300 mm, seguido de elución de hemo en un gradiente de acetonitrilo que contiene 0,05% (v / v) de ácido trifluoroacético y la identificación de compuestos hemo a 400 nm 44,45. Anteriormente, para medir los niveles de la biosíntesis de hemo en los tejidos de mamíferos y extractos de células [14 C] glicina y [14 C] 5- ALA se utilizaron 46,47. Aunque glicina etiquetado entra en la ruta de biosíntesis de hemo en el primer paso, pero se drena por otras vías metabólicas que resultan en su limitada incorporación en hemo. La glicina no es un metabolito específico para ruta de biosíntesis de hemo 48. Por otro lado, la etiqueta 5-ALA es específico de ruta de biosíntesis de hemo. Esta característica confiere una ventaja cuantitativa de la utilización de 5-ALA sobre glicina 46,48,49. Por lo tanto, el uso de radiactivo 5-ALA es un método más específico y preciso para medir y comparar los niveles de la biosíntesis del grupo hemo. Las mayoría de las critical pasos para obtener resultados consistentes son: 1) asegúrese de que la confluencia de células no subir más de un 100% y no por debajo de 70% a través de diversas condiciones; 2) la cantidad de radiactividad añadida por placa debe ser idéntica ya que este método es muy sensible; 3) tampón de extracción hemo no debe ser viejo, se recomienda hacer fresco cada vez. El volumen de radiactividad requerida por placa es muy pequeño y es difícil mantener las cantidades idénticas a través de las muestras. Por lo tanto, se recomienda para hacer una solución madre de trabajo en el medio de cultivo, si se utiliza el mismo medio para todas las muestras, los demás PBS (tampón fosfato salino) se puede utilizar. Trabajando solución madre se puede preparar de una manera tal que el volumen dispensado por placa está bajo 10 l. Además, para ser más exactos, el medio de las muestras idénticas para una condición se puede sacar en un tubo de 50 ml y las cantidades apropiadas de radiactividad puede ser añadido de la solución madre de trabajo, entonces prescindir de vuelta de correoQual cantidades de medio a las placas. Si el número de células están limitados, tales como en cultivos primarios, de 12 pocillos o placas de 24 pocillos se pueden utilizar para cultivar las células y reducen la cantidad de radiactividad añadida por pocillo proporcionalmente. Este protocolo es sencillo, simple, y proporciona medidas precisas de los niveles de síntesis de hemo. A veces, puede ser difícil para volver a suspender el sedimento celular en el tampón de extracción hemo (paso 2.8) completamente. Para evitar que esto sea rápido en el paso 2.8, añadir tampón de extracción hemo de 1-2 muestras a la vez, vórtice y ponerlos en hielo. Asegúrese de que el tampón de extracción hemo no es demasiado viejo. Si la desviación estándar entre las muestras replicadas es demasiado alto, prestar atención a los siguientes pasos: 1) PBS se eliminó por completo en el paso 2.7; 2) evitar derramar la muestra cuando se encuentra en fase de éter dietílico, siga la punta en el paso 2.9; 3) asegurarse de que la radiactividad añadido por placa y la confluencia de las muestras repetidas eran los mismos. 28 en condiciones normales no maligno (HBEC) vs. cáncer de células (HCC), desarrollados a partir de la misma paciente. La técnica descrita aquí requiere el uso de [14 C] 5-ALA, un precursor en la biosíntesis de hemo vía (Figura 1), y mide la radiactividad incorporada en hemo. En esta técnica, las porfirinas, incluyendo hemo, se extrajeron de las células en una mezcla de acetona, HCl concentrado y 50,51 de agua. El hemo se separó más lejos de porfirinas mediante la extracción en éter dietílico y el lavado de la fase de éter con HCl 2 N 50,51. Entonces, la radiactividad incorporada en heme se determinó usando un contador de centelleo. Los resultados pueden ser normalizados por la cantidad total de proteína o el número de células. Síntesis del grupo hemo en células HeLa fue inhibida mediante el uso de acetona succinil (SA) y una disminución en el nivel de la síntesis de hemo se observó como se muestra preriormente 26 (Figura 3). Este método es muy útil para la comparación de los niveles de síntesis de hemo en diferentes condiciones o entre las líneas celulares (Figura 4). Se requiere un pequeño número de células y proporciona una medición y comparación de los niveles de síntesis de hemo en diferentes células específico. No se pretende para la medición precisa de los niveles absolutos hemo en las células. Es mejor se utiliza para comparar los niveles de síntesis de hemo en células con diferentes propiedades, tales como diferentes células cancerosas. Debido a que el cobalto, en lugar de hierro, se puede incorporar en hemo en el último paso de la síntesis de hemo y se extrajo 51, este método no puede rendir comparación precisa de la síntesis de hemo, si los medios de crecimiento contienen diferentes niveles de cobalto o de otros iones metálicos. No obstante, la vía de síntesis de hemo a partir de ácido 5-aminolevulínico a porfirinas y heme es muy específica, la medición de los niveles de flujo de todo el pathway es probable que sea más reflexivo de las actividades metabólicas pertinentes a hemo, independientemente de los iones metálicos. En contraste, el método que utiliza 59 Fe detecta sólo la parte de la vía de la incorporación de Fe para formar hemo 52. Aunque esto es más específico, en presencia de niveles significativos de iones metálicos, los niveles de síntesis de hemo detectado puede no reflejar el potencial metabólico de ciertas células como las células cancerosas. Por otra parte, Fe puede ser secuestrado en otras localizaciones celulares junto mitocondrias para hacer heme. En general, creemos que el uso de [4- 14 C] 5-ALA es un método más práctico para la medición de los niveles de hemo cuando se comparan diferentes células con diferentes propiedades.

