Aislamiento y registro de microglía del hipocampo de ratones adultos

El presente protocolo describe cómo aislar y purificar la microglía primaria del hipocampo de ratones adultos, seguido de instrucciones para realizar registros de patch-clamp de células completas en estas células agudamente aisladas.

Las microglías son células inmunitarias residentes en el cerebro que interactúan con las neuronas para mantener la homeostasis del sistema nervioso central (SNC). Los estudios muestran que la superficie microglial expresa canales de potasio que regulan la activación microglial, mientras que las anomalías en estos canales de potasio pueden provocar enfermedades neuronales. En la actualidad, los registros de microglía con patch-clamp de células enteras se realizan principalmente en microglía primaria cultivada de ratones fetales o recién nacidos debido a las dificultades para realizar evaluaciones electrofisiológicas en microglía aislada agudamente. Este estudio presenta un protocolo fácil de seguir para aislar la microglía del hipocampo de ratones adultos y realizar registros de patch-clamp de células completas en las células aisladas. Brevemente, se extrajo el cerebro de un ratón después de la decapitación, el hipocampo se diseccionó bilateralmente y la microglía se aisló utilizando un kit de disociación cerebral de ratón adulto. A continuación, las microglías se purificaron utilizando un método de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) y se sembraron en cubreobjetos. El éxito del aislamiento microglial se confirmó mediante tinción inmunofluorescente con anticuerpos anti-CD11 y anti-Iba1. Se colocó un cubreobjetos en una cámara de registro y se registraron las corrientes de potasio de toda la célula de la microglía agudamente aislada en condiciones de pinza de voltaje.

La microglía, que deriva de los progenitores mieloides en el saco vitelino primitivo, reside en el SNC y comprende alrededor del 10% al 15% del total de células nerviosas ^1,2. Funcionalmente, además de vigilar el entorno local, realizar funciones de defensa inmunitaria y proporcionar nutrición y apoyo a las neuronas ^3,4, la microglía también puede contactar directamente con las neuronas para regular los receptores de la superficie neuronal y la unión de ligandos correspondiente, e interactuar indirectamente con las neuronas a través de la secreción de citocinas⁵. Los estudios in vitro e in vivo han demostrado que la microglía expresa varios tipos de canales de potasio, que contribuyen al mantenimiento del potencial de membrana negativo⁶ y regulan la activación microglial. Dado que se han observado canales microgliales de potasio anormales en varias enfermedades cerebrales⁷, es crucial que los investigadores identifiquen posibles fármacos que se dirijan a estos canales de potasio y desarrollen estrategias para regular la función microglial.

Los métodos tradicionales de digestión y purificación de la microglía a menudo utilizan todo el cerebro, lo que pasa por alto la heterogeneidad de la microglía en diferentes áreas del cerebro⁸. La disociación in vitro y el cultivo a largo plazo en medios que contienen suero colocan a la microglía en un estado activo⁹, que puede no reflejar con precisión sus características fisiológicas y su estado real.

Además, si bien se han registrado corrientes rectificadoras de potasio hacia el exterior en microglía y líneas celulares recién nacidas cultivadas primariamente¹⁰, los datos de cultivos a largo plazo de tejido cerebral de ratón fetal o recién nacido pueden diferir de los de la microglía madura. El presente protocolo tiene como objetivo aislar de forma aguda la microglía y realizar registros inmediatos de células completas de las corrientes de potasio microgliales utilizando tejido cerebral de ratón adulto.

Las propiedades bioquímicas y de los canales de potasio se examinaron utilizando un método adecuado para el aislamiento y purificación de microglía a partir de tejidos pequeños 11,12,13,14,15. Por lo tanto, este protocolo proporciona orientación para que los investigadores diluciden las propiedades bioquímicas y funcionales de la microglía en condiciones fisiológicas y patológicas. Aunque este protocolo utiliza el hipocampo y los canales de potasio como ejemplos, también se puede aplicar al estudio de otras áreas cerebrales y las propiedades electrofisiológicas de los canales/células.

