Einzelzellanalyse der Expression von Pseudomonas syringae-Genen im Pflanzengewebe

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, die eine Einzelzell-Genexpressionsanalyse an Pseudomonas syringae-Populationen ermöglicht, die innerhalb des Pflanzenapoplasten gezüchtet werden.

Eine Vielzahl pathogener Mikroorganismen greift ständig Pflanzen an. Der Artenkomplex von Pseudomonas syringae umfasst gramnegative pflanzenpathogene Bakterien, die für eine Vielzahl von Wirten von besonderer Bedeutung sind. P. syringae dringt von der Blattoberfläche in die Pflanze ein und vermehrt sich schnell innerhalb des Apoplasten, wobei Mikrokolonien gebildet werden, die den Interzellularraum einnehmen. Die konstitutive Expression von fluoreszierenden Proteinen durch die Bakterien ermöglicht die Visualisierung der Mikrokolonien und die Überwachung der Entwicklung der Infektion auf mikroskopischer Ebene. Jüngste Fortschritte in der Einzelzellanalyse haben die große Komplexität klonaler isogener Bakterienpopulationen aufgezeigt. Diese Komplexität, die als phänotypische Heterogenität bezeichnet wird, ist die Folge von Zell-zu-Zell-Unterschieden in der Genexpression (die nicht mit genetischen Unterschieden verbunden sind) in der Bakteriengemeinschaft. Um die Expression einzelner Loci auf Einzelzellebene zu analysieren, sind transkriptionelle Fusionen mit fluoreszierenden Proteinen weit verbreitet. Unter Stressbedingungen, wie sie bei der Besiedlung des Pflanzenapoplasten auftreten, differenziert sich P. syringae aufgrund der heterogenen Expression wichtiger Virulenzgene (d.h. des Hrp-Typ-III-Sekretionssystems) in unterschiedliche Subpopulationen. Die Einzelzellanalyse einer bestimmten P. syringae-Population , die aus Pflanzengewebe gewonnen wurde, ist jedoch aufgrund der Zelltrümmer, die während der mechanischen Störung freigesetzt werden, die den Inokulations- und Bakterienextraktionsprozessen innewohnt, eine Herausforderung. Der vorliegende Bericht beschreibt eine Methode, die entwickelt wurde, um die Expression von P. syringae-Genen von Interesse auf Einzelzellebene während der Besiedlung von Arabidopsis und Bohnenpflanzen zu überwachen. Die Herstellung der Pflanzen und die zur Inokulation verwendeten Bakteriensuspensionen unter Verwendung einer Vakuumkammer werden beschrieben. Hier wird auch die Rückgewinnung von endophytischen Bakterien aus infizierten Blättern durch apoplastische Flüssigkeitsextraktion erläutert. Sowohl die bakterielle Inokulation als auch die bakterielle Extraktionsmethode sind empirisch optimiert, um die Schädigung von Pflanzen- und Bakterienzellen zu minimieren, was zu bakteriellen Präparaten führt, die für die Mikroskopie und Durchflusszytometrieanalyse optimal sind.

Pathogene Bakterien weisen Unterschiede in verschiedenen Phänotypen auf, was zur Bildung von Subpopulationen innerhalb genetisch identischer Populationen führt. Dieses Phänomen wird als phänotypische Heterogenität bezeichnet und wurde als Anpassungsstrategie während der Bakterien-Wirt-Interaktionen vorgeschlagen¹. Jüngste Fortschritte in der optischen Auflösung von konfokalen Mikroskopen, Durchflusszytometrie und Mikrofluidik in Kombination mit fluoreszierenden Proteinen haben Einzelzellanalysen von Bakterienpopulationen gefördert².