Hemo, un complejo de hierro ferroso y protoporfirina IX es una molécula central para el transporte y la utilización de oxígeno en los organismos que viven prácticamente todos 1-3. La estructura única de hemo le permite funcionar como un portador de gases diatómicos y electrones, así como para realizar diversas otras funciones 1-5. Por ejemplo, hemo se une al oxígeno en la hemoglobina y la mioglobina para la transferencia y el almacenamiento de 6,7 oxígeno. También funciona como un transportador de electrones en los citocromos durante la respiración y actúa como un donador de electrones para las reacciones redox catalizadas por enzimas del citocromo P450 8,9. Una de las características más significativas de hemo es que, puede desempeñar un papel regulador en los procesos celulares y moleculares, tales como la transcripción de genes, síntesis de proteínas y micro-ARN biogénesis 4. Por ejemplo, afecta a la transcripción de muchos genes mediante el control de la actividad de represor transcripcional de mamífero Bach1 y la rec nuclear de mamíferoeptor Rev-erbα 10-15. Heme regula la activación de la proteína activadora de hemo (Hap) 1 que desempeña un papel importante en la activación de genes implicados en la respiración y controlar el daño oxidativo, en respuesta a heme o de oxígeno 16. Heme también regula la transcripción de genes en las células neuronales a través de factor de crecimiento nervioso (NGF) de señalización 3,17-20. También regula la síntesis de proteínas en las células eritroides de mamífero mediante la modulación de la actividad de quinasa eIF2α hemo-regulados (HRI) 21-24. Además, hemo afecta a la actividad de las proteínas de señalización clave como la tirosina quinasa Src y Jak2, que son esenciales para el funcionamiento adecuado de las células y 4,20,25 crecimiento celular. Se encontró que en células HeLa inhibición heme provoca la detención del ciclo celular y la activación de marcadores asociados con la senescencia y apoptosis 26. Tanto la deficiencia de hemo o aumento de los niveles de hemo se asocian con efectos graves para la salud en los seres humanos 27. Recientes un molecularnd estudios epidemiológicos han mostrado una asociación positiva de alto consumo hemo y aumento del riesgo de enfermedades, tales como diabetes tipo 2, enfermedad coronaria y varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón, cáncer colorrectal y cáncer de páncreas 27,28. El uso de un par emparejado de laboratorio de células pulmonares normales y cancerosas autores han encontrado que las células cancerosas se han incrementado los niveles de consumo de oxígeno, la síntesis del grupo hemo y proteínas implicadas en la captación de hemo y oxígeno utilización 28. Curiosamente, la inhibición de la síntesis de hemo disminuyó el consumo de oxígeno, la proliferación, la migración y la formación de colonias de células de cáncer 28. Por lo tanto, la fluctuación en los niveles de hemo endógeno juega un papel importante en la regulación de procesos moleculares y celulares 3,4,28,29. En los mamíferos, la biosíntesis de hemo se produce en ocho etapas, que implican enzimas localizadas en la mitocondria y el citosol 4 (Figura 1). Bios hemotesis comienza en la matriz de la mitocondria con la condensación de glicina y succinil-CoA reductasa para formar ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), catalizada por ALA sintasa (ALAS) 4,31. Este es el paso limitante en la biosíntesis de hemo en células no eritroides. 