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El presente protocolo describe cómo aislar y purificar la microglía primaria del hipocampo de ratones adultos, seguido de instrucciones para realizar registros de patch-clamp de células completas en estas células agudamente aisladas.
Las microglías son células inmunitarias residentes en el cerebro que interactúan con las neuronas para mantener la homeostasis del sistema nervioso central (SNC). Los estudios muestran que la superficie microglial expresa canales de potasio que regulan la activación microglial, mientras que las anomalías en estos canales de potasio pueden provocar enfermedades neuronales. En la actualidad, los registros de microglía con patch-clamp de células enteras se realizan principalmente en microglía primaria cultivada de ratones fetales o recién nacidos debido a las dificultades para realizar evaluaciones electrofisiológicas en microglía aislada agudamente. Este estudio presenta un protocolo fácil de seguir para aislar la microglía del hipocampo de ratones adultos y realizar registros de patch-clamp de células completas en las células aisladas. Brevemente, se extrajo el cerebro de un ratón después de la decapitación, el hipocampo se diseccionó bilateralmente y la microglía se aisló utilizando un kit de disociación cerebral de ratón adulto. A continuación, las microglías se purificaron utilizando un método de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) y se sembraron en cubreobjetos. El éxito del aislamiento microglial se confirmó mediante tinción inmunofluorescente con anticuerpos anti-CD11 y anti-Iba1. Se colocó un cubreobjetos en una cámara de registro y se registraron las corrientes de potasio de toda la célula de la microglía agudamente aislada en condiciones de pinza de voltaje.
La microglía, que deriva de los progenitores mieloides en el saco vitelino primitivo, reside en el SNC y comprende alrededor del 10% al 15% del total de células nerviosas 1,2. Funcionalmente, además de vigilar el entorno local, realizar funciones de defensa inmunitaria y proporcionar nutrición y apoyo a las neuronas 3,4, la microglía también puede contactar directamente con las neuronas para regular los receptores de la superficie neuronal y la unión de ligandos correspondiente, e interactuar indirectamente con las neuronas a través de la secreción de citocinas5. Los estudios in vitro e in vivo han demostrado que la microglía expresa varios tipos de canales de potasio, que contribuyen al mantenimiento del potencial de membrana negativo6 y regulan la activación microglial. Dado que se han observado canales microgliales de potasio anormales en varias enfermedades cerebrales7, es crucial que los investigadores identifiquen posibles fármacos que se dirijan a estos canales de potasio y desarrollen estrategias para regular la función microglial.
Los métodos tradicionales de digestión y purificación de la microglía a menudo utilizan todo el cerebro, lo que pasa por alto la heterogeneidad de la microglía en diferentes áreas del cerebro8. La disociación in vitro y el cultivo a largo plazo en medios que contienen suero colocan a la microglía en un estado activo9, que puede no reflejar con precisión sus características fisiológicas y su estado real.
Además, si bien se han registrado corrientes rectificadoras de potasio hacia el exterior en microglía y líneas celulares recién nacidas cultivadas primariamente10, los datos de cultivos a largo plazo de tejido cerebral de ratón fetal o recién nacido pueden diferir de los de la microglía madura. El presente protocolo tiene como objetivo aislar de forma aguda la microglía y realizar registros inmediatos de células completas de las corrientes de potasio microgliales utilizando tejido cerebral de ratón adulto.
Las propiedades bioquímicas y de los canales de potasio se examinaron utilizando un método adecuado para el aislamiento y purificación de microglía a partir de tejidos pequeños 11,12,13,14,15. Por lo tanto, este protocolo proporciona orientación para que los investigadores diluciden las propiedades bioquímicas y funcionales de la microglía en condiciones fisiológicas y patológicas. Aunque este protocolo utiliza el hipocampo y los canales de potasio como ejemplos, también se puede aplicar al estudio de otras áreas cerebrales y las propiedades electrofisiológicas de los canales/células.
