Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae dentro del tejido vegetal

El presente protocolo describe un método que permite el análisis de expresión génica unicelular en poblaciones de Pseudomonas syringae cultivadas dentro del apoplasto vegetal.

Una gran cantidad de microorganismos patógenos atacan constantemente a las plantas. El complejo de especies de Pseudomonas syringae engloba bacterias fitopatógenas gramnegativas de especial relevancia para un amplio número de hospedadores. P. syringae entra en la planta desde la superficie de la hoja y se multiplica rápidamente dentro del apoplasto, formando microcolonias que ocupan el espacio intercelular. La expresión constitutiva de proteínas fluorescentes por parte de las bacterias permite la visualización de las microcolonias y el seguimiento del desarrollo de la infección a nivel microscópico. Los avances recientes en el análisis de células individuales han revelado la gran complejidad alcanzada por las poblaciones bacterianas isogénicas clonales. Esta complejidad, conocida como heterogeneidad fenotípica, es la consecuencia de las diferencias de célula a célula en la expresión génica (no vinculadas a diferencias genéticas) entre la comunidad bacteriana. Para analizar la expresión de loci individuales a nivel de una sola célula, se han utilizado ampliamente fusiones transcripcionales a proteínas fluorescentes. Bajo condiciones de estrés, como las que ocurren durante la colonización del apoplasto de la planta, P. syringae se diferencia en distintas subpoblaciones basadas en la expresión heterogénea de genes clave de virulencia (es decir, el sistema de secreción Hrp tipo III). Sin embargo, el análisis unicelular de cualquier población dada de P. syringae recuperada del tejido vegetal es un desafío debido a los desechos celulares liberados durante la interrupción mecánica intrínseca a los procesos de inoculación y extracción bacteriana. En el presente informe se detalla un método elaborado para vigilar la expresión de los genes de P. syringae de interés a nivel unicelular durante la colonización de Arabidopsis y plantas de frijol. Se describe la preparación de las plantas y las suspensiones bacterianas utilizadas para la inoculación mediante una cámara de vacío. La recuperación de bacterias endófitas de hojas infectadas por extracción de fluido apoplástico también se explica aquí. Tanto la inoculación bacteriana como los métodos de extracción bacteriana están optimizados empíricamente para minimizar el daño de las células vegetales y bacterianas, lo que resulta en preparaciones bacterianas óptimas para el análisis de microscopía y citometría de flujo.

Las bacterias patógenas muestran diferencias en diversos fenotipos, dando lugar a la formación de subpoblaciones dentro de poblaciones genéticamente idénticas. Este fenómeno se conoce como heterogeneidad fenotípica y ha sido propuesto como una estrategia de adaptación durante las interacciones bacteriano-huésped¹. Los avances recientes en la resolución óptica de microscopios confocales, citometría de flujo y microfluídica, combinados con proteínas fluorescentes, han fomentado el análisis unicelular de poblaciones bacterianas².

La Pseudomonas syringae gramnegativa es una bacteria patógena vegetal arquetípica debido a su importancia académica y económica³. El ciclo de vida de P. syringae está ligado al ciclo del agua⁴. P. syringae entra en los espacios intercelulares entre las células mesófilas, el apoplasto de la hoja de la planta, a través de aberturas naturales como estomas o heridas⁵. Una vez dentro del apoplasto, P. syringae se basa en el sistema de secreción tipo III (T3SS) y los efectores translocados tipo III (T3E) para suprimir la inmunidad de la planta y manipular las funciones celulares de la planta en beneficio del patógeno⁶. La expresión de T3SS y T3E depende del regulador maestro HrpL, un factor sigma alternativo que se une a los motivos hrp-box en la región promotora de los genes diana⁷.