5-ALA entonces se exporta hacia el citosol, donde se producen los siguientes cuatro pasos para formar coproporfirinógeno III (CPgenIII), que luego se importa de nuevo a las mitocondrias, donde se convierte en la protoporfirina IX (PPIX). Finalmente, una molécula de hierro se incorpora a la protoporfirina IX (PPIX) para producir hemo, una reacción catalizada por ferroquelatasa (FECH) 2,4. El nivel de la biosíntesis de hemo depende principalmente del nivel de enzima ALAS que está estrechamente controlada por el hierro hemo intracelular y 4. La biosíntesis de hemo puede verse afectada por defectos genéticos, la disponibilidad de ciertos minerales y vitaminas (por ejemplo, riboflavina, zinc), la exposición a toxinas (por ejemplo, aluminio, plomo), Anoxia, fiebre, y los niveles de ciertos esteroides (por ejemplo, estrógeno) 32-35. El nivel de la síntesis de hemo se altera en diversas condiciones de enfermedad. Disminución de la biosíntesis del grupo hemo puede causar anemia, así como enfermedades neurológicas 3,36. Alternativamente, el aumento de la biosíntesis de hemo juega un papel importante en la progresión de ciertos cánceres 28,37. Heme ha demostrado ser crítico para el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia de los mamíferos adiposo, eritroides y células neuronales 4,38-41. Por ejemplo, la deficiencia de hemo conduce a un daño de neuritas en neuronas corticales de ratón primaria a través de la inhibición de glutamato NMDA (N-metil-D-aspartato) receptor 17. Además, la inhibición de la síntesis de hemo causa la muerte celular programada en el carcinoma de cuello uterino humano epitelial células HeLa 26,41. Por lo tanto, la medición de los niveles de biosíntesis de hemo en diversas células bajo diferentes condiciones es importante para el estudio de la etiología y progressien de muchas enfermedades. Aquí se describe un método rápido y sensible para medir el nivel de la síntesis de hemo intracelular mediante el uso de [4- 14 C] de ácido 5-aminolevulic. Este es un método alternativo a otros métodos que utilizan 55 o 59 Fe Fe. Preferimos utilizando 14 C porque su radiación es muy débil. Por el contrario, se requiere una fuerte protección para trabajar con isótopos Fe. Además, este método está destinado a medir y comparar la síntesis de hemo en diferentes células en paralelo de una manera rápida. Con el fin de medir los niveles de hemo absolutos, se puede utilizar el método previamente establecido que implica el uso de HPLC 42,43.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme sirve como el grupo prostético para una amplia variedad de proteínas conocidas como hemoproteínas, tales como hemoglobina, mioglobina y citocromos. Está implicada en diversos procesos moleculares y celulares, tales como la transcripción de genes, la traducción, la diferenciación celular y la proliferación celular. Los niveles de biosíntesis de hemo varía en los diferentes tejidos y tipos de células y se alteran en condiciones de enfermedad como la anemia, neuropatía y el cáncer. Esta técnica utiliza [4- 14 C] de ácido 5-aminolevulínico ([14 C] 5-ALA), uno de los primeros precursores en la ruta de biosíntesis de hemo para medir los niveles de síntesis de hemo en células de mamífero. Este ensayo implica la incubación de las células con [14 C] 5-ALA seguido de la extracción de hemo y la medición de la radiactividad incorporada en hemo. Este procedimiento es precisa y rápida. Este método mide los niveles relativos de la biosíntesis del grupo hemo, más que el contenido total de hemo. Para demostrar el uso de esta technIQUE los niveles de biosíntesis de hemo se midieron en varias líneas celulares de mamíferos.