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Ciencias de la Vida de la Universidad Normal del Sur de China, y se mantuvieron los estándares adecuados de bienestar animal (aprobación ética: SCNU-SLS-2023-048). Para este estudio se utilizaron ratones C57BL/6J machos o hembras de 3 a 5 meses de edad. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de soluciones

1. Prepare 50 mL de solución intracelular que contenga 160 mM de KF, 10 mM de HEPES, 10 mM de EGTA y 2 mM de MgCl₂. Ajustar el pH a 7,2 con 1 M de solución de KOH, y ajustar la presión osmótica a 300 mOsm con D-sacarosa^13,16. Conservar a -20 °C.
2. Prepare 50 mL de tampón de clasificación celular activado magnéticamente (MACS) que contiene 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en PBS.
3. Prepare poli-L-lisina (PLL) en una dilución de 1:1000 en agua.
   NOTA: Los cubreobjetos deben recubrirse con PLL el día antes del experimento. Incubar las barbobotas recubiertas a 37 °C durante la noche. Recicle el PLL el segundo día y seque los engominados a 37 °C.

2. Preparación de suspensión unicelular a partir de tejido cerebral

1. Anestesiar a los ratones con hidrato de cloral al 2,5% (0,15 mL/10 g, i.p.) (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). La desaparición del reflejo corneal y del reflejo del dolor al pellizcar los dedos de los pies o pellizcar la piel en ratones confirma la anestesia profunda. Coloque a los animales en decúbito supino sobre una mesa de disección y sujete sus extremidades con alfileres.
   1. Exponga el tórax y perfunda el corazón¹⁷ con PBS estéril helado para eliminar las células sanguíneas circulantes intravasculares. Sostenga la cabeza y corte la piel a lo largo de la línea media del cerebro con unas tijeras para exponer el cráneo.
   2. Corta la parte posterior del cráneo bilateralmente y entre las cuencas de los ojos con unas tijeras pequeñas. Corta el cráneo a lo largo de la sutura sagital y retira el cráneo con unas pinzas. Extraiga el tejido cerebral rápidamente con pinzas¹⁷.
2. Coloque el tejido cerebral en placas de cultivo de 10 cm que contengan PBS helado. Diseccionar la corteza cerebral bilateralmente con pinzas, aislar el tejido del hipocampo y cortarlo en trozos más pequeños. Transfiera las piezas a un tubo de centrífuga de 15 mL.
   NOTA: La disección bilateral de la corteza cerebral revela la media luna de tejido del hipocampo en ambos hemisferios del cerebro.
3. Vuelva a suspender los pequeños trozos de tejido del hipocampo en 2 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) helada y centrifugue a 300 × g durante 3 minutos (a temperatura ambiente), luego deseche el HBSS.
4. Añadir 1950 μL de mezcla de enzimas 1 al tubo de centrífuga de 15 mL que contiene las piezas de tejido del hipocampo. Agite el tubo de centrífuga continuamente en un baño de agua a 37 °C durante 5 min.
   NOTA: La mezcla de enzimas 1 es una combinación de 50 μL de enzima P y 1900 μL de tampón Y, precalentada a 37 °C (presente como parte del kit disponible comercialmente, consulte la Tabla de materiales).
5. Retire el tubo de centrífuga del baño de agua. Añada 30 μL de mezcla de enzimas recién preparada 2 al tubo de centrífuga de 15 mL. Pipetear los fragmentos de tejido hacia arriba y hacia abajo 20 veces con una punta de pipeta de 1 ml e incubar en un baño de agua durante 5 minutos con agitación continua a 37 °C.
   NOTA: La mezcla de enzimas 2 es una combinación de 20 μL de tampón Y y 10 μL de enzima A. Los dos pasos de digestión anteriores convierten el tejido cerebral en una suspensión celular. El tiempo total de digestión no debe exceder los 15 min.
6. Retire el tubo de centrífuga y pipetee la suspensión hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta de 1 ml hasta que no queden trozos grandes de tejido.
7. Filtre la suspensión celular a través de un filtro de cribado celular de 70 μm y recoja el filtrado en un tubo de centrífuga limpio de 50 mL.
   NOTA: Este paso elimina cualquier trozo grande de tejido no digerido.
8. Transfiera el filtrado a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugue a 4 °C, 300 × g durante 10 min. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 1 mL.
9. Lave la suspensión de la célula pipeteando hacia arriba y hacia abajo 20 veces con 15 mL de HBSS y centrifugue a 4 °C, 300 × g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y
   resuspender el pellet de celda en 1 mL de tampón MACS.
   NOTA: Este paso proporciona la suspensión de una sola célula utilizada en experimentos posteriores.

