成年小鼠海马小胶质细胞的分离和全细胞膜片钳记录

本方案描述了如何从成年小鼠中分离和纯化原代海马小胶质细胞，然后说明在这些急性分离的细胞上进行全细胞膜片钳记录。

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，它与神经元相互作用以维持中枢神经系统 （CNS） 的稳态。研究表明，小胶质细胞表面表达调节小胶质细胞活化的钾通道，而这些钾通道的异常会导致神经系统疾病。目前，由于难以对急性分离的小胶质细胞进行电生理评估，小胶质细胞的全细胞膜片钳记录主要在胎儿或新生小鼠培养的原代小胶质细胞上进行。本研究介绍了一种易于遵循的方案，用于从成年小鼠中分离海马小胶质细胞，并在分离的细胞上进行全细胞膜片钳记录。简而言之，在斩首后从小鼠身上取出大脑，双侧解剖海马体，并使用成年小鼠脑分离试剂盒分离小胶质细胞。然后使用磁激活细胞分选 （MACS） 方法纯化小胶质细胞，并接种到盖玻片上。通过使用抗 CD11 和抗 Iba1 抗体的免疫荧光染色证实小胶质细胞分离成功。将盖玻片放置在记录室中，并在电压钳条件下记录急性分离的小胶质细胞的全细胞钾电流。

小胶质细胞来源于原始卵黄囊中的骨髓祖细胞，驻留在 CNS 中，约占总神经细胞的 10% 至 15% ^1,2。在功能上，小胶质细胞除了监视局部环境、执行免疫防御功能以及为神经元提供营养和支持 ^3,4 外，还可以直接接触神经元以调节神经元表面受体和相应的配体结合，并通过分泌细胞因子间接与神经元相互作用⁵。体外和体内研究表明，小胶质细胞表达各种类型的钾通道，这有助于维持负膜电位⁶ 并调节小胶质细胞活化。鉴于在各种脑部疾病中观察到异常的小胶质细胞钾通道⁷，研究人员确定针对这些钾通道的潜在药物并制定调节小胶质细胞功能的策略至关重要。

传统的小胶质细胞消化和纯化方法通常使用整个大脑，这忽略了小胶质细胞在不同大脑区域的异质性⁸。 体外 解离和在含血清培养基中长期培养使小胶质细胞处于活性状态⁹，这可能不能准确反映其生理特性和真实状态。

此外，虽然在原代培养的新生小胶质细胞和细胞系中记录了向外的整流钾电流¹⁰，但来自胎儿或新生小鼠脑组织长期培养的数据可能与成熟小胶质细胞的数据不同。本方案旨在急性分离小胶质细胞并立即使用成年小鼠脑组织进行小胶质细胞钾电流的全细胞记录。

使用适合从小组织中分离和纯化小胶质细胞的方法检查生化和钾通道特性^{11、12、13、14、15}。因此，该方案为研究人员阐明小胶质细胞在生理和疾病条件下的生化和功能特性提供了指导。虽然该方案使用海马体和钾通道作为示例，但它也可以应用于其他大脑区域和通道/细胞电生理特性的研究。

所有实验均经华南师范大学生命科学动物护理与使用委员会批准，并保持适当的动物福利标准（伦理批准:SCNU-SLS-2023-048）。本研究使用雄性或雌性 3-5 月龄 C57BL/6J 小鼠。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 溶液的制备

1. 制备 50 mL 细胞内溶液，含有 160 mM KF、10 mM HEPES、10 mM EGTA 和 2 mM MgCl₂。用 1 M KOH 溶液将 pH 值调节至 7.2，并用 D-蔗糖^13,16 将渗透压调节至 300 mOsm。储存在 -20 °C。
2. 制备 50 mL 磁激活细胞分选 （MACS） 缓冲液，其中含有 0.5% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 2 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 的 PBS 溶液。
3. 在水中制备 1:1000 稀释度的聚-L-赖氨酸 （PLL）。
   注意:盖玻片应在实验前一天涂上 PLL。将包被的玻片在 37 °C 下孵育过夜。第二天回收 PLL 并在 37 °C 下干燥涂层的玻片。