Este método se utilizó para comparar los niveles de síntesis de hemo en normal (HBEC30KT) vs. cáncer (HCC4017 células pulmonares). La Figura 2 muestra un nivel más alto de la síntesis de hemo en células de cáncer (HCC4017) que las células pulmonares normales (HBEC30KT). El nivel de la síntesis de hemo también se midió en células normales y cancerosas en la presencia de cianuro de carbonilo desacoplador mitocondrial 3-clorofenilhidrazona (CCCP). Las células fueron tratadas con CCCP 10 mM durante 24 horas antes de la medición de los niveles de síntesis del grupo hemo. Como era de esperar, los niveles de síntesis de hemo (Figura 2) se redujo en presencia de CCCP tanto en las células normales y cancerosas. Se ha demostrado previamente que la síntesis de heme puede ser inhibida por acetona succinil (SA), un inhibidor potente y específico de deshidratasa ácido 5-aminolevulínico (ALAD) que es la segunda enzima en heme ruta biosintética 41. Usando este método, se midieron los niveles de síntesis del grupo hemo en células HeLa en presencia y abscia de 0,5 mM SA. La Figura 3 muestra que los niveles de síntesis del grupo hemo se redujo en más de 10 pliegues en presencia de SA. Para demostrar aún más el uso de esta técnica, se midieron y se compararon en 4 cáncer y en líneas de células HEK293T tal como se muestra en la Figura 4 los niveles de síntesis de hemo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51579/51579fig1.jpg" /> Figura 1. La biosíntesis del hemo vía en humanos ALAS, 5-aminolevulínico sintasa de ácidos.; 5-ALA, el ácido 5-aminolevulínico; ALAD, ALA deshidratasa; PBG, porfobilinógeno; HMBS, sintasa hidroximetilbilano; HMB, hidroximetilbilano; UROS, uroporfirinógeno III sintasa; UPgenIII, uroporfirinógeno III; UROD, uroporfirinógeno descarboxilasa; CPgenIII, coproporfirinógeno III; CPOX, coproporfirinógeno III oxidasa; PPgenIX, protoporfirinógeno IX; PPOX, protoporfirinógeno IX oxidasa; PPIX, protoporfirina IX; FECH, Ferroquelatasa. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51579/51579fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51579/51579fig2.jpg" /> Figura 2. Los niveles de la biosíntesis del grupo hemo en normal (HBEC30KT) y el cáncer (HCC4017) líneas celulares, en ausencia y presencia de 10 mM CCCP desacoplador mitocondrial. El nivel de fondo fue similar al nivel de la muestra en blanco (líquido de centelleo sola) y se fue inferior al 2% del control. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51579/51579fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51579/51579fig3.jpg" /> Figura 3. Niveles de la biosíntesis del grupo hemo en células HeLa en absENCE y la presencia de 0,5 mM de inhibidor de la síntesis del grupo hemo succinil acetona (SA). Las células fueron tratadas con SA durante 3 días antes de la medición hemo. El nivel de fondo fue similar al nivel de la muestra en blanco (líquido de centelleo solo) y fue inferior al 2% del control. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51579/51579fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51579/51579fig4.jpg" /> Figura 4. Comparación de los niveles de biosíntesis de hemo en 4 cancerosas y líneas de células HEK293T. El ensayo se realizó según el protocolo. HCC4017 se cultivaron en ACL4 medios de comunicación, A549 y H1395 en RPMI1640 suplementado con 5% de FBS, HEK293T y HeLa en DMEM suplementado con 10% FBS. Para el análisis estadístico, los niveles de síntesis de hemo en las células cancerosas y las células HEK293T fueron comparados con el nivel de la síntesis de hemo en HCC4017 células, mediante el uso de Welch 2 muestra de t-test. **, P valor &lt;0,005. El nivel de fondo fue similar al nivel de la muestra en blanco (líquido de centelleo solo) y fue inferior al 2% del control. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51579/51579fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

measurement-of-heme-synthesis-levels-in-mammalian-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K vistas.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Video: Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing Siembra y células de mamífero

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Investigación

Biología

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

Bioluminiscencia de imágenes de hemo oxigenasa-1 Upregulation en el procedimiento de Gua Sha

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En Fraccionamiento subcelular situ de células mamíferas adherentes y no adherentes-

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISIÓN combinados de detección del shRNA biblioteca en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...