3. Separación aguda de la microglía

1. Transfiera 1 mL de la suspensión unicelular a un tubo de microcentrífuga de 2 mL y centrifugue a 4 °C, 300 × g durante 3 min. Deseche el sobrenadante.
2. Vuelva a suspender el pellet de una sola célula en 90 μL de tampón MACS. Añadir 10 μL de microperlas CD11b/c e incubar la suspensión a 4 °C durante 15 min en un agitador horizontal.
3. Coloque la columna de clasificación en el campo magnético de un separador MACS adecuado y humedezca la columna dos veces con 500 μL de tampón MACS.
4. Lave la suspensión unicelular añadiendo 1 mL de tampón MACS directamente al tubo y centrifugue a 4 °C, 300 × g durante 3 min. Aspire el sobrenadante por completo.
5. Vuelva a suspender el pellet de celda en 500 μL de tampón MACS.
6. Transfiera la suspensión de células resuspendidas a la columna de clasificación en el campo magnético utilizando una pipeta de 1 mL. Deseche el flujo continuo. Lave la columna tres veces con 500 μL de tampón MACS mientras permanece en el campo magnético.
   NOTA: El flujo a través contiene celdas sin etiquetar. La columna debe lavarse sin sacarla del campo magnético.
7. Retire la columna de clasificación del campo magnético. Agregue 1 mL de tampón MACS a la columna y empújelo lentamente con el pistón. Recoja el flujo continuo.
   NOTA: El flujo contiene las células marcadas (es decir, la microglía). Para mejorar la pureza de la microglía, el proceso se puede repetir con una nueva columna de clasificación (opcional).
8. Siembre las células seleccionadas en una placa de 24 pocillos que contenga un cubreobjetos recubierto con PLL. Añadir 200 μL de medio de cultivo e incubar durante 20 min en una incubadora a 37 °C con 95% de_O2, 5% de_CO2 y 60%-80% de humedad. Este paso permite que la microglía se adhiera al cubreobjetos para posteriores experimentos de inmunofluorescencia y pinzamiento de parches de células completas.

4. Inmunofluorescencia

1. Aspire el medio de cultivo de los pocillos de la placa y enjuague las células tres veces con 0,1 M de PBS en el agitador.
2. Deseche el PBS y fije la microglía en el cubreobjetos con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
3. Retire el fijador y enjuague el cubreobjetos tres veces con 0,1 M PBS.
4. Deseche el PBS y permeabilice las células con 200 μL de tampón de bloqueo que contenga 0,2% de Triton X-100 y 5% de BSA en PBS durante 1 h a RT en el agitador.
5. Incubar la microglía con tampón bloqueante más anticuerpos primarios anti-Iba1 y anti-CD11b¹⁸ durante la noche a 4 °C.
6. Al día siguiente, retire los anticuerpos primarios y enjuague el cubreobjetos tres veces con PBS a RT en el agitador.
7. Incubar la microglía con el tampón de bloqueo que contiene anticuerpos secundarios acoplados a fluoróforos durante 2 h en RT. Añadir colorante DAPI durante los últimos 15 minutos de incubación.
8. Retire los anticuerpos secundarios y enjuague el cubreobjetos tres veces con PBS. Monte los cubreobjetos en los portaobjetos del microscopio para obtener imágenes.