Der gramnegative Pseudomonas syringae ist aufgrund seiner akademischen und wirtschaftlichen Bedeutung ein archetypisches pflanzenpathogenes Bakterium³. Der Lebenszyklus von P. syringae ist mit dem Wasserkreislauf^{verbunden 4}. P. syringae dringt durch natürliche Öffnungen wie Stomata oder Wunden in die Interzellularräume zwischen den Mesophyllzellen, dem Pflanzenblattapoplasten, ein⁵. Im Apoplast verlässt sich P. syringae auf das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) und die Typ-III-translozierten Effektoren (T3E), um die pflanzliche Immunität zu unterdrücken und pflanzliche Zellfunktionen zum Wohle des Erregers zu manipulieren⁶. Die Expression von T3SS und T3E hängt vom Hauptregulator HrpL ab, einem alternativen Sigma-Faktor, der an die hrp-Box-Motive in der Promotorregion der Zielgene⁷ bindet.

Durch die Erzeugung chromosomenlokaler transkriptioneller Fusionen mit fluoreszierenden Proteingenen stromabwärts des interessierenden Gens kann man die Genexpression basierend auf den Fluoreszenzniveaus überwachen, die auf Einzelzellebene emittiert werden⁸. Mit dieser Methode wurde festgestellt, dass die Expression von hrpL sowohl innerhalb von Bakterienkulturen, die im Labor gezüchtet wurden, als auch innerhalb von Bakterienpopulationen, die aus dem Pflanzenapoplasten ^8,9 gewonnen wurden, heterogen ist. Obwohl Genexpressionsanalysen auf Einzelzellebene typischerweise in Bakterienkulturen durchgeführt werden, die in Labormedien gezüchtet werden, können solche Analysen auch an Bakterienpopulationen durchgeführt werden, die in der Pflanze wachsen, und liefern so wertvolle Informationen über die Bildung von Subpopulationen im natürlichen Kontext. Eine mögliche Einschränkung für die Analyse von Bakterienpopulationen, die aus der Pflanze extrahiert werden, besteht darin, dass klassische Inokulationsmethoden durch Spritzendruckinfiltration in den Apoplasten, gefolgt von einer bakteriellen Extraktion durch Mazeration des Blattgewebes, typischerweise eine große Menge zellulärer Pflanzenreste erzeugen, die die nachgeschaltete Analyse stören¹⁰. Die meisten Zelltrümmer bestehen aus autofluoreszierenden Fragmenten von Chloroplasten, die sich mit der GFP-Fluoreszenz überlappen, was zu irreführenden Ergebnissen führt.

Das vorliegende Protokoll beschreibt den Prozess der Analyse der Heterogenität der Einzelzell-Genexpression in zwei Modell-Pathosystemen: dem von der P. syringae pv. Tomatenstamm DC3000 und Arabidopsis thaliana (Col-0), und der andere durch die P. syringae pv. Phaseolicola-Stamm 1448A und Bohnenpflanzen (Phaseolus vulgaris-Sorte , Canadian Wonder). Es wird eine Inokulationsmethode vorgeschlagen, die auf einer Vakuuminfiltration unter Verwendung einer Vakuumkammer und einer Pumpe basiert, was zu einer schnellen und schadensfreien Methode zum Infiltrieren ganzer Blätter führt. Darüber hinaus wird als Verbesserung gegenüber herkömmlichen Protokollen eine schonendere Methode verwendet, um die Bakterienpopulation aus dem Apoplasten zu extrahieren, die die Gewebezerstörung signifikant reduziert, basierend auf der Extraktion von apoplastischer Flüssigkeit durch Anlegen von Über- und Unterdruckzyklen mit einer kleinen Menge Volumen innerhalb einer Spritze.