2. 从脑组织中制备单细胞悬液

1. 用 2.5% 水合氯醛（0.15 mL/10 g，ip）麻醉小鼠（遵循机构批准的协议）。通过捏住脚趾或捏住小鼠的皮肤而消失角膜反射和疼痛反射证实了深度麻醉。将动物仰卧在解剖台上并固定它们的四肢。
   1. 暴露胸部并用冰冷的无菌 PBS 灌注心脏¹⁷ 以去除血管内循环血细胞。握住头部，用剪刀沿大脑中线切开皮肤，露出头骨。
   2. 用小剪刀在双侧和眼窝之间剪开颅骨的后部。沿着矢状缝线切开颅骨，然后用镊子去除颅骨。用镊子快速提取脑组织¹⁷.
2. 将脑组织放入含有冰冷 PBS 的 10 cm 培养皿中。用镊子双侧解剖大脑皮层，分离海马组织，切成小块。将碎片转移到 15 mL 离心管中。
   注意:大脑皮层的双侧解剖揭示了大脑两个半球海马组织的新月形。
3. 将小块海马组织重悬于 2 mL 冰冷的 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 中，并以 300 × g 离心 3 分钟（在室温下），然后丢弃 HBSS。
4. 将 1950 μL 酶混合物 1 添加到含有海马组织块的 15 mL 离心管中。在 37 °C 水浴中连续摇动离心管 5 分钟。
   注:酶混合物 1 是 50 μL 酶 P 和 1900 μL 缓冲液 Y 的组合，预热至 37 °C（作为市售试剂盒的一部分，参见 材料表）。
5. 从水浴中取出离心管。向 15 mL 离心管中加入 30 μL 新鲜制备的酶混合物 2。用 1 mL 移液器吸头上下移液组织碎片 20 次，并在 37°C 下连续摇动在水浴中孵育 5 分钟。
   注:酶混合物 2 是 20 μL 缓冲液 Y 和 10 μL 酶 A 的组合。上述两个消化步骤将脑组织转化为细胞悬液。总消化时间不应超过 15 分钟。
6. 取出离心管，用 1 mL 移液器上下多次吸取悬浮液，直到没有大的组织碎片残留。
7. 通过 70 μm 细胞筛选过滤器过滤细胞悬液，并将滤液收集在干净的 50 mL 离心管中。
   注意:此步骤去除任何大块未消化的组织。
8. 将滤液转移到新的 15 mL 离心管中，并在 4 °C、300 × g 下离心 10 分钟。用 1 mL 移液器弃去上清液。
9. 用 15 mL HBSS 上下吹打 20 次洗涤细胞悬液，并在 4 °C、300 × g 下离心 10 分钟。弃去上清液和
   将细胞沉淀重悬于 1 mL MACS 缓冲液中。
   注:此步骤提供后续实验中使用的单细胞悬液。

3. 小胶质细胞的急性分离

1. 将 1 mL 单细胞悬液转移到 2 mL 微量离心管中，并在 4 °C、300 × g 下离心 3 分钟。丢弃上清液。
2. 将单细胞沉淀重悬于 90 μL MACS 缓冲液中。加入 10 μL CD11b/c 微珠，并在 4 °C 下在水平振荡器上孵育悬浮液 15 分钟。
3. 将分选柱置于合适的 MACS 分离器的磁场中，并用 500 μL MACS 缓冲液润湿柱子两次。
4. 通过向试管中直接加入 1 mL MACS 缓冲液洗涤单细胞悬液，并在 4 °C、300 × g 下离心 3 分钟。完全吸出上清液。
5. 将细胞沉淀重悬于 500 μL MACS 缓冲液中。
6. 使用 1 mL 移液器将重悬的细胞悬液转移到磁场中的分选柱中。丢弃流出物。当色谱柱保持在磁场中时，用 500 μL MACS 缓冲液洗涤色谱柱 3 次。
   注:流通液包含未标记的单元格。应清洗色谱柱，不要将其从磁场中取出。
7. 从磁场中移除排序列。向色谱柱中加入 1 mL MACS 缓冲液，然后用活塞缓慢将其推入。收集流出。
   注:流出液包含标记的细胞（即小胶质细胞）。为了提高小胶质细胞的纯度，可以使用新的分选列（可选）重复该过程。
8. 将选定的细胞接种到含有涂有 PLL 的盖玻片的 24 孔板中。加入 200 μL 培养基，在 37 °C 培养箱中孵育 20 分钟，培养箱含 O₂% 为 95%，CO₂ 为 5%，湿度为 60%-80%。此步骤允许小胶质细胞附着在盖玻片上，用于随后的全细胞膜片钳和免疫荧光实验。

