Cuantificación de la selectividad de las características visuales del reflejo optocinético en ratones

A continuación, describimos un protocolo estándar para cuantificar el reflejo optocinético. Combina la estimulación virtual de tambores y la video-oculografía, y por lo tanto permite una evaluación precisa de la selectividad de las características del comportamiento y su plasticidad adaptativa.

El reflejo optocinético (OKR) es un movimiento ocular innato esencial que se desencadena por el movimiento global del entorno visual y sirve para estabilizar las imágenes de la retina. Debido a su importancia y robustez, el OKR se ha utilizado para estudiar el aprendizaje visomotor y para evaluar las funciones visuales de ratones con diferentes antecedentes genéticos, edades y tratamientos farmacológicos. Aquí, presentamos un procedimiento para evaluar las respuestas OKR de ratones con la cabeza fija con alta precisión. La fijación de la cabeza puede descartar la contribución de la estimulación vestibular a los movimientos oculares, lo que permite medir los movimientos oculares desencadenados solo por el movimiento visual. El OKR es provocado por un sistema de tambor virtual, en el que una rejilla vertical presentada en tres monitores de computadora se desplaza horizontalmente de manera oscilatoria o unidireccional a una velocidad constante. Con este sistema de realidad virtual, podemos cambiar sistemáticamente parámetros visuales como la frecuencia espacial, la frecuencia temporal/oscilación, el contraste, la luminancia y la dirección de las rejillas, y cuantificar las curvas de sintonización de la selectividad de las características visuales. La videooculografía infrarroja de alta velocidad garantiza una medición precisa de la trayectoria de los movimientos oculares. Los ojos de ratones individuales se calibran para brindar oportunidades para comparar los OKR entre animales de diferentes edades, géneros y antecedentes genéticos. El poder cuantitativo de esta técnica le permite detectar cambios en el OKR cuando este comportamiento se adapta plásticamente debido al envejecimiento, la experiencia sensorial o el aprendizaje motor; Por lo tanto, hace que esta técnica sea una valiosa adición al repertorio de herramientas utilizadas para investigar la plasticidad de los comportamientos oculares.

En respuesta a los estímulos visuales del entorno, nuestros ojos se mueven para desplazar la mirada, estabilizar las imágenes de la retina, rastrear objetivos en movimiento o alinear las fóveas de dos ojos con objetivos situados a diferentes distancias del observador, que son vitales para una visión adecuada ^1,2. Las conductas oculomotoras han sido ampliamente utilizadas como modelos atractivos de integración sensoriomotora para comprender los circuitos neuronales en la salud y la enfermedad, al menos en parte debido a la simplicidad del sistema oculomotor³. Controlado por tres pares de músculos extraoculares, el ojo rota en la cavidad principalmente alrededor de tres ejes correspondientes: elevación y depresión a lo largo del eje transversal, aducción y abducción a lo largo del eje vertical, e intorsión y extorsión a lo largo del eje anteroposterior ^1,2. Un sistema tan simple permite a los investigadores evaluar los comportamientos oculomotores de los ratones de manera fácil y precisa en un entorno de laboratorio.

Uno de los principales comportamientos oculomotores es el reflejo optocinético (OKR). Este movimiento ocular involuntario se desencadena por desplazamientos lentos o deslizamientos de imágenes en la retina y sirve para estabilizar las imágenes retinianas a medida que la cabeza de un animal o su entorno se mueven ^2,4. El OKR, como paradigma conductual, es interesante para los investigadores por varias razones. En primer lugar, puede ser estimulado de forma fiable y cuantificado con precisión ^5,6. En segundo lugar, los procedimientos para cuantificar este comportamiento son relativamente simples y estandarizados y pueden aplicarse para evaluar las funciones visuales de una gran cohorte de animales⁷. En tercer lugar, este comportamiento innato es altamente plástico ^5,8,9. Su amplitud puede ser potenciada cuando se producen deslizamientos repetitivos de la retina durante mucho tiempo ^5,8,9, o cuando su compañero de trabajo, el reflejo ocular vestibular (VOR), otro mecanismo de estabilización de las imágenes retinianas desencadenado por la entrada vestibular^2, se ve afectado⁵. Estos paradigmas experimentales de potenciación de OKR permiten a los investigadores desvelar la base del circuito que subyace al aprendizaje oculomotor.

En estudios previos se han utilizado principalmente dos métodos no invasivos para evaluar el OKR: (1) video-oculografía combinada con un tambor físico 7,10,11,12,13 o (2) determinación arbitraria de los giros de cabeza combinados con un tambor virtual^6,14,15,16. Aunque sus aplicaciones han hecho descubrimientos fructíferos en la comprensión de los mecanismos moleculares y de circuitos de la plasticidad oculomotora, estos dos métodos tienen algunos inconvenientes que limitan sus poderes para examinar cuantitativamente las propiedades del OKR. En primer lugar, los tambores físicos, con patrones impresos de rayas o puntos blancos y negros, no permiten cambios fáciles y rápidos de patrones visuales, lo que restringe en gran medida la medición de la dependencia del OKR de ciertas características visuales, como la frecuencia espacial, la dirección y el contraste de las rejillas móviles ^8,17. En cambio, las pruebas de la selectividad del OKR a estas características visuales pueden beneficiarse de la estimulación visual computarizada, en la que las características visuales pueden modificarse convenientemente de un ensayo a otro. De esta manera, los investigadores pueden examinar sistemáticamente el comportamiento de los OKR en el espacio de parámetros visuales multidimensionales. Además, el segundo método del ensayo OKR informa solo de los umbrales de los parámetros visuales que activan los OKR discernibles, pero no de las amplitudes de los movimientos oculares o de la cabeza 6,14,15,16. Por lo tanto, la falta de potencia cuantitativa impide analizar la forma de las curvas de sintonía y las características visuales preferidas, o detectar diferencias sutiles entre ratones individuales en condiciones normales y patológicas. Para superar las limitaciones anteriores, la video-oculografía y la estimulación visual virtual computarizada se combinaron para ensayar el comportamiento de OKR en estudios recientes 5,17,18,19,20. Sin embargo, estos estudios publicados anteriormente no proporcionaron suficientes detalles técnicos o instrucciones paso a paso y, en consecuencia, sigue siendo un desafío para los investigadores establecer una prueba de OKR de este tipo para su propia investigación.