1. Pflanzenvorbereitung

1. Bereiten Sie Arabidopsis Col-0-Pflanzen vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Füllen Sie einen Topf mit einem Durchmesser von 10 cm mit einer zuvor bewässerten 1:3-Vermiculit-Pflanzensubstratmischung (siehe Materialtabelle) und decken Sie den Topf mit einem 15 cm x 15 cm großen Metallgitter mit 1,6 mm x 1,6 mm großen Löchern ab. Passen Sie das Metallgitter mit einem Gummiband an den nassen Boden an (Abbildung 1A).
   2. Säen Sie Arabidopsis-Samen mit einem feuchten Zahnstocher in die Löcher des Metallgitters. Platzieren Sie drei bis vier Samen an entfernten Positionen im Topf (Abbildung 1B, C).
   3. Decken Sie die Töpfe mit einer Kunststoffkuppel ab, um eine hohe relative Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, und inkubieren Sie sie 72 h bei 4 °C zur Schichtung.
      HINWEIS: Die Schichtung (Inkubation bei hoher Luftfeuchtigkeit und niedriger Temperatur, wie beschrieben) verbessert die Keimrate und Synchronität der Samen.
   4. Überführen der Töpfe in eine Pflanzenwachstumskammer unter Kurztagesbedingungen (8 h hell/16 h dunkel bei 21 °C, Lichtintensität: 100 μmol·m−²·s⁻¹, relative Luftfeuchtigkeit: 70%).
   5. Entfernen Sie nach der Samenkeimung (8-10 Tage) mit der Pinzette die meisten Sämlinge und halten Sie einen Sämling in jeder der Positionen des Topfes (sechs Sämlinge/Topf) (Abbildung 1D). Entfernen Sie die Plastikkuppel, um die Töpfe freizulegen.
      HINWEIS: Die Pflanzen sind 4-5 Wochen nach der Keimung gebrauchsfertig.
2. Bereiten Sie Phaseolus vulgaris-Bohnenpflanzen (Sorte Canadian Wonder) vor.
   1. Decken Sie den Boden einer Petrischale mit einem feuchten Stück Handtuchpapier ab und legen Sie die Bohnensamen darauf. Verschließen Sie die Petrischale mit chirurgischem Klebeband und inkubieren Sie sie 3-4 Tage lang bei 28 °C (Abbildung 2A).
   2. Übertragen Sie die gekeimten Samen in einen Topf mit einem Durchmesser von 10 cm, der mit einer feuchten 1:3-Mischung aus Vermiculit-Pflanzensubstrat gefüllt ist.
   3. Inkubation in einer Pflanzenwachstumskammer unter Langzeiteinstellungen (16 h hell/8 h dunkel bei 23 °C, Lichtintensität: 100 μmol·m−²·s⁻¹, relative Luftfeuchtigkeit: 70%).
      HINWEIS: Die Pflanzen sind 10 Tage nach der Keimung gebrauchsfertig (Abbildung 2B).

2. Inokulation von Arabidopsis und Bohnenpflanzen

HINWEIS: In dieser Studie wurden die Stämme P. syringae pv. Tomate DC3000 und P. syringae pv. Es wurden Phaseolicola 1448A verwendet.

1. Bereiten Sie das Inokulum von P. syringae vor.
   1. Den interessierenden P. syringae-Stamm aus einem Glycerinvorrat von −80 °C auf eine LB-Platte (10 g/l Trypton, 5 g/l NaCl, 5 g/l Hefeextrakt und 16 g/l bakteriologisches Agar, siehe Materialtabelle) auftragen, die mit den entsprechenden Antibiotika ergänzt wird. Bei 28 °C 40-48 h inkubieren.
      HINWEIS: Die Verwendung von Antibiotika wird empfohlen, wenn der interessierende Stamm ein Plasmid oder ein genomisches Resistenzgen trägt. Die empfohlenen Antibiotika-Konzentrationen für P. syringae sind wie folgt: Kanamycin (15 μg/ml), Gentamycin (10 μg/ml), Ampicillin (300 μg/ml) (siehe Materialtabelle).
   2. Die bakterielle Biomasse wird ausgekratzt und in 5 ml 10 mM MgCl₂ resuspendiert. Messen Sie den OD₆₀₀ und stellen Sie ihn durch Zugabe von 10 mM MgCl₂ auf 0,1 ein.
      ANMERKUNG: Ein OD₆₀₀ von 0,1 einer P. syringae-Kultur entspricht 5 x 10⁷ KBE^·ml−1.
   3. Führen Sie serielle Verdünnungen in 10 mM MgCl₂ durch, um eine endgültige Inokulumkonzentration von 5 x 10⁵ KBE^·ml−1 zu erreichen. Bereiten Sie 200 ml Inokulum für die Arabidopsis-Pflanzen und 50 ml für die Bohnenpflanzen vor.
   4. Kurz vor der Inokulation wird das Tensid Silwett L-77 (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 0,02 % für die Bohneninokulation und 0,01 % für Arabidopsis zugegeben. Beachten Sie, dass Silwett für das Arabidopsis-Gewebe etwas schädlich ist.
2. Führen Sie eine Vakuuminfiltration durch.
   1. Für die Arabidopsis-Infiltration legen Sie zwei Holzstäbchen, die ein X bilden, über den Topf (Abbildung 1E) und stellen Sie den Topf mit der Vorderseite nach unten auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 14 cm, die das 200-ml-Inokulum enthält (Abbildung 1F).
   2. Für die Inokulation mit Bohnenblättern wird das Blatt in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, das das Inokulum enthält (Abbildung 2C).
   3. Setzen Sie die in die Inokulumlösung getauchten Pflanzen in eine Vakuumkammer ein (Abbildung 1G und Abbildung 2D) und geben Sie einen Impuls von 500 mbar für 30 s, um die Blätter zu infiltrieren. Wiederholen Sie den Vakuumimpuls 2-3 Mal, bis das Blatt vollständig infiltriert ist (Abbildung 1H und Abbildung 2E).
   4. Lassen Sie die überschüssige Inokulumlösung mit einem Blatt Papier ab und bringen Sie die Pflanzen in die entsprechende Wachstumskammer zurück.