5. Registro de corrientes de potasio en microglía mediante patch-clamp de célula completa

1. Descongele la solución intracelular y manténgala en hielo.
2. Extraiga pipetas de parche (electrodos) de capilares de vidrio de borosilicato de pared delgada con un extractor vertical¹⁷.
   NOTA: La resistencia del electrodo debe ser inferior a 10 MΩ.
3. Transfiera un cubreobjetos a la cámara de registro y agregue la solución extracelular que contiene 160 mM de NaCl, 4,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl₂, 1 mM de MgCl₂ y 10 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7,2 con una solución de NaOH 1 M antes de usar^13,16 y ajuste la presión osmótica a 300 mOsm con D-sacarosa.
4. Localice la microglía esférica bajo un microscopio de agua utilizando el objetivo 40x.
5. Llene el electrodo con solución intracelular, conéctelo a la etapa principal del amplificador de la configuración de electrofisiología y aplique presión positiva. Cambie al objetivo 4x y localice el electrodo.
   1. Baje el electrodo en la solución de baño y configure el amplificador en modo de pinza de voltaje para realizar la prueba de membrana en modo de baño . Vuelva al objetivo de 40x y acerque la punta del electrodo a la microglía.
      NOTA: Cuando la punta del electrodo está muy cerca de una célula microglial, la resistencia debe aumentar ligeramente.
   2. Aplique una pequeña presión negativa para sujetar la celda. Cuando la resistencia alcance los 100 MΩ, cambie del modo de baño al modo de parche en la prueba de membrana. Cuando la resistencia alcance los 300 MΩ, libere la presión negativa.
   3. Cuando la resistencia indica la formación de un sello de gigaohmios (es decir, >1 GΩ) entre el electrodo y la membrana microglial, cambie del modo de parche al modo de celda en la prueba de membrana.
6. Aplique una pequeña cantidad de succión e inicie una descarga eléctrica para romper la membrana. La aparición de grandes transitorios capacitivos indica una ruptura exitosa de la membrana.
7. Cambie al modo de pinza de voltaje y abra el programa de grabación. Registre las corrientes de potasio durante 200 ms. Para probar los potenciales, aplique pasos de voltaje en incrementos de 20 mV de -120 mV a +40 mV a 1 Hz.
8. Analice los datos obtenidos fuera de línea utilizando el software adecuado.

Brevemente, el proceso implica el aislamiento de la microglía del hipocampo del cerebro de ratón adulto, seguido de un registro de parche de estas células (Figura 1). El procedimiento comienza con la disección del hipocampo de ratones adultos C57BL/6J de 3 a 5 meses de edad. Específicamente, se extrae todo el cerebro después de la perfusión y se coloca en una placa de cultivo que contiene PBS helado (Figura 2A). Para asegurar el aislamiento agudo de las células del hipocampo, se extirpa la corteza cerebral y se aísla intacto el tejido del hipocampo en forma de media luna (Figura 2B).

Para obtener una calidad celular óptima y posteriores registros de alta calidad de patch-clamp de células completas, es crucial controlar el tiempo de digestión durante la preparación de la suspensión de una sola célula. El estudio agitó manualmente el tejido del hipocampo en la mezcla de enzimas y limitó estrictamente el período de digestión a no más de 15 minutos (Figura 3). A continuación, las células se aislaron mediante el método MACS, alcanzando una pureza de 86,20% ± 0,68%^19,20. Para confirmar que estas células clasificadas eran microglía, se probaron marcadores de superficie microglial por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos anti-Iba1 y anti-CD11b, que se utilizan ampliamente para detectar la microglía¹⁸. Los resultados indicaron que las células aisladas eran CD11b e Iba1 positivas, lo que confirma el aislamiento exitoso de la microglía (Figura 4).

Finalmente, para evaluar si la microglía aislada agudamente es de alta calidad para los experimentos de seguimiento, describimos cómo realizar registros de patch-clamp de células completas para evaluar las corrientes de potasio de la microglía. La microglía registrada tuvo una capacitancia de membrana promedio de 10.42 ± 2.05 (Figura 5). Los resultados demostraron que las corrientes microgliales de potasio podían registrarse, lo que indica que la microglía agudamente aislada es adecuada para estudios neurobiológicos.

Figura 1: Resumen del procedimiento experimental. Hay cuatro pasos principales: los tejidos cerebrales se extraen cuidadosamente y el hipocampo se disecciona bilateralmente; Los tejidos del hipocampo se digieren para preparar una suspensión unicelular utilizando una mezcla de enzimas como se detalla en la sección de protocolo; las células objetivo se aíslan mediante un método de clasificación de células activado magnéticamente; y las corrientes de potasio en células aisladas agudamente se analizan mediante el registro de patch-clamp de células completas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Disección del hipocampo. (A) Todo el cerebro de un ratón de 3 a 5 meses de edad. (B) Hipocampo bilateral aislado. Barra de escala: 0,5 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diagrama esquemático que muestra la digestión de los tejidos del hipocampo. Ilustración de los pasos experimentales críticos, asegurando que el tejido del hipocampo se digiera en una suspensión unicelular mediante la adición de mezclas de enzimas a 37 °C con agitación continua durante un máximo de 15 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Identificación de la microglía del hipocampo aislada de forma aguda. Imágenes confocales representativas que muestran células positivas para CD11b (verde) e Iba1 (rojo) purificadas del hipocampo, lo que confirma que las células aisladas son microglía. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Registro de las corrientes de potasio de la microglía de toda la célula. (A) Se coloca un electrodo de registro en la superficie de la microglía del hipocampo aislada. Barra de escala: 20 μm. (B) Corrientes representativas de potasio de la microglía del hipocampo agudamente aislada en condiciones de pinza de voltaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La microglía cultivada de ratones fetales o recién nacidos es claramente inadecuada para el estudio de la microglía adulta. Además, dada la heterogeneidad de la microglía en diferentes áreas del cerebro²¹, la microglía aislada de todo el cerebro puede no representar con precisión las características de la microglía en una estructura cerebral específica. Este protocolo proporciona un método para aislar la microglía del hipocampo específicamente para evaluar las propiedades eléctricas de estas células. Incluye métodos para registrar las corrientes gobernadas por los canales microgliales de potasio.