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Ciencias de la Vida de la Universidad Normal del Sur de China, y se mantuvieron los estándares adecuados de bienestar animal (aprobación ética: SCNU-SLS-2023-048). Para este estudio se utilizaron ratones C57BL/6J machos o hembras de 3 a 5 meses de edad. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de soluciones
2. Preparación de suspensión unicelular a partir de tejido cerebral
3. Separación aguda de la microglía
4. Inmunofluorescencia
5. Registro de corrientes de potasio en microglía mediante patch-clamp de célula completa
Brevemente, el proceso implica el aislamiento de la microglía del hipocampo del cerebro de ratón adulto, seguido de un registro de parche de estas células (Figura 1). El procedimiento comienza con la disección del hipocampo de ratones adultos C57BL/6J de 3 a 5 meses de edad. Específicamente, se extrae todo el cerebro después de la perfusión y se coloca en una placa de cultivo que contiene PBS helado (Figura 2A). Para asegurar el aislamiento agudo de las células del hipocampo, se extirpa la corteza cerebral y se aísla intacto el tejido del hipocampo en forma de media luna (Figura 2B).
Para obtener una calidad celular óptima y posteriores registros de alta calidad de patch-clamp de células completas, es crucial controlar el tiempo de digestión durante la preparación de la suspensión de una sola célula. El estudio agitó manualmente el tejido del hipocampo en la mezcla de enzimas y limitó estrictamente el período de digestión a no más de 15 minutos (Figura 3). A continuación, las células se aislaron mediante el método MACS, alcanzando una pureza de 86,20% ± 0,68%19,20. Para confirmar que estas células clasificadas eran microglía, se probaron marcadores de superficie microglial por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos anti-Iba1 y anti-CD11b, que se utilizan ampliamente para detectar la microglía18. Los resultados indicaron que las células aisladas eran CD11b e Iba1 positivas, lo que confirma el aislamiento exitoso de la microglía (Figura 4).
Finalmente, para evaluar si la microglía aislada agudamente es de alta calidad para los experimentos de seguimiento, describimos cómo realizar registros de patch-clamp de células completas para evaluar las corrientes de potasio de la microglía. La microglía registrada tuvo una capacitancia de membrana promedio de 10.42 ± 2.05 (Figura 5). Los resultados demostraron que las corrientes microgliales de potasio podían registrarse, lo que indica que la microglía agudamente aislada es adecuada para estudios neurobiológicos.
Figura 1: Resumen del procedimiento experimental. Hay cuatro pasos principales: los tejidos cerebrales se extraen cuidadosamente y el hipocampo se disecciona bilateralmente; Los tejidos del hipocampo se digieren para preparar una suspensión unicelular utilizando una mezcla de enzimas como se detalla en la sección de protocolo; las células objetivo se aíslan mediante un método de clasificación de células activado magnéticamente; y las corrientes de potasio en células aisladas agudamente se analizan mediante el registro de patch-clamp de células completas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Disección del hipocampo. (A) Todo el cerebro de un ratón de 3 a 5 meses de edad. (B) Hipocampo bilateral aislado. Barra de escala: 0,5 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diagrama esquemático que muestra la digestión de los tejidos del hipocampo. Ilustración de los pasos experimentales críticos, asegurando que el tejido del hipocampo se digiera en una suspensión unicelular mediante la adición de mezclas de enzimas a 37 °C con agitación continua durante un máximo de 15 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Identificación de la microglía del hipocampo aislada de forma aguda. Imágenes confocales representativas que muestran células positivas para CD11b (verde) e Iba1 (rojo) purificadas del hipocampo, lo que confirma que las células aisladas son microglía. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Registro de las corrientes de potasio de la microglía de toda la célula. (A) Se coloca un electrodo de registro en la superficie de la microglía del hipocampo aislada. Barra de escala: 20 μm. (B) Corrientes representativas de potasio de la microglía del hipocampo agudamente aislada en condiciones de pinza de voltaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La microglía cultivada de ratones fetales o recién nacidos es claramente inadecuada para el estudio de la microglía adulta. Además, dada la heterogeneidad de la microglía en diferentes áreas del cerebro21, la microglía aislada de todo el cerebro puede no representar con precisión las características de la microglía en una estructura cerebral específica. Este protocolo proporciona un método para aislar la microglía del hipocampo específicamente para evaluar las propiedades eléctricas de estas células. Incluye métodos para registrar las corrientes gobernadas por los canales microgliales de potasio.
Es bien sabido que la digestión de los tejidos debe controlarse estrictamente cuando se preparan suspensiones unicelulares para evitar comprometer las propiedades de estas células durante el cultivo celular primario y los experimentos posteriores. Por lo general, una suspensión de una sola célula se obtiene de todo el cerebro a través de la digestión de enzimas pancreáticas y la homogeneización física. Sin embargo, cuando se aísla la microglía de un área específica del cerebro, como el hipocampo, la homogeneización física por sí sola no produce una cantidad suficiente de células para experimentos significativos. Además, las enzimas pancreáticas tienen una actividad digestiva vigorosa, lo que puede afectar la viabilidad celular.