3. Extraktion von Bakterien aus dem Apoplast

1. Schneiden Sie vier Tage nach der Inokulation entweder den oberirdischen Teil der Arabidopsis-Pflanze oder das beimpfte Blatt von der Bohnenpflanze ab und geben Sie es ohne Nadel in eine 20-ml-Spritze (Abbildung 2G). Rollen Sie bei Bohnenblättern das Blatt auf sich selbst und lassen Sie die abaxiale Fläche nach außen, wie in Abbildung 2F dargestellt.
2. Fügen Sie genügend destilliertes Wasser hinzu, um das Gewebe zu bedecken (normalerweise 10-15 ml).
3. Setzen Sie den Kolben ein und entfernen Sie mit der Spritze in vertikaler Position mit der Spitze nach oben die überschüssige Luft und die Luftblasen in der Spritze, indem Sie vorsichtig auf den Zylinder klopfen, bis sich die gesamte Luft in der Nähe der Spitze befindet. Schieben Sie dann den Kolben, um die Luft herauszunehmen. Sobald sich so wenig Luft wie möglich in der Spritze befindet, bedecken Sie die Spitze des Spritzenzylinders mit Paraffinfolie.
4. Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, um einen Überdruck zu erzeugen, bis das Gewebe dunkler wird (Abbildung 1I und Abbildung 2H). Ziehen Sie dann am Kolben, um Unterdruck zu erzeugen (Abbildung 1J und Abbildung 2I). Wiederholen Sie diesen Schritt 3-5 Mal.
5. Entfernen Sie den Paraffinfilm und den Kolben und sammeln Sie die Flüssigkeit, die die aus dem Apoplast extrahierten Bakterien enthält, wie in Abbildung 2J dargestellt.