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión la selectividad de las características visuales del comportamiento de OKR en condiciones fotópicas o escotópicas con la combinación de video-oculografía y estimulación visual virtual computarizada. Los ratones están fijados a la cabeza para evitar el movimiento ocular evocado por la estimulación vestibular. Se utiliza una cámara de alta velocidad para registrar los movimientos oculares de los ratones que observan rejillas en movimiento con parámetros visuales cambiantes. El tamaño físico de los globos oculares de ratones individuales se calibra para garantizar la precisión de la derivación del ángulo de los movimientos oculares²¹. Este método cuantitativo permite comparar el comportamiento de OKR entre animales de diferentes edades o antecedentes genéticos, o monitorizar su cambio causado por tratamientos farmacológicos o aprendizaje visomotor.

Todos los procedimientos experimentales realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Local de Cuidado de Animales de Ciencias Biológicas, de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Toronto y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.

1. Implantación de una barra de cabeza en la parte superior del cráneo

NOTA: Para evitar la contribución del comportamiento VOR a los movimientos oculares, la cabeza del ratón se inmoviliza durante la prueba OKR. Por lo tanto, se implanta quirúrgicamente una barra de cabeza en la parte superior del cráneo.

1. Anestesiar un ratón (hembra y macho de 2-5 meses de edad C57BL/6) mediante una mezcla de isoflurano (v/v) al 4% y_O2 en una cámara de gas. Transfiera el ratón a una plataforma quirúrgica personalizada y reduzca la concentración de isoflurano al 1,5%-2%. Controle la profundidad de la anestesia comprobando la respuesta al pellizco de los dedos de los pies y la frecuencia respiratoria durante toda la cirugía.
2. Coloque una almohadilla térmica debajo del cuerpo del animal para mantener su temperatura corporal. Aplique una capa de ungüento lubricante para los ojos en ambos ojos para protegerlos de la sequedad. Cubra los ojos con papel de aluminio para protegerlos de la iluminación ligera.
3. Por vía subcutánea, inyecte carprofeno a una dosis de 20 mg/kg para reducir el dolor. Después de humedecer el pelaje con un limpiador cutáneo de gluconato de clorhexidina, afeita el pelaje de la parte superior del cráneo. Desinfecte el cuero cabelludo expuesto con alcohol isopropílico al 70% y alcohol clorhexidina dos veces.
4. Inyecte bupivacaína (8 mg/kg) por vía subcutánea en el sitio de la incisión, luego retire el cuero cabelludo (~ 1 cm²) con unas tijeras para exponer la superficie dorsal del cráneo, incluido el hueso frontal posterior, el hueso parietal y el hueso interparietal.
5. Aplique varias gotas de lidocaína al 1% y epinefrina 1:100.000 sobre el cráneo expuesto para reducir el dolor local y el sangrado. Raspe el cráneo con una cureta Meyhoefer para quitar la fascia y límpielo con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   NOTA: El músculo temporal se separa del cráneo para aumentar el área de superficie para que se adhiera una barra de cabeza.
6. Seque el cráneo soplando suavemente aire comprimido hacia la superficie del cráneo hasta que la humedad desaparezca y el hueso se vuelva blanquecino. Aplique una capa delgada de superpegamento en la superficie expuesta del cráneo, incluido el borde del cuero cabelludo cortado, seguido de una capa de resina acrílica.
   NOTA: La superficie del cráneo debe estar libre de sangre o agua antes de la aplicación de superpegamento.
7. Coloque una barra de acero inoxidable para la cabeza (véase la figura 1A) a lo largo de la línea media en la parte superior del cráneo. Aplique más resina acrílica, comenzando desde el borde de la barra de la cabeza hasta que la base de la barra de la cabeza esté completamente incrustada en la resina acrílica. Aplica resina acrílica dos o tres veces para aumentar el grosor.
8. Espere unos 15 minutos hasta que la resina acrílica se endurezca. Por vía subcutánea, inyecte 1 ml de solución de ringer lactato. Luego, regrese el ratón a una jaula colocada en una almohadilla térmica hasta que el animal esté completamente móvil.
9. Deje que el ratón se recupere en la jaula doméstica durante al menos 5 días después de la cirugía. Una vez que el animal esté en buena forma, fije su cabeza con la barra de cabeza en la configuración OKR durante 15-30 minutos para familiarizarlo con la fijación de la cabeza y el entorno experimental. Repita la familiarización una vez al día durante al menos 3 días.