Es bien sabido que la digestión de los tejidos debe controlarse estrictamente cuando se preparan suspensiones unicelulares para evitar comprometer las propiedades de estas células durante el cultivo celular primario y los experimentos posteriores. Por lo general, una suspensión de una sola célula se obtiene de todo el cerebro a través de la digestión de enzimas pancreáticas y la homogeneización física. Sin embargo, cuando se aísla la microglía de un área específica del cerebro, como el hipocampo, la homogeneización física por sí sola no produce una cantidad suficiente de células para experimentos significativos. Además, las enzimas pancreáticas tienen una actividad digestiva vigorosa, lo que puede afectar la viabilidad celular.

Para abordar estos problemas, el estudio adoptó un procedimiento de disociación relativamente suave y controló manualmente el tiempo de digestión a no más de 15 minutos utilizando el kit de disociación cerebral de ratón adulto. Este enfoque mantiene la microglía en un estado activo, lo cual es fundamental para los registros posteriores de patch-clamp de células completas. El procedimiento de disociación leve también ofrece ventajas en términos de rapidez y rentabilidad.

Los métodos para la purificación de la microglía primaria incluyen el método de agitación estratificada (SSM)²², el método de centrifugación en gradiente de densidad (DGCM)²³ y el método de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS)^11,24. Entre estos, el SSM es ampliamente utilizado para la purificación de neuronas o células gliales. Sin embargo, una limitación importante del MUS es su incapacidad para alcanzar altos niveles de pureza²⁵. Del mismo modo, el DGCM también da como resultado bajos niveles de pureza. El método FACS requiere la tinción de las células durante 15 minutos a 1 hora, seguida de una clasificación con un clasificador de células de alta velocidad, lo que puede perjudicar la viabilidad de las células. Por el contrario, este protocolo utiliza el método MACS, que ofrece un tiempo de aislamiento reducido y evita el uso repetitivo y lento de instrumentos y procedimientos de tinción. Como resultado, se obtienen microglías de alta pureza, aunque en cantidades potencialmente más pequeñas en comparación con algunos métodos alternativos.

Esta técnica tiene limitaciones. Por ejemplo, el método de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS, por sus siglas en inglés) produce relativamente poca microglía, y la microglía aislada agudamente no se puede cultivar durante períodos prolongados. Sin embargo, este enfoque es valioso porque permite investigar las propiedades electrofisiológicas de la microglía que se han preparado recientemente a partir del hipocampo del ratón adulto, en lugar de depender de células que se han cultivado durante mucho tiempo.

La técnica de patch-clamp de célula entera es una herramienta crucial y ampliamente utilizada para estudiar las propiedades electrofisiológicas celulares, particularmente neuronales, en campos como la neurociencia, la farmacología y la citobiología²⁶. El registro de patch-clamp de células enteras se ha empleado en numerosos estudios para investigar las propiedades de cortes de cerebro, cultivos primarios y líneas celulares diseccionados de forma aguda. Sin embargo, hasta nuestras investigaciones, faltaban registros de patch-clamp de células completas de microglía agudamente aislada del cerebro de ratón adulto.

Este estudio no solo proporciona un protocolo para aislar la microglía del hipocampo adulta, sino que también demuestra el registro exitoso de las corrientes de potasio en estas microglías aisladas. En particular, es probable que este protocolo se aplique al estudio de la microglía en estructuras cerebrales distintas del hipocampo.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32170950, 32371065), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, Nos. 2023A1515010899 y 2021A1515010804.