Al generar fusiones transcripcionales localizadas en cromosomas a genes de proteínas fluorescentes aguas abajo del gen de interés, se puede monitorear la expresión génica en función de los niveles de fluorescencia emitidos a nivel de una sola célula⁸. Utilizando este método, se ha establecido que la expresión de hrpL es heterogénea tanto dentro de cultivos bacterianos cultivados en el laboratorio como dentro de poblaciones bacterianas recuperadas de la planta apoplast ^8,9. Aunque el análisis de la expresión génica a nivel unicelular se realiza típicamente en cultivos bacterianos cultivados en medios de laboratorio, tales análisis también pueden llevarse a cabo en poblaciones bacterianas que crecen dentro de la planta, proporcionando así información valiosa sobre la formación de subpoblaciones en el contexto natural. Una limitación potencial para el análisis de poblaciones bacterianas extraídas de la planta es que los métodos clásicos de inoculación por infiltración de presión de jeringa en el apoplasto, seguidos de extracción bacteriana por maceración del tejido foliar, típicamente generan una gran cantidad de restos celulares de plantas que interfieren con el análisis aguas abajo¹⁰. La mayoría de los desechos celulares consisten en fragmentos autofluorescentes de cloroplastos que se superponen con la fluorescencia GFP, lo que resulta en resultados engañosos.

El presente protocolo describe el proceso de análisis de la heterogeneidad de la expresión génica unicelular en dos patosistemas modelo: el formado por P. syringae pv. cepa de tomate DC3000 y Arabidopsis thaliana (Col-0), y la otra por la P. syringae pv. phaseolicola cepa 1448A y plantas de frijol (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Se propone un método de inoculación basado en la infiltración al vacío utilizando una cámara de vacío y una bomba, lo que resulta en un método rápido y sin daños para infiltrar hojas enteras. Además, como mejora de los protocolos convencionales, se utiliza un método más suave para extraer la población bacteriana del apoplast que reduce significativamente la alteración tisular, basado en la extracción de líquido apoplástico mediante la aplicación de ciclos de presión positiva y negativa utilizando una pequeña cantidad de volumen dentro de una jeringa.

1. Preparación de la planta

1. Prepare las plantas de Arabidopsis Col-0 siguiendo los pasos a continuación.
   1. Llene una maceta de 10 cm de diámetro con una mezcla de sustrato de planta de vermiculita 1:3 (consulte la Tabla de materiales), previamente regada, y cubra la maceta con una malla metálica de 15 cm x 15 cm con agujeros de 1,6 mm x 1,6 mm. Ajuste la malla metálica al suelo húmedo con una banda elástica (Figura 1A).
   2. Con un palillo de dientes húmedo, siembre semillas de Arabidopsis en los agujeros de la malla metálica. Coloque de tres a cuatro semillas en posiciones distantes dentro de la maceta (Figura 1B, C).
   3. Cubra las macetas con una cúpula de plástico para mantener una humedad relativa alta e incube durante 72 h a 4 °C para su estratificación.
      NOTA: La estratificación (incubación a alta humedad y baja temperatura, como se describe) mejora la tasa de germinación y la sincronía de las semillas.
   4. Transfiera las macetas a una cámara de crecimiento vegetal en condiciones de días cortos (8 h de luz/16 h de oscuridad a 21 °C, intensidad de luz: 100 μmol·m−²·^s−1, humedad relativa: 70%).
   5. Después de la germinación de la semilla (8-10 días), use las pinzas para eliminar la mayoría de las plántulas, manteniendo una plántula en cada una de las posiciones de la maceta (seis plántulas/maceta) (Figura 1D). Retire la cúpula de plástico para destapar las macetas.
      NOTA: Las plantas estarán listas para usar 4-5 semanas después de la germinación.
2. Prepare plantas de frijol Phaseolus vulgaris (cultivar Canadian Wonder).
   1. Cubra el fondo de una placa de Petri con un pedazo de papel de toalla húmedo y coloque las semillas de frijol encima. Sellar la placa de Petri con cinta quirúrgica e incubar a 28 °C durante 3-4 días (Figura 2A).
   2. Transfiera las semillas germinadas a una maceta de 10 cm de diámetro llena de una mezcla húmeda de sustrato de planta de vermiculita 1: 3.
   3. Incubar en una cámara de crecimiento vegetal en condiciones de día largo (16 h de luz/8 h de oscuridad a 23 °C, intensidad de luz: 100 μmol·m−²·s⁻¹, humedad relativa: 70%).
      NOTA: Las plantas estarán listas para usar 10 días después de la germinación (Figura 2B).

2. Inoculación de Arabidopsis y plantas de frijol

NOTA: En este estudio, las cepas P. syringae pv. tomate DC3000 y P. syringae pv. se utilizó phaseolicola 1448A.