2. Configuración del tambor virtual y video-oculografía

1. Monte tres monitores ortogonalmente entre sí para formar un recinto cuadrado que cubra ~270° del acimut y 63° de la elevación en el espacio visual (Figura 1B izquierda).
2. Con una tarjeta gráfica discreta, combine los tres monitores en una pantalla simple para garantizar la sincronización en todos los monitores.
3. Calibre la luminancia de los monitores como se describe a continuación.
   1. Encienda el ordenador al que están conectados los monitores y espere 15 min. El calentamiento es esencial para tener una luminancia estable.
   2. Cambie sistemáticamente el ajuste de brillo del monitor de 0 a 100 mediante pasos de 25.
   3. Para cada valor de brillo, mida la luminancia de los monitores bajo varios valores de píxel (0-255, pasos de 15) con un medidor de luminancia.
   4. Ajuste la relación entre la luminancia y el brillo para el valor de píxel 255 con regresión lineal y estime el valor de brillo que da lugar a 160 cd/m².
   5. Para cada valor de píxel utilizado en la medición de la luminancia (paso 2.3.3), estime la luminancia para el valor de brillo derivado en el paso 2.3.4 basándose en la regresión lineal. Utilice la función de potencia lum = A * pixel γ para ajustar la relación entre el nuevo conjunto de valores de luminancia (bajo el valor de brillo derivado en 2.3.4) y sus correspondientes valores de píxel para derivar el factor gamma ^γy el coeficiente A. Estos se utilizarán para generar rejillas sinusoidales de los valores de luminancia deseados.
   6. Ajuste el brillo de los tres monitores a los valores derivados en el paso 2.3.4 para asegurarse de que sus valores de luminancia sean los mismos para el mismo valor de píxel.
4. Genere un tambor virtual, que se utiliza para estimular el comportamiento de OKR, con el kit de herramientas de estimulación visual, como se describe a continuación.
   1. Presentar una rejilla sinusoidal vertical en los monitores y ajustar el período (espaciado entre rayas) a lo largo del acimut para garantizar que la proyección de la rejilla en el ojo tenga una frecuencia espacial constante (rejilla de tambor; Figura 1B en el centro y a la derecha).
   2. Asegúrese de que la cabeza del animal fijada en el centro del recinto para que vea la rejilla tenga una frecuencia espacial constante en toda la superficie del tambor virtual.
   3. Modifique los parámetros de la rejilla en movimiento, como la amplitud oscilatoria, la frecuencia espacial, la frecuencia temporal/oscilación, la dirección, el contraste, etc., en los códigos de estimulación visual. Utilice dos tipos de movimiento visual: (1) la rejilla se desplaza en el sentido de las agujas del reloj o en sentido contrario a las agujas del reloj de manera oscilatoria siguiendo una función sinusoidal:
      
      Aquí, Amp es la amplitud de la trayectoria del tambor, f es la frecuencia de oscilación y t es el tiempo (amplitud de oscilación: 5°; frecuencia espacial de la rejilla: 0,04-0,45 cpd; frecuencia de oscilación: 0,1-0,8 Hz, correspondiente a una velocidad máxima del estímulo de 3,14-25,12 °/s [velocidad del tambor = Amp x 2π x f x cos (2π x f x t); contraste: 80%-100%; luminancia media: 35-45 cd/m²; (2) la rejilla se desplaza unidireccionalmente a una velocidad constante:
      
      (Frecuencia espacial: 0,04-0,64 cpd; frecuencia temporal: 0,25-1 Hz; velocidad del tambor = frecuencia temporal/frecuencia espacial).
5. Configure la video-oculografía como se describe a continuación.
   1. Para evitar el bloqueo del campo visual del animal, coloque un espejo infrarrojo (IR) a 60° de la línea media para formar una imagen del ojo derecho.
   2. Coloque una cámara infrarroja en el lado derecho detrás del mouse (Figura 1C izquierda) para capturar una imagen del ojo derecho.
   3. Monte la cámara infrarroja de alta velocidad en un brazo de cámara que permita que la cámara gire ± 10° alrededor de la imagen del ojo derecho (Figura 1C derecha).
   4. Utilice un fotodiodo conectado a uno de los monitores para proporcionar una señal eléctrica para sincronizar la sincronización de la videooculografía y la estimulación visual.
   5. Coloque cuatro diodos emisores de luz IR (LED) sostenidos por brazos de cuello de cisne alrededor del ojo derecho para proporcionar iluminación IR del ojo.
   6. Coloque dos LED IR en la cámara para proporcionar referencias de reflexión corneal (CR): uno está fijo sobre la cámara (X-CR), mientras que el otro está en el lado izquierdo de la cámara (Y-CR; Figura 1D).
   7. Mida el aumento óptico del sistema de video-oculografía con un portaobjetos de calibración.
      NOTA: Los CR de referencia se utilizan para cancelar los movimientos oculares de traslación cuando el ángulo ocular se calcula en función de los movimientos oculares de rotación.
6. Fije la cabeza del animal en el centro del recinto formado por los monitores, como se describe a continuación.
   1. Fija la cabeza del animal con la placa de la cabeza en el centro del aparejo y haz que mire hacia adelante. Ajuste la inclinación de la cabeza de modo que los ojos izquierdo y derecho estén nivelados, y las esquinas nasales y temporales de los ojos estén alineadas horizontalmente (Figura 1E).
   2. Mueva la cabeza del animal horizontalmente mediante el ajuste grueso proporcionado por el aparato de fijación de la cabeza y el ajuste fino proporcionado por una etapa de traslación 2D, y verticalmente a través del aparato de fijación de la cabeza y un par de soporte de poste/poste, hasta que el ojo derecho del animal aparezca en el video en vivo de la cámara. Antes de la calibración y medición de los movimientos oculares, superponga la imagen del ojo derecho del animal reflejada por el espejo caliente con el punto de pivote del brazo de la cámara (consulte los detalles en el paso 3.4 a continuación).
7. Construya un recinto personalizado alrededor de la plataforma OKR para bloquear la luz de la habitación (Figura 1F).