Para abordar estos problemas, el estudio adoptó un procedimiento de disociación relativamente suave y controló manualmente el tiempo de digestión a no más de 15 minutos utilizando el kit de disociación cerebral de ratón adulto. Este enfoque mantiene la microglía en un estado activo, lo cual es fundamental para los registros posteriores de patch-clamp de células completas. El procedimiento de disociación leve también ofrece ventajas en términos de rapidez y rentabilidad.
Los métodos para la purificación de la microglía primaria incluyen el método de agitación estratificada (SSM)22, el método de centrifugación en gradiente de densidad (DGCM)23 y el método de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS)11,24. Entre estos, el SSM es ampliamente utilizado para la purificación de neuronas o células gliales. Sin embargo, una limitación importante del MUS es su incapacidad para alcanzar altos niveles de pureza25. Del mismo modo, el DGCM también da como resultado bajos niveles de pureza. El método FACS requiere la tinción de las células durante 15 minutos a 1 hora, seguida de una clasificación con un clasificador de células de alta velocidad, lo que puede perjudicar la viabilidad de las células. Por el contrario, este protocolo utiliza el método MACS, que ofrece un tiempo de aislamiento reducido y evita el uso repetitivo y lento de instrumentos y procedimientos de tinción. Como resultado, se obtienen microglías de alta pureza, aunque en cantidades potencialmente más pequeñas en comparación con algunos métodos alternativos.
Esta técnica tiene limitaciones. Por ejemplo, el método de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS, por sus siglas en inglés) produce relativamente poca microglía, y la microglía aislada agudamente no se puede cultivar durante períodos prolongados. Sin embargo, este enfoque es valioso porque permite investigar las propiedades electrofisiológicas de la microglía que se han preparado recientemente a partir del hipocampo del ratón adulto, en lugar de depender de células que se han cultivado durante mucho tiempo.
La técnica de patch-clamp de célula entera es una herramienta crucial y ampliamente utilizada para estudiar las propiedades electrofisiológicas celulares, particularmente neuronales, en campos como la neurociencia, la farmacología y la citobiología26. El registro de patch-clamp de células enteras se ha empleado en numerosos estudios para investigar las propiedades de cortes de cerebro, cultivos primarios y líneas celulares diseccionados de forma aguda. Sin embargo, hasta nuestras investigaciones, faltaban registros de patch-clamp de células completas de microglía agudamente aislada del cerebro de ratón adulto.
Este estudio no solo proporciona un protocolo para aislar la microglía del hipocampo adulta, sino que también demuestra el registro exitoso de las corrientes de potasio en estas microglías aisladas. En particular, es probable que este protocolo se aplique al estudio de la microglía en estructuras cerebrales distintas del hipocampo.
Los autores no tienen nada que revelar.
Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32170950, 32371065), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, Nos. 2023A1515010899 y 2021A1515010804.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm Petri dish | Corning | 353003 | |
15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | |
24-well plates | BD | 353047 | |
35 mm Petri dish | Corning | 353001 | - |
50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | |
70 μm cell screening | Miltenyi | 130-095-823 | To remove cell clumps before cell sorting |
Adult Mouse Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 130- 107-677 | |
Anti-CD11b Antibody | Bio-Rad | MCA74 | Goat Anti-mouse IgG also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
Anti-Iba 1 Antibody | SYSY | 234308 | Goat Anti-guinea pig IgG) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
Axon Digidata 1440A | USA | ||
Axon MultiClamp 700B Amplifier | USA | ||
BSA Albumin Fraction V | BioFrox | 4240GR500 | Serum |
C57BL/6 mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
CD11 b/c MicroBeads | Miltenyi | 130-105-634 | |
Chloral hydrate | Absin | abs47051394 | Widely used as anesthesia in mice |
Clampfit 10.6 | USA | ||
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
Culture medium | Fisher Scientific | C11995500BT | - |
DAPI dye | Beyotime | C1002 | |
Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
HBSS | Servicebio | G4203 | |
Horizontal shaker | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
Image analysis software | Fiji | ||
MACS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
MACS Separators | Miltenyi | 130-042-102 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4. |
Poly-L-lysine | Beyotime | C0313 | Coverslip coating |
Triton X-100 | Sigma | X100 |
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