1. Preparar el inóculo de P. syringae.
   1. Rayar la cepa de P. syringae de interés de una cepa de glicerol de -80 °C en una placa LB (10 g/L triptona, 5 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levadura y 16 g/L de agar bacteriológico, ver Tabla de materiales) suplementada con los antibióticos apropiados. Incubar a 28 °C durante 40-48 h.
      NOTA: Se recomienda el uso de antibióticos si la cepa de interés porta un plásmido o un gen de resistencia genómica. Las concentraciones recomendadas de antibióticos para P. syringae son las siguientes: kanamicina (15 μg/ml), gentamicina (10 μg/ml), ampicilina (300 μg/ml) (ver tabla de materiales).
   2. Raspar la biomasa bacteriana y resuspender en 5 mL de 10 mM MgCl₂. Mida el OD₆₀₀ y ajuste a 0.1 agregando 10 mM MgCl₂.
      NOTA: Un OD₆₀₀ de 0,1 de un cultivo de P. syringae corresponde a 5 x 10⁷ UFC·mL⁻¹.
   3. Realizar diluciones seriadas en 10 mM de MgCl₂ para alcanzar una concentración final de inóculo de 5 x 10⁵ UFC·mL⁻¹. Preparar 200 mL de inóculo para las plantas de Arabidopsis y 50 mL para las plantas de frijol.
   4. Inmediatamente antes de la inoculación, agregue el surfactante Silwett L-77 (ver Tabla de materiales) a una concentración final de 0.02% para la inoculación de frijol y 0.01% para Arabidopsis. Tenga en cuenta que Silwett es algo perjudicial para el tejido de Arabidopsis.
2. Realizar infiltración de vacío.
   1. Para la infiltración de Arabidopsis, coloque dos palos de madera formando una X sobre la olla (Figura 1E) y coloque la olla boca abajo sobre una placa de Petri de 14 cm de diámetro que contenga el inóculo de 200 ml (Figura 1F).
   2. Para la inoculación de hojas de frijol, introducir la hoja en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml que contenga el inóculo (Figura 2C).
   3. Introducir las plantas sumergidas en la solución de inóculo en una cámara de vacío (Figura 1G y Figura 2D) y dar un pulso de 500 mbar durante 30 s para infiltrarse en las hojas. Repita el pulso de vacío 2-3 veces hasta que la hoja esté completamente infiltrada (Figura 1H y Figura 2E).
   4. Escurrir el exceso de solución de inóculo con un trozo de papel y devolver las plantas a su cámara de crecimiento correspondiente.

3. Extracción de bacterias del apoplast

1. Cuatro días después de la inoculación, cortar la parte aérea de la planta Arabidopsis o la hoja inoculada de la planta de frijol y colocarla en una jeringa de 20 ml sin aguja (Figura 2G). Para las hojas de frijol, enrolle la hoja sobre sí misma, dejando la cara abaxial hacia afuera, como se muestra en la Figura 2F.
2. Agregue suficiente volumen de agua destilada para cubrir el tejido (generalmente 10-15 ml).
3. Inserte el émbolo y, con la jeringa en posición vertical con la punta apuntando hacia arriba, retire el exceso de aire y las burbujas de aire dentro de la jeringa golpeando suavemente el barril hasta que todo el aire se encuentre cerca de la punta. Deslice entonces el émbolo para sacar el aire. Una vez que haya la menor cantidad de aire posible dentro de la jeringa, cubra la punta del cilindro de la jeringa con una película de parafina.
4. Presione con cuidado el émbolo para generar presión positiva hasta que el tejido se oscurezca (Figura 1I y Figura 2H). Luego, tire del émbolo para generar presión negativa (Figura 1J y Figura 2I). Repita este paso 3-5 veces.
5. Retire la película de parafina y el émbolo y recoja el líquido que contiene las bacterias extraídas con apoplastos, como se muestra en la Figura 2J.