3. Calibración de los movimientos oculares

NOTA: Los movimientos oculares rotacionales se calculan en función de los movimientos de la pupila y el radio de la órbita de los movimientos pupilares (R_p, la distancia desde el centro de la pupila hasta el centro del globo ocular). Para cada ratón individual, este radio se mide experimentalmente²¹.

1. Fije la cabeza del animal en el centro del recinto formado por los tres monitores, como se describe en el paso 2.6.1.
2. Encienda la cámara y ajuste los cuatro LED que rodean el ojo derecho para lograr una iluminación IR uniforme.
3. Bajo guía visual, ajuste la posición del ojo derecho hasta que aparezca en el centro del video, como se describe en el paso 2.6.2.
4. Alinee la imagen virtual del ojo derecho con el punto de pivote del brazo de la cámara, como se describe a continuación.
   1. Gire manualmente el brazo de la cámara hacia el extremo izquierdo (-10°). Mueva manualmente la posición del ojo derecho del animal en el plano horizontal perpendicular al eje óptico con un ajuste fino de la etapa de traslación 2D (Figura 1C, flecha verde), hasta que el X-CR esté en el centro horizontal de la imagen.
   2. Gire manualmente el brazo de la cámara hasta el otro extremo (+10°). Si el X-CR se aleja del centro de la imagen, mueva el ojo derecho a lo largo del eje óptico con un ajuste fino hasta que el X-CR llegue al centro (Figura 1C, flecha azul).
   3. Repita los pasos 3.4.1-3.4.2 varias veces hasta que la X-CR permanezca en el centro cuando el brazo de la cámara se balancee hacia la izquierda y hacia la derecha. Si el ojo derecho se mueve en medio de una repetición, reinicia el proceso de ajuste.
5. Mida la distancia vertical entre el Y-CR y el X-CR después de bloquear el brazo de la cámara en la posición central. Encienda el LED Y-CR y grabe su posición en el video, y luego cambie al LED X-CR y grabe su posición.
   NOTA: La distancia vertical entre el Y-CR y el X-CR se utilizará para derivar la posición del Y-CR durante la medición de los movimientos oculares en los que solo se enciende el LED X-CR.
6. Mida el radio de rotación de la pupila R_p, como se describe a continuación.
   1. Gire el brazo de la cámara hacia el extremo izquierdo (-10°) y grabe las posiciones de la pupila (P_p1) y X-CR (P_CR1) en el vídeo.
   2. A continuación, gire el brazo de la cámara hacia el extremo derecho (+10°) y grabe las posiciones de la pupila (P_p2) y X-CR (P_CR2) en el vídeo. Repita este paso varias veces.
      NOTA: El ojo derecho del animal debe permanecer inmóvil durante cada repetición para que la cantidad de movimientos de la pupila en la película refleje con precisión el grado de balanceo del brazo de la cámara.
   3. Con base en los valores registrados anteriormente, calcule el radio de rotación de la pupila R_p (Figura 2A) con la siguiente fórmula:
      
      NOTA: La distancia entre el reflejo corneal y el centro de la pupila en el espacio físico se calcula en función de su distancia en la película:
      P_CR - P_p = número de píxeles de la película x tamaño de píxel del chip de la cámara x aumento
7. Desarrollar la relación entre R_p y el diámetro de la pupila, como se describe a continuación. R_p cambia cuando la pupila se dilata o se contrae; aproximadamente, su valor es inversamente proporcional al tamaño de la pupila (Figura 2B arriba).
   1. Cambie la luminancia de los monitores sistemáticamente de 0 a 160 cd/^m2 para regular el tamaño de la pupila.
   2. Para cada valor de luminancia, repita el paso 3.6 8-10 veces y registre el diámetro de la pupila.
   3. Aplique la regresión lineal a la relación entre R_p y el diámetro de la pupila en función de los valores medidos anteriormente para derivar la pendiente y la intersección (Figura 2B abajo).
      NOTA: Los valores atípicos causados por movimientos oculares ocasionales se eliminan antes del ajuste lineal. En el caso de mediciones repetitivas en varias sesiones, la calibración debe realizarse solo una vez para un animal, a menos que su ojo crezca durante el experimento.