4. Einzelzellanalyse der Apoplast-extrahierten Bakterien

1. Visualisieren Sie durch konfokale Mikroskopie, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Bereiten Sie eine 1,5% ige Agaroselösung in destilliertem Wasser vor. Fügen Sie nach dem Schmelzen genügend Volumen hinzu, um den Raum zwischen zwei nebeneinander angeordneten Objektträgern zu füllen, und legen Sie einen weiteren Objektträger darauf (Abbildung 3). Lassen Sie sie 15 Minuten trocknen und entfernen Sie vorsichtig den Objektträger auf der Oberseite. Schneiden Sie das Agarosepad kurz vor Gebrauch mit einer Klinge in 5 mm x 5 mm große Stücke.
   2. Parallel dazu wird 1 ml der Apoplast-extrahierten Bakterien bei 12.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernt und das Pellet in 20 μl Wasser resuspendiert, um die Zellen zu konzentrieren. Geben Sie einen 2-μl-Tropfen der konzentrierten Zellen auf ein 0,17-mm-Deckglas und bedecken Sie den Tropfen mit einem 5 mm x 5 mm großen Stück des zuvor in Schritt 1 erhaltenen Agarosekissens, wie in Abbildung 3 dargestellt.
   3. Visualisieren Sie das bakterielle Präparat unter dem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle). Um grün fluoreszierende Bakterien zu identifizieren, verwenden Sie den Anregungslaser bei 488 nm und einen Emissionsfilter im Bereich von 500 nm bis 550 nm. Um alle Bakterien zu identifizieren, verwenden Sie das helle Feld und führen Sie beide Felder zusammen.
   4. Verarbeiten Sie die konfokalen Bilder mit Fidschi (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie dazu das MicrobeJ-Plugin, um die Kontur der Bakterienzelle zu identifizieren und die Fluoreszenzintensität im Inneren zu messen.
      HINWEIS: Für diese Analyse wird die Aufnahme von Bildern von isolierten Bakterien (nicht geclustert) empfohlen.
2. Führen Sie eine Analyse mittels Durchflusszytometrie durch.
   1. Nehmen Sie ein Aliquot der Apoplast-extrahierten Bakteriensuspensionen, um es mit dem Durchflusszytometer zu analysieren. Erwerben Sie 100.000 Ereignisse.
   2. Um zwischen Bakterien und Pflanzenresten zu unterscheiden, analysieren Sie den Apoplasten, der aus einer nicht inokulierten Pflanze extrahiert wurde, und vergleichen Sie das Punktdiagramm, das seine Vorwärtsstreuzellgröße (FSC) im Vergleich zur Seitenstreuzellgröße (SSC) zeigt, mit der der Apoplast-extrahierten Bakteriensuspension. Um nicht fluoreszierende Bakterien zu identifizieren, verwenden Sie die Apoplasten, die aus den Pflanzen extrahiert wurden, die mit nicht fluoreszierenden isogenen Bakterien geimpft wurden, und vergleichen Sie ihre fluoreszierenden Emissionen.

Die Expression des Typ-III-Sekretionssystems ist essentiell für das Bakterienwachstum innerhalb der Pflanze. Die rechtzeitige Expression von T3SS-Genen wird durch eine komplizierte Regulation erreicht, in deren Zentrum der extrazytoplasmatische Funktion (ECF) Sigma-Faktor HrpL steht, der Schlüsselaktivator der Expression von T3SS-verwandten Genen¹¹. Eine Analyse der Expression von hrpL wurde zuvor unter Verwendung einer chromosomenlokalisierten transkriptionellen Fusion zu einem nachgeschalteten promotorlosen gfp-Gen und unter Verfolgung der Expressionsmuster durch konfokale Mikroskopie und Durchflusszytometrie^{durchgeführt 9}. Diese Fusionen werden durch homologe Rekombinations-vermittelte Integration von Plasmid-kodierten Konstrukten erzeugt, die durch PCR und traditionelle Klonierung erzeugt werden, und tragen die letzten 500 Basenpaare des ORF des interessierenden Gens (einschließlich des STOP-Codons) und 500 Basenpaare der Sequenz unmittelbar stromabwärts und flankieren die Ribosom-Bindungsstelle und den ORF des zu verwendenden Fluoreszenzreportergens (in diesem Fall GFP), gefolgt von einer Antibiotikaresistenzkassette (in diesem Fall das NPT2-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht). So wurde festgestellt, dass Apoplast-extrahierte P. syringae-Populationen, die T3SS-verwandte Gene, einschließlich hrpL, exprimieren, in planta⁹ heterogen sind. In diesem Präzedenzfall werden die repräsentativen Ergebnisse der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie und der Durchflusszytometrie-Analyse der hrpL-Expression in einzelnen Bakterienzellen der Modellstämme Pph 1448A (Pph) und Pto DC3000 (Pto) gezeigt, die nach Besiedlung des Blattapoplasten aus den Blättern von Bohnen bzw. Arabidopsis extrahiert wurden (Abbildung 4). In jedem Stamm trägt das chromosomale hrpL-Gen von P. syringae eine nachgeschaltete transkriptionelle Fusion zu einem promotorlosen gfp-Gen, das es ermöglicht, die native hrpL-Promotoraktivität zu überwachen, indem die GFP-Expressionsniveaus ^8,9 verfolgt werden.