4. Análisis unicelular de las bacterias extraídas con apoplastos

1. Visualice por microscopía confocal siguiendo los pasos a continuación.
   1. Prepare una solución de agarosa al 1,5% en agua destilada. Una vez fundido, agregue suficiente volumen para llenar el espacio entre dos portaobjetos de microscopía colocados uno al lado del otro y coloque otro portaobjetos encima sobre él (Figura 3). Déjelos secar durante 15 minutos y retire con cuidado el tobogán colocado en la parte superior. Con una cuchilla, corte la almohadilla de agarosa en trozos de 5 mm x 5 mm justo antes de usarla.
   2. Paralelamente, centrifugar 1 ml de las bacterias extraídas con apoplasto a 12.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente, retirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y resuspender el pellet en 20 μL de agua para concentrar las células. Coloque una gota de 2 μL de las células concentradas en un cubreobjetos de 0,17 mm y cubra la gota con una pieza de 5 mm x 5 mm de la almohadilla de agarosa obtenida previamente en el paso 1, como se representa en la Figura 3.
   3. Visualice la preparación bacteriana bajo el microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales). Para identificar bacterias verdes-fluorescentes, use el láser de excitación a 488 nm y un filtro de emisión que oscile entre 500 nm y 550 nm. Para identificar todas las bacterias, use el campo brillante y combine ambos campos.
   4. Procese las imágenes confocales utilizando Fiji (consulte la Tabla de materiales). Para hacer esto, use el complemento MicrobeJ para identificar el contorno de la célula bacteriana y medir la intensidad de fluorescencia en su interior.
      NOTA: Se recomienda la adquisición de imágenes de bacterias aisladas (no agrupadas) para este análisis.
2. Realizar análisis por citometría de flujo.
   1. Tome una alícuota de las suspensiones de bacterias extraídas con apoplastos para analizar utilizando el citómetro de flujo. Adquiere 100.000 eventos.
   2. Para discriminar entre bacterias y restos vegetales, analice el apoplast extraído de una planta no inoculada y compare el diagrama de puntos que muestra su tamaño de célula de dispersión directa (FSC) frente al tamaño de célula de dispersión lateral (SSC) con el de la suspensión bacteriana extraída de apoplastos. Para identificar bacterias no fluorescentes, utilice los apoplastos extraídos de las plantas inoculadas con bacterias isogénicas no fluorescentes y compare sus emisiones fluorescentes.

La expresión del sistema de secreción tipo III es esencial para el crecimiento bacteriano dentro de la planta. La expresión oportuna de los genes T3SS se logra a través de una regulación intrincada, en cuyo centro se encuentra el factor sigma HrpL de función extracitoplasmática (ECF), el activador clave de la expresión de genes relacionados con T3SS¹¹. Previamente se realizó un análisis de la expresión de hrpL utilizando una fusión transcripcional localizada en cromosomas a un gen gfp sin promotor aguas abajo y siguiendo los patrones de expresión por microscopía confocal y citometría de flujo⁹. Estas fusiones se generan a través de la integración homóloga mediada por recombinación de construcciones codificadas por plásmidos generadas a través de PCR y clonación tradicional y llevan los últimos 500 pares de bases del ORF del gen de interés (incluido el codón STOP) y 500 pares de bases de la secuencia inmediatamente aguas abajo, flanqueando el sitio de unión al ribosoma y el ORF del gen informador de fluorescencia que se utilizará (en este caso, GFP), seguido de un casete de resistencia a antibióticos (en este caso, el gen NPT2 que confiere resistencia a la kanamicina). Por lo tanto, se estableció que las poblaciones de P. syringae extraídas de apoplastos que expresan genes relacionados con T3SS, incluida hrpL, son heterogéneas en la planta⁹. En este precedente, los resultados representativos de la microscopía de fluorescencia confocal y el análisis de citometría de flujo de la expresión de hrpL se muestran en células bacterianas individuales de las cepas modelo Pph 1448A (Pph) y Pto DC3000 (Pto), extraídas de las hojas de frijol o Arabidopsis, respectivamente, después de la colonización del apoplasto de la hoja (Figura 4). En cada cepa, el gen hrpL cromosómico de P. syringae lleva una fusión transcripcional aguas abajo a un gen gfp sin promotor que permite monitorear la actividad promotora nativa de hrpL siguiendo los niveles de expresión de GFP ^8,9.