4. Registra los movimientos oculares del OKR

1. Fije la cabeza de un mouse en la plataforma siguiendo los pasos 3.1-3.4. Omita este paso si la grabación se produce justo después de que se realice la calibración. Bloquee el brazo de la cámara en la posición central.
2. Configure los monitores y el animal para OKR escotópico como se describe a continuación. Omita este paso para el OKR fotópico.
   1. Cubra la pantalla de cada monitor con un filtro personalizado, que está hecho de cinco capas de película de densidad neutra (ND) de 1,2. Asegúrese de que no se filtre luz a través del espacio entre el filtro y el monitor.
   2. Apague la luz de la habitación. Los siguientes pasos se realizan con la ayuda de unas gafas de infrarrojos.
   3. Aplicar una gota de solución de pilocarpina (2% en solución salina) en el ojo derecho y esperar 15 min. Asegúrese de que la gota permanezca en el ojo y no sea limpiada por el mouse. Si el animal limpia la solución, aplique otra gota de solución de pilocarpina. Esto reduce la pupila a un tamaño adecuado para el seguimiento ocular en condiciones escotópicas.
      NOTA: Bajo la condición escotópica, la pupila se dilata sustancialmente de modo que su borde queda parcialmente oculto detrás del párpado. Esto afecta a la precisión de la estimación del centro de la pupila mediante video-oculografía. El encogimiento farmacológico de la pupila del ojo derecho disminuye su entrada visual y, por lo tanto, los estímulos visuales se presentan al ojo izquierdo.
   4. Enjuague el ojo derecho con solución salina para eliminar completamente la solución de pilocarpina. Baje la cortina para sellar completamente el recinto, lo que evita que la luz parásita interfiera con la visión escotópica.
   5. Dale al animal 5 minutos para que se adapte completamente al entorno escotópico antes de comenzar la prueba OKR.
3. Ejecute el software de estimulación visual y el software de seguimiento ocular. Para la medición de OKR fotópicos, asegúrese de que la rejilla del tambor oscile horizontalmente con una trayectoria sinusoidal; para la medición escotópica de OKR, asegúrese de que la rejilla del tambor se desplace a una velocidad constante de izquierda a derecha, que es la dirección temporonasal en referencia al ojo izquierdo.
   NOTA: Cuando la pupila del ojo derecho, pero no del ojo izquierdo, es encogida por la pilocarpina en la condición escotópica, el OKR provocado por la estimulación oscilatoria del tambor es altamente asimétrico. Por lo tanto, para la medición escotópica de OKR, se estimula el ojo izquierdo mientras se monitorea el movimiento del ojo derecho.
4. El software de seguimiento ocular mide automáticamente el tamaño de la pupila, la posición de la RC y la posición de la pupila para cada fotograma, y calcula el ángulo de la posición de los ojos en función de la siguiente fórmula (Figura 2C):
   
   Aquí, P_CR es la posición de la RC, P p es la posición de la pupila y R_p es el radio de rotación de la pupila. La distancia entre la reflexión corneal y el centro de la pupila en el espacio físico se calcula en función de su distancia en la película:
   P_CR - P_p = número de píxeles de la película x tamaño de píxel del chip de la cámara x aumento
   R_p del tamaño de pupila correspondiente se obtiene sobre la base del modelo de regresión lineal del paso 3.7.3 (Figura 2B abajo).

5. Análisis de los movimientos oculares del OKR con el software de análisis ocular

1. Procese los trazos oculares utilizando un filtro mediano (ventana de filtro = 0,05 s) para eliminar el ruido de alta frecuencia (Figura 3A en el centro).
2. Retire las sacadas o el nistagmo como se describe a continuación.
   1. Calcule la velocidad ocular calculando la derivada de primer orden de los movimientos oculares (Figura 3A abajo). Identifique los movimientos sacádicos o nistagmo aplicando un umbral de velocidad de 50 °/s (Figura 3A abajo).
   2. Reemplace los movimientos sacádicos o nistagmo extrapolando las posiciones de los ojos durante estos movimientos oculares rápidos desde el segmento anterior a los movimientos sacádicos o nistagmo basado en la regresión lineal (Figura 3B).
3. Calcule la amplitud de los movimientos oculares OKR mediante la transformada rápida de Fourier (algoritmo de Goertzel) si la rejilla del tambor oscila (Figura 3C), o calcule la velocidad media de los movimientos oculares durante la estimulación visual si la rejilla del tambor se mueve a una velocidad constante en una dirección (Figura 3B abajo).
   NOTA: La amplitud de los movimientos oculares oscilatorios derivados de la transformada de Fourier es similar a la amplitud derivada del ajuste de la trayectoria ocular con una función sinusoidal (Figura 3D).
4. Calcule la ganancia de OKR. Para el movimiento oscilatorio del tambor, la ganancia OKR se define como la relación entre la amplitud de los movimientos oculares y la amplitud de los movimientos del tambor (Figura 3C derecha). Para el movimiento unidireccional del tambor, la ganancia OKR se define como la relación entre la velocidad del ojo y la velocidad de la rejilla del tambor (Figura 3B abajo).