Apoplast-extrahierte Bakterien können für verschiedene Analysen verwendet werden. Hier wurden 300 μl der oben genannten Reporterbakterienstämme aus dem Apoplasten infizierter Arabidopsis- oder Bohnenpflanzen extrahiert und zur Datenerfassung mit einem Durchflusszytometersystem verwendet (siehe Materialtabelle). Laseremission bei 488 nm und der FITC-Filter wurde für die GFP-Detektion verwendet. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigt die Fluoreszenzverteilung in einzelnen Bakterienzellen innerhalb der Population. Die heterogene Expression von hrpL kann durch Durchflusszytometrie in Arabidopsis-Apoplast-extrahiertem Pto und in Bohnenapoplast-extrahiertem Pph, einschließlich HrpL^{OFF-Bakterien} (nicht exprimierendes GFP), deutlich beobachtet werden, und diese Ergebnisse werden durch mikroskopische Untersuchung der entsprechenden Proben unterstützt (Abbildung 4). Die Punktdiagramme (linke Felder) zeigen die Verteilung der Fluoreszenzintensität von GFP in Abhängigkeit von der Zellgröße in der Population (Abbildung 4A), während die Histogramme die Fluoreszenzintensität von GFP im Vergleich zur Zellzahl zeigen (Abbildung 4B). Diese beiden unterschiedlichen grafischen Darstellungen von Zytometriedaten ermöglichen es dem Forscher, subtile visuelle Nuancen zu ermitteln und ergänzende Informationen bereitzustellen. Als Kontrolle für die bakterielle Autofluoreszenz wurde der entsprechende Nicht-GFP-Wildtypstamm verwendet (oberes Feld in Abbildung 4A und graues Histogramm in Abbildung 4B). Dies ermöglicht die Identifizierung des Diagrammbereichs, in dem Nicht-GFP-Bakterien innerhalb der Population angezeigt werden. Durchflusszytometrische Analysen erzeugen auch quantitative Daten. Beispielsweise werden die Prozentsätze von HrpL^ON-Zellen (fluoreszierend) in Apoplast-extrahierten Pto- und Pph-Populationen extrahiert. Abbildung 4C zeigt, wie die HrpL-ON-Prozentsätze in diesen Populationen, insbesondere im Pto-Modell, höher waren als die entsprechenden Prozentsätze von HrpL-OFF-Zellen (nicht fluoreszierend). Diese Daten können auch verwendet werden, um die durchschnittliche oder mittlere Fluoreszenz für die gesamte Bevölkerung zu berechnen. In diesem speziellen Experiment wurde die durchschnittliche GFP-Fluoreszenzintensität erhalten, die für die Pto-Population höher war als für Pph, was dem höheren Anteil an ON-Zellen entspricht. Bei den Durchschnittswerten handelt es sich um Daten auf Populationsebene, die mit Daten vergleichbar sind, die durch Nicht-Einzelzelltechniken wie RT-q-PCRoder RNAseq gewonnen wurden. Schließlich wird auch der robuste Variationskoeffizient (RCV)¹² gezeigt, der sich aus dem dritten Quartil abzüglich des ersten Quartils dividiert durch den Median ergibt. Das RCV wird häufig in Durchflusszytometrie-Studien verwendet, um die Datenstreuung (d. h. die Heterogenität der Expression innerhalb der Population) ^{abzuschätzen13}. In der aktuellen Studie war der RCV für Pph etwas höher als für Pto, obwohl der Unterschied nicht ausreichte, um die Verteilung der Expression innerhalb der Populationen dieser beiden Stämme als signifikant unterschiedlich zu charakterisieren. Die Heterogenität der hrpL-Expression kann mit den konfokalen Mikroskopiebildern visuell bestätigt werden (Abbildung 4D). Die Verwendung von Agar-Pads für die Mikroskopiepräparation führt zu einer einfacheren Visualisierung und einer höheren Bildqualität der einzelnen Zellen, da die Bakterien auf eine einzige Schicht gedrückt werden und die Bewegung der Bakterien verhindert wird. Die in diesem Protokoll beschriebenen Inokulations- und Bakterienextraktionsverfahren minimieren die Menge an Pflanzenresten innerhalb der Bakterienzubereitung und ermöglichen so die Analyse der bakteriellen Expression durch diese verschiedenen Techniken (Abbildung 4).