Las bacterias extraídas de apoplast se pueden utilizar para diferentes análisis. Aquí, 300 μL de las cepas bacterianas reporteras mencionadas anteriormente se extrajeron del apoplast de plantas infectadas de Arabidopsis o frijol y se utilizaron para la adquisición de datos utilizando un sistema de citómetro de flujo (ver Tabla de materiales). Se utilizó la emisión láser a 488 nm y el filtro FITC para la detección de GFP. El análisis de citometría de flujo muestra la distribución de fluorescencia en células bacterianas individuales dentro de la población. La expresión heterogénea de hrpL se puede observar claramente mediante citometría de flujo en Pto extraído por Arabidopsis apoplast y en Phh extraído con apoplasto de frijol, incluidas las bacterias HrpL^OFF (que no expresan GFP), y estos resultados están respaldados por el examen microscópico de las muestras correspondientes (Figura 4). Los gráficos de diagramas de puntos (paneles izquierdos) muestran la distribución de la intensidad de fluorescencia de GFP versus el tamaño celular en la población (Figura 4A), mientras que los histogramas muestran la intensidad de fluorescencia de GFP versus recuentos celulares (Figura 4B). Estas dos representaciones gráficas diferentes de los datos de citometría permiten al investigador establecer matices visuales sutiles y proporcionar información complementaria. Como control de la autofluorescencia bacteriana, se utilizó la cepa de tipo salvaje no GFP correspondiente (panel superior en la Figura 4A e histograma gris en la Figura 4B). Esto permite identificar el área del gráfico donde se muestran las bacterias no GFP dentro de la población. Los análisis de citometría de flujo también generan datos cuantitativos. Como ejemplo, los porcentajes de células HrpL^ON (fluorescentes) se extraen en poblaciones de Pto y Pph extraídas con apoplastos. La Figura 4C muestra cómo los porcentajes de HrpL^ON fueron más altos que los porcentajes correspondientes de células HrpL^OFF (no fluorescentes) en estas poblaciones, particularmente en el modelo Pto. Estos datos también se pueden utilizar para calcular la fluorescencia media o mediana para toda la población. En este experimento en particular, se obtuvo la intensidad promedio de fluorescencia de GFP, que fue mayor para la población de Pto que para Pph, de acuerdo con su mayor porcentaje de células ON. Los niveles medios constituyen datos a nivel poblacional comparables a los datos obtenidos mediante técnicas de células distintas como la PCR RT-qo el RNAseq. Finalmente, también se muestra el coeficiente robusto de variación (RCV)¹², calculado como el tercer cuartil menos el primer cuartil dividido por la mediana. La VCR se utiliza a menudo en estudios de citometría de flujo para estimar la dispersión de datos (es decir, la heterogeneidad de la expresión dentro de la población)¹³. En el presente estudio, el RCV fue ligeramente mayor para Pph que para Pto, aunque la diferencia no fue suficiente para caracterizar la distribución de la expresión dentro de las poblaciones de estas dos cepas como significativamente diferente. La heterogeneidad de la expresión de hrpL se puede confirmar visualmente con las imágenes de microscopía confocal (Figura 4D). El uso de almohadillas de agar para la preparación de microscopía da como resultado una visualización más fácil e imágenes de mayor calidad de las células individuales, ya que empuja a las bacterias a una sola capa y evita el movimiento bacteriano. Los procedimientos de inoculación y extracción bacteriana descritos en este protocolo minimizan la cantidad de restos vegetales dentro de la preparación bacteriana, permitiendo así el análisis de la expresión bacteriana mediante estas diferentes técnicas (Figura 4).