Con el procedimiento detallado anteriormente, evaluamos la dependencia del OKR de varias características visuales. Los seguimientos de ejemplo que se muestran aquí se derivaron utilizando los códigos de análisis proporcionados en el archivo de codificación suplementario 1, y el archivo sin procesar de seguimiento de ejemplo se puede encontrar en el archivo de codificación suplementaria 2. Cuando la rejilla del tambor se desvió en una trayectoria sinusoidal (0,4 Hz), el ojo del animal siguió automáticamente el movimiento de la rejilla de una manera oscilatoria similar (panel superior de la Figura 3B), que es característica del comportamiento OKR 2,5,8. La amplitud de los movimientos oculares OKR en el eje horizontal se obtuvo con la transformada rápida de Fourier (Figura 3C y D), y la ganancia OKR se calculó como la relación entre la amplitud de los movimientos oculares y la amplitud del movimiento de la rejilla (Figura 3C). La ganancia de OKR varió con los valores de la frecuencia espacial, la frecuencia de oscilación y la dirección de la rejilla de movimiento (Figura 4A). En primer lugar, la curva de ajuste de frecuencia espacial del comportamiento de OKR tenía una forma de V invertida y alcanzaba un pico a una frecuencia espacial intermedia de 0,16 cpd (Figura 4A izquierda). En segundo lugar, la curva de sintonización de la frecuencia de oscilación disminuyó monótonamente a medida que aumentaba la frecuencia de oscilación de la rejilla del tambor (Figura 4A en el centro), lo que indica que el comportamiento de OKR funciona mejor en respuesta al movimiento visual de baja velocidad⁴. Tanto la amplitud como la forma de la curva de sintonización de la frecuencia de oscilación variaron cuando se presentaron rejillas de diferentes frecuencias espaciales¹⁷. En tercer lugar, el OKR horizontal también podría ser inducido por rejillas que se mueven en diferentes direcciones (Figura 4A derecha). El comportamiento horizontal más fuerte de OKR fue provocado por el movimiento temporo-nasal (0°). La ganancia de OKR se redujo a ~ 80%, o ~ 30% del máximo, cuando la rejilla se movió en ángulos oblicuos de 30 ° o 60 ° desviándose de la dirección temporo-nasal (tanto hacia arriba como hacia abajo), respectivamente, y el OKR horizontal desapareció cuando la rejilla se movió verticalmente hacia arriba o hacia abajo (90 ° y 270 °). Además, las formas de las curvas de sintonía estaban influenciadas por el nivel de luminancia. Por ejemplo, los animales realizaron bien el comportamiento de OKR en respuesta a frecuencias espaciales de 0,16 y 0,32 cpd en la condición fotópica, pero la curva de ajuste de frecuencia espacial se desplazó hacia la izquierda en la condición escotópica (Figura 4B). Para analizar la forma de las curvas de afinación, las ajustamos con funciones matemáticas apropiadas. Por ejemplo, se utilizó la función gaussiana para estimar el pico y el ancho de banda de la sintonización de frecuencia espacial (Figura 4C). Con este análisis, encontramos que la curva de sintonía bajo la condición escotópica tenía un valor más bajo en la frecuencia espacial preferida en comparación con la condición fotópica. El procedimiento detallado anteriormente también se puede utilizar para cuantificar la plasticidad del comportamiento de los OKR. Después de 45 minutos de estimulación continua de OKR, la amplitud del comportamiento de OKR se potenció significativamente (Figura 4D), de acuerdo con informes anteriores. Estos resultados demuestran las aplicaciones de este protocolo en el examen de las conductas oculomotoras y los potenciales en la comprensión de los circuitos cerebrales implicados en estas conductas.