4. 免疫荧光

1. 从板孔中吸出培养基，并在摇床上用 0.1 M PBS 冲洗细胞 3 次。
2. 弃去 PBS，并在室温 （RT） 下用 4% 多聚甲醛 （PFA） 将小胶质细胞固定在盖玻片上 20 分钟。
3. 取出固定剂并用 0.1 M PBS 冲洗盖玻片 3 次。
4. 丢弃 PBS，并在摇床上用 200 μL 含有 0.2% Triton X-100 和 5% BSA 的 PBS 溶液的封闭缓冲液透化细胞 1 小时。
5. 将小胶质细胞与封闭缓冲液加抗 Iba1 和抗 CD11b 一抗¹⁸ 在 4 °C 下孵育过夜。
6. 第二天，去除一抗，并在摇床上用 PBS 在 RT 下冲洗盖玻片 3 次。
7. 将小胶质细胞与含有荧光团偶联二抗的封闭缓冲液在 RT 下孵育 2 小时。在孵育的最后 15 分钟添加 DAPI 染料。
8. 取出二抗并用 PBS 冲洗盖玻片 3 次。将盖玻片安装在显微镜载玻片上以进行成像。

5. 小胶质细胞中钾电流的全细胞膜片钳记录

1. 解冻细胞内溶液并将其保存在冰上。
2. 使用垂直拉杆¹⁷ 从薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管中拉出贴片移液器（电极）。
   注意: 电极电阻应小于 10 MΩ。
3. 将盖玻片转移到记录室中，加入含有 160 mM NaCl、4.5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂ 和 10 mM HEPES 的细胞外溶液。使用前用 1 M NaOH 溶液将 pH 值调节至 7.2 ^13,16，并用 D-蔗糖将渗透压调节至 300 mOsm。
4. 使用 40 倍物镜在水显微镜下定位球形小胶质细胞。
5. 用细胞内溶液填充电极，将其连接到电生理学设置的放大器头级，并施加正压。切换到 4x 物镜并找到电极。
   1. 将电极放入浴液中，并将放大器设置为电压钳模式，以在 浴 模式下进行膜测试。切换回 40 倍物镜并将电极尖端移近小胶质细胞。
      注意:当电极尖端非常靠近小胶质细胞时，电阻应略有增加。
   2. 施加微小的负压以保持细胞。当电阻达到 100 MΩ 时，在膜测试中从 浴 模式切换到 贴片 模式。当电阻达到 300 MΩ 时，释放负压。
   3. 当电阻表明在电极和小胶质细胞膜之间形成千兆级密封（即 >1 GΩ）时，在膜测试中从 贴片 模式切换到 细胞 模式。
6. 施加少量吸力并启动电击以破坏膜。大电容瞬变的出现表明膜破裂成功。
7. 切换到电压钳模式并打开录制程序。记录钾电流 200 毫秒。要测试电位，请在 1 Hz 时以 -120 mV 至 +40 mV 的增量施加 20 mV 的电压步长。
8. 使用适当的软件离线分析获得的数据。

简而言之，该过程包括从成年小鼠大脑中分离海马小胶质细胞，然后对这些细胞进行全细胞膜片钳记录（图 1）。该程序从解剖 3 至 5 个月大的 C57BL/6J 成年小鼠的海马体开始。具体来说，灌注后取出整个大脑并放入含有冰冷 PBS 的培养皿中（图 2A）。为了确保细胞从海马体中急性分离，去除大脑皮层，并完整分离新月形海马组织（图 2B）。

为了获得最佳的细胞质量和随后的高质量全细胞膜片钳记录，在单细胞悬液制备过程中控制消化时间至关重要。该研究始终手动搅动酶混合物中的海马组织，并将消化时间严格限制在不超过 15 分钟（图 3）。然后使用 MACS 方法分离细胞，纯度为 86.20% ± 0.68%^19,20。为了确认这些分选的细胞是小胶质细胞，使用广泛用于检测小胶质细胞¹⁸ 的抗 Iba1 和抗 CD11b 抗体通过免疫荧光检测小胶质细胞表面标志物。结果表明，分离的细胞为 CD11b 和 Iba1 阳性，证实了小胶质细胞的成功分离（图 4）。

最后，为了评估急性分离的小胶质细胞是否具有后续实验的高质量，我们描述了如何进行全细胞膜片钳记录以评估小胶质细胞钾电流。记录的小胶质细胞的平均膜电容为 10.42 ± 2.05（图 5）。结果表明，可以记录小胶质细胞钾电流，表明急性分离的小胶质细胞适合神经生物学研究。