Figura 1: Inoculación bacteriana y extracción de apoplast utilizando plantas de Arabidopsis. (A) Preparación de la olla con la malla metálica correctamente fijada. (B) Sembrar semillas usando un palillo para distribuirlas como se indica en (C). (D) Plantas de Arabidopsis listas para la inoculación. (E) Dos palos de madera facilitan la inmersión de las plantas en la solución bacteriana sin llegar a la maceta o al suelo (F). (G) El conjunto se puede colocar dentro de la cámara de vacío. (H) Las hojas infiltradas se vuelven más oscuras después de liberar el vacío de la cámara. (I) Las hojas desprendidas se colocan en una jeringa de 20 ml y se cubren con agua. (J) Los ciclos de presión positiva y negativa dan como resultado la extracción de las bacterias apoplásticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Inoculación bacteriana y extracción de apoplastos utilizando plantas de frijol. (A) Germinación de semillas de frijol en placas de Petri forradas con papel higiénico húmedo. (B) Planta de frijol lista para la inoculación. (C) Hoja de frijol sumergida en la solución bacteriana contenida en un tubo de 50 ml. (D) Las hojas se inoculan dentro de una cámara de vacío hasta que el tejido se vuelve más oscuro (E). (F) La hoja de frijol se enrolla, se coloca dentro de una jeringa de 20 ml y se cubre con agua (G). (H) Los ciclos de presión positiva y negativa (I) dan como resultado la extracción de las bacterias apoplásticas que pueden recuperarse en un tubo (J). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Representación esquemática de la configuración y preparación de la almohadilla de agar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis de las bacterias extraídas del apoplasto obtenidas de Arabidopsis u hojas de frijol 4 días después de la inoculación con P. syringae pv. tomate (Pto) o P. syringae pv. phaseolicola (Pph), respectivamente. La expresión de hrpL::gfp se monitoriza como fluorescencia GFP. (A) El análisis de citometría de flujo se representa como un diagrama de puntos (dispersión directa [tamaño de la célula] frente a la intensidad de fluorescencia GFP). Las bacterias no GFP indican una cepa de tipo salvaje de Pto o Pph. La línea vertical delimita el 99% de la población no GFP. (B) El análisis de citometría de flujo se representa como histogramas (recuento de células vs. intensidad de fluorescencia GFP). El histograma gris representa la cepa no GFP. (C) Los datos cuantitativos se generaron a partir del análisis de citometría de flujo. El porcentaje de celdas ON y OFF se calcula en función de la distribución que se muestra en el diagrama de puntos. El promedio indica la fluorescencia media obtenida en el experimento. El coeficiente de variación robusto (RCV) se calcula como el tercer cuartil menos el primer cuartil dividido por la mediana. (D) Imágenes de microscopía de fluorescencia que muestran niveles heterogéneos de GFP asociados con la expresión de hrpL. Las flechas blancas resaltan las bacterias que muestran niveles bajos o ninguna fluorescencia GFP. Barra de escala: 3 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El método presentado aquí describe un procedimiento no invasivo que permite la infiltración de bacterias en el tejido foliar de la planta, lo que permite la inoculación rápida de grandes volúmenes y minimiza la interrupción del tejido. Una de las características del complejo de especies de P. syringae es la capacidad de sobrevivir y proliferar dentro del apoplasto de la planta y en la superficie de la planta como epífita¹⁴. Por lo tanto, no se puede descartar la posibilidad de que las bacterias extraídas utilizando el presente protocolo provengan únicamente del apapolasto vegetal. Sin embargo, se demostró previamente mediante microscopía confocal que la proporción de bacterias en la superficie de la hoja es notablemente menor en comparación con el crecimiento bacteriano dentro de la hoja de la planta⁵. Esto se puede verificar mediante un examen microscópico de la superficie de la hoja antes de la extracción. Además, las cepas de P. syringae utilizadas como modelo en el presente protocolo, Pto DC3000 y Pph 1448A, han demostrado funcionar como epífitas débiles¹⁵, representando una proporción irrelevante de las bacterias extraídas. No obstante, si el método ha de adaptarse a otros patosistemas, puede ser necesario añadir al presente protocolo un paso previo de descontaminación de la superficie foliar.

Los métodos tradicionales de inoculación, como la infiltración de hojas con una jeringa¹⁶, causan daños tisulares más grandes y difíciles de estimar en el sitio de inoculación, lo que resulta en necrosis tisular. Además, la cantidad de daño es muy variable entre los diferentes puntos de inoculación. Además, las diferentes especies de plantas varían en su tolerancia a la infiltración de hojas. Por ejemplo, las hojas de Arabidopsis son fáciles de infiltrar, mientras que las hojas de frijol son más recalcitrantes. Las condiciones de crecimiento también afectan el nivel de tolerancia a la infiltración de una especie dada. Sin embargo, los métodos de inoculación tradicionales más suaves, como la inmersión de hojas o la pulverización de hojas, que resultan en una entrada y colonización bacteriana más natural y libre de daños del tejido, limitan inherentemente el tamaño de las poblaciones bacterianas obtenidas, frecuentemente por debajo del umbral requerido para el análisis posterior de las muestras bacterianas apoplásticas⁵ . El método de inoculación propuesto reduce significativamente la activación de la necrosis en las áreas inoculadas como resultado de la presión de la jeringa, evitando la limitación del tamaño de la muestra bacteriana y proporciona una forma fácil, reproducible y rápida de inocular áreas foliares considerables.