Figura 1: Configuración del equipo OKR . (A) Dimensiones de la barra de cabeza. (B) Vista trasera (izquierda) y vista superior (centro) del sistema de percusión virtual. Tres monitores están montados ortogonalmente entre sí. La cabeza de un ratón se coloca en el centro del recinto cuadrado y mira hacia adelante. El período de estimulación visual (espacio entre rayas) se varía en función del azimut al ojo del animal para garantizar que la proyección de la rejilla sobre el ojo tenga una frecuencia espacial constante. En otras palabras, la frecuencia espacial de la rejilla se percibe como constante en todo el campo visual, como si la rejilla se desplazara a lo largo de la superficie de un tambor virtual (derecha). (C) Configuración de video-oculografía IR. Izquierda: la posición de la cámara cuando se fija en el centro durante la grabación OKR. Flecha azul: a lo largo del eje óptico. Flecha verde: perpendicular al eje óptico. Derecha: la rotación de la cámara durante la calibración del ojo. (D) Posición de los LED X-CR e Y-CR fijados en la cámara. (E) Los niveles de los ojos izquierdo y derecho (izquierda), y las esquinas nasal y temporal de los ojos se alinean horizontalmente (derecha) girando la varilla horizontal o el adaptador de la placa de la cabeza, respectivamente (flechas rojas). (F) Foto de la estación OKR. Tenga en cuenta que el equipo OKR se coloca dentro de un recinto personalizado con una cortina negra. Abreviaturas: IR = infrarrojo; RC = reflexión corneal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Calibración y medición de las posiciones oculares en video-oculografía . (A) Esquema de la calibración. El radio de rotación de la pupila (R_p) se calcula girando la cámara a la posición más a la izquierda (-10°, panel izquierdo) y a la posición más a la derecha (10°, panel derecho). Los puntos rojos indican las posiciones de reflexión corneal X-CR cuando la cámara se coloca en las posiciones más a la izquierda y a la derecha. Los puntos azules indican el centro de las pupilas. Las barras verdes indican las distancias entre el reflejo de la córnea y el centro de la pupila que se ve en el vídeo de la cámara (P_CR - P_P). (B) Dependencia de R_p en el tamaño de la pupila. Arriba: esquemas de globos oculares con pupila pequeña o grande. Abajo: relación entre R_p y el diámetro de la pupila de un ratón de ejemplo. El tamaño de la pupila se cambia variando la luminancia (10 valores en el rango de 0-160 cd/m²) al ratón. Puntos negros: los datos que se utilizan para el ajuste lineal. Puntos azules: valores atípicos que se excluyen del ajuste lineal. Curva roja: la línea de mejor ajuste en la regresión lineal. Obsérvese que el R_p es inversamente proporcional al diámetro de la pupila. (C) Cálculo del ángulo de posición del ojo cuando el ojo se ha movido hacia el lado derecho o izquierdo del eje óptico. Los puntos rojos, los puntos azules y las barras verdes tienen el mismo significado que en A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Cálculo de la ganancia de OKR. (A) Arriba: instantáneas de las posiciones nasales (N; izquierda) y temporales (T; derecha) de los ojos tomadas durante la estimulación OKR. Elipses rojas: se ajustan al perfil de la pupila. Cruces rojas: centros de alumnos. Flechas blancas: reflexión corneal de un LED de referencia. Medio: las trayectorias de los movimientos oculares con (negro) o sin (rojo) un filtro mediano (ventana de filtro = 0,05 s) para eliminar el ruido de alta frecuencia. Abajo: estimación de la velocidad ocular mediante el cálculo de la derivada de primer orden de los movimientos oculares. Las sacadas (flechas rojas) se detectan con un umbral de velocidad de 50 °/s. (B) La trayectoria de los movimientos oculares lentos del OKR después de eliminar los movimientos sacádicos/nistagmo (negro) superpuestos con la trayectoria del tambor²². Arriba: movimiento oscilatorio del tambor con una amplitud de 5° y una frecuencia de oscilación de 0,4 Hz. Abajo: movimiento unidireccional (temporo-nasal) del tambor con una velocidad constante de 6,25 °/s. (C) Izquierda: el ciclo-promedio de la trayectoria del ojo en B arriba. Derecha: el análisis de frecuencia de los movimientos de la rejilla del ojo o del tambor mediante la transformada rápida de Fourier. Cabe señalar que la rejilla del tambor oscila a 0,4 Hz y, por lo tanto, las amplitudes del movimiento de la rejilla del ojo y del tambor alcanzan su punto máximo a 0,4 Hz (marcas de estrella). La ganancia OKR es la relación entre las amplitudes del movimiento del ojo y de la rejilla del tambor a 0,4 Hz. (D) Top: ajuste curvo de la trayectoria del ojo en B top con función sinusoidal. Abajo: relación de la amplitud de los movimientos oculares derivada por el método de la transformada rápida de Fourier y derivada del ajuste de la curva sinusoidal. Punto amarillo: ejemplo en la parte superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Selectividad de las características visuales y plasticidad de los comportamientos de los OKR. (A) La selectividad de las características visuales de la ganancia de OKR en la condición fotópica. Izquierda: curva de sintonización de frecuencia espacial de un animal (frecuencia de oscilación: 0,4 Hz; trayectoria: oscilante horizontalmente; luminancia media: 40 cd/m²; n = 15). Medio: curva de sintonización de la frecuencia de oscilación de un animal (frecuencia espacial: 0,08 o 0,16 cpd; trayectoria: oscilante horizontalmente; luminancia media: 40 cd/m²; n = 15). Derecha: curva de sintonización de dirección de un animal (frecuencia espacial: 0,16 cpd; frecuencia temporal: 1 Hz; luminancia media: 45 cd/m²; n = 24). La flecha y la barra rojas indican la dirección temporo-nasal. Para la sintonización de frecuencia espacial y temporal/oscilación, una rejilla de tambor vertical presentada en tres monitores se mueve horizontalmente a una velocidad constante o de manera oscilatoria. Para el ajuste de dirección, una rejilla presentada solo en el monitor derecho se mueve en una de las 12 direcciones a una velocidad constante. Espesor: error estándar de la media (SEM). (B) Curva de sintonización de frecuencia espacial de la ganancia OKR de un animal en la condición escotópica o fotópica. Fotópico: movimiento oscilatorio; frecuencia de oscilación: 0,2 Hz; luminancia media: 40 cd/m²; n = 15. Escotópico: movimiento lineal con una velocidad constante; frecuencia temporal: 0,25 Hz; luminancia media: 8 x ^10-5 cd/m²; n = 16. La condición escotópica se logra cubriendo los monitores con cinco capas de filtro Lee (299 1.2 ND). Espesor: SEM. (C) Ajuste gaussiano de la sintonización de frecuencia espacial de la ganancia OKR en condiciones fotópicas y escotópicas. Fotópico: movimiento oscilatorio; frecuencia de oscilación: 0,2 Hz; luminancia media: 40 cd/m²; n = 15. Escotópico: movimiento lineal con una velocidad constante; frecuencia temporal: 0,25 Hz; luminancia media: 8 x ^10-5 cd/m²; n = 16. (D) Potenciación de OKR de un ratón inducida por 45 min de estimulación continua de OKR. Frecuencia espacial: 0,1 cpd; frecuencia de oscilación: 0,4 Hz; luminancia media: 35 cd/m²; n = 40. Arriba: ciclo promediado de trayectorias de OKR antes y después de la potenciación de OKR. Grosor: SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo de codificación suplementario 1: Código de análisis utilizado para generar las trazas de ejemplo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 2: Ejemplos de trazas generadas con el software. Haga clic aquí para descargar este archivo.