Abbildung 1: Bakterielle Inokulation und Apoplastenextraktion mit Arabidopsis-Pflanzen. (A) Vorbereitung des Topfes mit ordnungsgemäß angebrachtem Metallgitter. (B) Aussaat mit einem Zahnstocher, um sie wie in (C) angegeben) zu verteilen. (D) Arabidopsis-Pflanzen, die zur Inokulation bereit sind. (E) Zwei Holzstäbchen erleichtern das Eintauchen der Pflanzen in die Bakterienlösung, ohne den Topf oder den Boden zu erreichen (F). (G) Das Ensemble kann in die Vakuumkammer gestellt werden. (H) Die infiltrierten Blätter werden dunkler, nachdem das Vakuum aus der Kammer abgelassen wurde. (I) Die abgelösten Blätter werden in eine 20-ml-Spritze gegeben und mit Wasser bedeckt. (J) Zyklen von Über- und Unterdruck führen zur Extraktion der apoplastischen Bakterien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Bakterielle Inokulation und Apoplastenextraktion mit Bohnenpflanzen. (A) Keimung von Bohnensamen in Petrischalen mit nassem Toilettenpapier ausgekleidet. (B) Bohnenpflanze, die zur Inokulation bereit ist. (C) Bohnenblatt, das in die in einem 50-ml-Röhrchen enthaltene Bakterienlösung eingetaucht ist. (D) Die Blätter werden in einer Vakuumkammer beimpft, bis das Gewebe dunkler wird (E). (F) Das Bohnenblatt wird gerollt, in eine 20-ml-Spritze gegeben und mit Wasser (G) bedeckt. (H) Zyklen von Über- und Unterdruck (I) führen zur Extraktion der apoplastischen Bakterien, die in ein Röhrchen zurückgewonnen werden können (J). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Einstellung und Vorbereitung des Agar-Pads. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Analyse der aus Arabidopsis oder Bohnenblättern gewonnenen Apoplast-extrahierten Bakterien 4 Tage nach Inokulation mit P. syringae pv. Tomate (Pto) bzw. P. syringae pv. phaseolicola (Pph). Die Expression von hrpL::gfp wird als GFP-Fluoreszenz überwacht. (A) Die Durchflusszytometrie-Analyse wird als Punktdiagramm dargestellt (Vorwärtsstreuung [Zellgröße] vs. GFP-Fluoreszenzintensität). Nicht-GFP-Bakterien weisen auf einen Wildtyp-Stamm von Pto oder Pph hin. Die vertikale Linie grenzt 99 % der Nicht-GFP-Bevölkerung ab. (B) Die Durchflusszytometrie-Analyse wird als Histogramm (Zellzahl vs. GFP-Fluoreszenzintensität) dargestellt. Das graue Histogramm stellt die Nicht-GFP-Dehnung dar. (C) Quantitative Daten wurden aus der Durchflusszytometrie-Analyse generiert. Der Prozentsatz der EIN- und AUS-Zellen wird basierend auf der im Punktdiagramm dargestellten Verteilung berechnet. Der Durchschnitt gibt die mittlere Fluoreszenz an, die im Experiment erhalten wurde. Der robuste Variationskoeffizient (RCV) wird berechnet als drittes Quartil abzüglich des ersten Quartils dividiert durch den Median. (D) Fluoreszenzmikroskopische Bilder, die heterogene GFP-Konzentrationen zeigen, die mit der Expression von hrpL assoziiert sind. Die weißen Pfeile markieren Bakterien, die eine geringe oder keine GFP-Fluoreszenz aufweisen. Maßstabsleiste: 3 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die hier vorgestellte Methode beschreibt ein nicht-invasives Verfahren, das die Infiltration von Bakterien in das pflanzliche Blattgewebe ermöglicht und so die schnelle Inokulation großer Volumina bei gleichzeitiger Minimierung des Gewebeaufschlusses ermöglicht. Eines der Merkmale des P. syringae-Artenkomplexes ist die Fähigkeit, im Pflanzenapoplasten und auf der Pflanzenoberfläche als Epiphyt¹⁴ zu überleben und sich zu vermehren. Somit kann nicht ausgeschlossen werden, dass die unter Verwendung des vorliegenden Protokolls extrahierten Bakterien nur aus dem Pflanzenapoplasten stammen. Zuvor konnte jedoch mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie gezeigt werden, dass der Anteil der Bakterien auf der Blattoberfläche im Vergleich zum Bakterienwachstum im Inneren des Pflanzenblattes bemerkenswert gering ist⁵. Dies kann durch mikroskopische Untersuchung der Blattoberfläche vor der Extraktion überprüft werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die P. syringae-Stämme , die im vorliegenden Protokoll als Modell verwendet werden, Pto DC3000 und Pph 1448A, als schwache Epiphite¹⁵ fungieren, die einen irrelevanten Anteil der extrahierten Bakterien darstellen. Wenn die Methode jedoch an andere Pathosysteme angepasst werden soll, muss dem vorliegenden Protokoll möglicherweise ein vorheriger Schritt der Dekontamination der Blattoberfläche hinzugefügt werden.