Algunas técnicas que requieren la inoculación de grandes áreas de tejido pueden consumir mucho tiempo y trabajo, lo que aumenta las posibilidades de infligir daño tisular. Al aplicar este método, podemos inocular cinco o más plantas de Arabidopsis , o una hoja de frijol entera, en un solo paso sin comprometer la integridad del tejido. Esta técnica puede adaptarse para inocular un mayor número de plantas o a otras especies vegetales de interés agronómico o académico, como Nicotiana benthamiana, tomate o soja. La concentración del surfactante, utilizado para reducir la tensión del agua superficial para facilitar la infiltración de la suspensión bacteriana, debe ajustarse y probarse de antemano dependiendo de la especie de planta, ya que concentraciones más altas del surfactante pueden provocar necrosis tisular en algunos casos. Además, la cantidad de presión aplicada y la duración del proceso de inoculación deben ajustarse a la resistencia ofrecida por la hoja de la planta en diferentes especies para garantizar resultados óptimos.

Con respecto a la extracción con apoplast, el método actual también minimiza la alteración del tejido, reduciendo así la cantidad de restos vegetales presentes en la muestra extraída. Esto permite muestras más limpias, lo que resulta en un análisis más eficiente a través de diferentes técnicas como RNA-seq, citometría de flujo o microscopía, como se muestra en el ejemplo. La recuperación de la población bacteriana patógena de su entorno apoplásico con una interrupción mínima de los tejidos y las células vegetales es un desafío. P. syringae coloniza los espacios intercelulares del apoplasto, formando microcolonias. El uso de un patógeno extracelular, como P. syringae, permite métodos como el que se presenta aquí, ya que no se requiere la interrupción de tejidos y células para la recuperación bacteriana. Las rondas de presión positiva y negativa sí interrumpen las microcolonias, dispersando las bacterias y permitiendo su fácil y rápida extracción a través de aberturas naturales (estomas), evitando cualquier cambio en la expresión génica que pueda acompañar a largos tiempos de incubación, como los requeridos para métodos más suaves de recuperación apoplástica. El examen microscópico del tejido vegetal sobrante apoya la eliminación de la mayor parte de la población bacteriana. Los protocolos de extracción de fluidos apoplásticos han sido ampliamente utilizados para estudiar la complejidad del fluido apoplástico¹⁷. Estos protocolos contienen un paso final de centrifugación para limpiar aún más el fluido apoplástico recuperado. Aquí, se utilizaron ciclos suaves de presión positiva y negativa utilizando el émbolo de la jeringa, reduciendo así la contaminación de la muestra con restos celulares del huésped y teniendo muy poco impacto en la eficiencia de la recuperación bacteriana. Un método clásico de extracción bacteriana suave consiste en la incubación de discos de hojas o plántulas con un surfactante durante 1-2 h¹⁸. Este método no es tan eficiente como el que aquí se presenta para extraer bacterias; Sin embargo, su principal limitación para el análisis de la expresión génica es el efecto del tiempo de incubación requerido en el perfil de expresión de la población. El método aquí presentado permite la rápida recuperación y el análisis inmediato de la población apoplásica, reduciendo así el riesgo de eludir los resultados de la expresión génica a nivel celular.

La heterogeneidad fenotípica en bacterias patógenas se ha estudiado ampliamente utilizando medios de laboratorio homogéneos. El estudio de las poblaciones bacterianas cultivadas en su nicho natural a menudo es limitado debido a barreras técnicas, como la dificultad de recuperar poblaciones bacterianas sin contaminación excesiva con desechos de células huésped que interfieren con los análisis de células individuales aguas abajo. Este método combinado de inoculación y extracción permite la generación de grandes poblaciones apoplásticas de patógenos bacterianos para análisis unicelulares.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto RTI2018-095069-B-I00 financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ y por "ERDP A way of making Europe". J.S.R. fue financiado por el Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. fue financiado por la Subvención del Proyecto P18-RT-2398 del Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.