El método del ensayo de comportamiento OKR que se presenta aquí ofrece varias ventajas. En primer lugar, la estimulación visual generada por ordenador resuelve los problemas intrínsecos de los tambores físicos. Teniendo en cuenta el problema de que los tambores físicos no admiten el examen sistemático de la frecuencia espacial, la dirección o la sintonización del contraste⁸, el tambor virtual permite cambiar estos parámetros visuales ensayo por ensayo, lo que facilita un análisis sistemático y cuantitativo de la selectividad de características del comportamiento de los OKR (Figura 4A); Mientras que los tambores físicos sufren de una iluminación no uniforme por una fuente de luz externa²³, el tambor virtual puede proporcionar fácilmente una luminancia homogénea en toda su superficie; con la ayuda de filtros ND y un medidor de luminancia, la estimulación visual generada por computadora permite la medición de OKR en varios niveles de luminancia bien controlados, desde escotópicos hasta fotópicos (Figura 4B), lo que es difícil de hacer con tambores físicos. Sin la limitación en la aceleración de los tambores físicos debido a su masa inercial, la estimulación visual virtual puede lograr trayectorias idealmente precisas, especialmente a alta aceleración y alta velocidad. Además, la estimulación visual generada por ordenador permite el diseño creativo de otros tipos de estimulación visual, como los puntos que se mueven coherentemente, lo que ayuda a investigar los mecanismos de diversas conductas oculomotoras. En segundo lugar, nuestro procedimiento está estandarizado y, por lo tanto, requiere esfuerzos mínimos para monitorear el progreso del registro del comportamiento, lo que brinda la oportunidad de examinar varios ratones simultáneamente. Por lo tanto, es adecuado para estudios que involucran una gran cohorte de animales (decenas a cientos de animales). En tercer lugar, la alta precisión y el poder cuantitativo permiten comparar mediciones repetitivas de OKR de los mismos ratones en estudios longitudinales²⁴, bajo diferentes tratamientos farmacológicos¹⁰, o bajo perturbaciones del circuito neuronal⁵. Por último, el análisis basado en la transformada de Fourier en el dominio de la frecuencia 5,7,9 da resultados equivalentes en la amplitud de los movimientos oculares oscilatorios al análisis basado en el ajuste en el dominio temporal 12,25,26 (Figura 3D inferior), lo que demuestra que el método de análisis presentado aquí es exacto y preciso.

Nuestro método también brinda la oportunidad de estudiar la plasticidad de los OKR, un paradigma muy utilizado para investigar los mecanismos del aprendizaje oculomotor. Cuando se presenta estimulación continua de OKR a un ratón o se lesiona quirúrgicamente su órgano vestibular, se puede potenciar la amplitud de la OKR ^8,9. El ensayo OKR presentado aquí es lo suficientemente sensible como para capturar pequeños cambios en los movimientos oculares que ocurren en la potenciación de OKR (Figura 4D). El poder cuantitativo de este método permite correlacionar los cambios de comportamiento con la dinámica de los circuitos neuronales, lo cual es esencial para revelar los mecanismos que subyacen al aprendizaje oculomotor 5,8,9,13.

Para garantizar la precisión de la medición de OKR, hay algunos pasos críticos. En primer lugar, durante la cirugía, se necesita un cuidado especial para evitar que el superpegamento y el acrílico dental toquen el párpado, lo que puede dañar la córnea u ocluir parcialmente la abertura del ojo. En segundo lugar, la fuerza del OKR se ve afectada por el estado de comportamiento de los ratones^27,28. Por lo tanto, se recomiendan algunas rondas de adaptación para minimizar el impacto del estrés en la medición de OKR; Además, se debe evitar la perturbación causada por olores, ruido o luz durante la grabación. Por último, las cabezas de los ratones deben estar orientadas correctamente para que la línea que conecta las dos esquinas de los ojos sea paralela al eje horizontal. Esto garantiza que la dirección del movimiento visual esté alineada con los movimientos oculares del eje de aducción y abducción. En tercer lugar, la iluminación uniforme del ojo es clave para generar una imagen nítida de la pupila y, a su vez, garantizar un seguimiento ocular de alta calidad.

Vale la pena señalar que existen algunas limitaciones de los métodos presentados aquí. En primer lugar, cuando el ojo de un animal parpadea o una secreción ocular opaca bloquea la pupila, la videooculografía pierde el rastro del ojo de forma momentánea o permanente. Del mismo modo, no se puede utilizar para controlar los movimientos oculares cuando se suturan los párpados. En segundo lugar, la resolución temporal de la videooculografía está limitada por la velocidad de fotogramas de las cámaras a un rango de 4-20 ms. Por último, la preparación fija a la cabeza no permite controlar los comportamientos oculares de los animales que se mueven libremente.

La video-oculografía y el tambor virtual aquí presentados se han aplicado con éxito para caracterizar la selectividad de las características visuales y la plasticidad del comportamiento de los OKR, y para comprender los circuitos retinianos y centrales implicados en la mediación y modulación adaptativa de este comportamiento. Además, también pueden beneficiar a los estudios en los que otros comportamientos oculares son los temas o incluso los factores de confusión de los fenómenos neuronales. Por ejemplo, la video-oculografía se puede utilizar para monitorizar la dilatación de la pupila²⁹ y los movimientos oculares sacádicos 30,31, que son indicativos del estado de alerta y cerebral^32,33,34,35. Además, los procedimientos de calibración y medición descritos aquí son universalmente aplicables para monitorear los movimientos oculares con una cámara montada en la cabeza en ratones que se mueven libremente.

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Estamos agradecidos a Yingtian He por compartir datos de ajuste de dirección. Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Canadiense de Innovación y el Fondo de Investigación de Ontario (proyecto CFI/ORF n.º 37597), NSERC (RGPIN-2019-06479), CIHR (Project Grant 437007) y Connaught New Researcher Awards.