图 1:实验程序概述。 有四个主要步骤:仔细提取脑组织，双侧解剖海马体;消化海马组织以使用酶混合物制备单细胞悬液，如方案部分所述;通过磁激活细胞分选方法分离靶细胞;急性分离细胞中的钾电流通过全细胞膜片钳记录进行测定。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:海马体解剖。 （A） 3 到 5 个月大的小鼠的整个大脑。（B） 孤立的双侧海马体。比例尺:0.5 厘米。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:显示海马组织消化的示意图。 关键实验步骤的图示，通过在 37 °C 下加入酶混合物并连续振荡长达 15 分钟，确保海马组织被消化成单细胞悬液。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:急性孤立性海马小胶质细胞的鉴定。 代表性共聚焦图像显示从海马体中纯化的 CD11b（绿色）和 Iba1（红色）阳性细胞，证实分离的细胞是小胶质细胞。比例尺:10 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 5:全细胞小胶质细胞钾电流的记录。 （A） 记录电极位于离体海马小胶质细胞的表面。比例尺:20 μm。（B） 在电压钳条件下急性分离的海马小胶质细胞的代表性钾电流。 请单击此处查看此图的较大版本。

来自胎儿或新生小鼠培养的小胶质细胞显然不适合研究成年小胶质细胞。此外，鉴于小胶质细胞在不同大脑区域的异质性²¹，从全脑分离的小胶质细胞可能无法准确代表特定大脑结构中小胶质细胞的特征。该协议提供了一种分离海马小胶质细胞的方法，专门用于评估这些细胞的电特性。它包括记录由小胶质细胞钾通道控制的电流的方法。

众所周知，在制备单细胞悬液时需要严格控制组织消化，以避免在原代细胞培养和后续实验中损害这些细胞的特性。通常，单细胞悬液是通过胰酶消化和物理匀浆从全脑获得的。然而，当从特定的大脑区域（例如海马体）中分离小胶质细胞时，单独的物理匀浆并不能产生足够数量的细胞进行有意义的实验。此外，胰酶具有旺盛的消化活性，这会影响细胞活力。

为了解决这些问题，该研究采用了一种相对温和的解离程序，并使用成年小鼠脑解离试剂盒手动将消化时间控制在不超过 15 分钟。这种方法将小胶质细胞保持在活性状态，这对于随后的全细胞膜片钳记录至关重要。温和的解离程序在速度和成本效益方面也具有优势。

原代小胶质细胞的纯化方法包括分层振荡法 （SSM）²²、密度梯度离心法 （DGCM）²³ 和荧光激活细胞分选法 （FACS）^11,24。其中，SSM 广泛用于神经元或神经胶质细胞的纯化。然而，SSM 的一个主要限制是它无法达到高水平的纯度²⁵。同样，DGCM 也会导致低纯度水平。FACS 方法需要对细胞进行染色 15 分钟至 1 小时，然后用高速细胞分选仪进行分选，这可能会损害细胞活力。相比之下，该方案利用 MACS 方法，该方法缩短了分离时间，避免了重复和耗时的仪器和染色程序的使用。因此，可以获得高纯度的小胶质细胞，尽管与某些替代方法相比，其数量可能更少。

这种技术有局限性。例如，磁激活细胞分选 （MACS） 方法产生的小胶质细胞相对较少，急性分离的小胶质细胞不能长时间培养。然而，这种方法很有价值，因为它允许研究从成年小鼠海马体新鲜制备的小胶质细胞的电生理特性，而不是依赖于已经培养了很长时间的细胞。

全细胞膜片钳技术是研究神经科学、药理学和细胞生物学等领域细胞（特别是神经元）电生理特性的重要且广泛使用的工具²⁶。全细胞膜片钳记录已用于许多研究，以研究急性解剖的脑切片、原代培养物和细胞系的特性。然而，在我们的研究之前，缺乏从成年小鼠大脑中急性分离的小胶质细胞的全细胞膜片钳记录。

这项研究不仅提供了分离成年海马小胶质细胞的方案，而且还证明了在这些分离的小胶质细胞中成功记录钾电流。值得注意的是，该方案可能适用于海马体以外的大脑结构中小胶质细胞的研究。

作者没有什么可披露的。

这项工作得到了中国国家自然科学基金 （32170950， 32371065）、广东省自然科学基金 Nos. 2023A1515010899 和 2021A1515010804 的资助。