Herkömmliche Inokulationsmethoden, wie die Blattinfiltration unter Verwendung einer Spritze¹⁶, verursachen größere, schwer abzuschätzende Gewebeschäden an der Inokulationsstelle, was zu Gewebenekrosen führt. Darüber hinaus ist das Ausmaß des Schadens zwischen verschiedenen Impfpunkten sehr unterschiedlich. Außerdem unterscheiden sich verschiedene Pflanzenarten in ihrer Toleranz gegenüber Blattinfiltration. Zum Beispiel sind Arabidopsis-Blätter leicht zu infiltrieren, während Bohnenblätter widerspenstiger sind. Die Wachstumsbedingungen beeinflussen auch die Toleranz gegenüber Infiltration einer bestimmten Art. Schonendere traditionelle Inokulationsmethoden, wie z. B. Blatttauchen oder Blattspray, die zu einem natürlicheren und schadensfreieren Bakterieneintritt und einer Besiedlung des Gewebes führen, begrenzen jedoch von Natur aus die Größe der erhaltenen Bakterienpopulationen, häufig unter dem Schwellenwert, der für die anschließende Analyse der apoplastischen Bakterienproben erforderlich ist⁵ . Die vorgeschlagene Inokulationsmethode reduziert die Aktivierung von Nekrose in den beimpften Bereichen, die sich aus dem Spritzendruck ergibt, erheblich, während eine Begrenzung der bakteriellen Probengröße vermieden wird, und bietet eine einfache, reproduzierbare und schnelle Möglichkeit, beträchtliche Blattbereiche zu beimpfen.

Einige Techniken, die die Inokulation großer Gewebebereiche erfordern, können sehr zeit- und arbeitsaufwändig sein, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, Gewebeschäden zuzufügen. Mit dieser Methode können wir fünf oder mehr Arabidopsis-Pflanzen oder ein ganzes Bohnenblatt in nur einem Schritt inokulieren, ohne die Integrität des Gewebes zu beeinträchtigen. Diese Technik kann angepasst werden, um eine größere Anzahl von Pflanzen oder andere Pflanzenarten von agronomischem oder akademischem Interesse zu impfen, wie z. B. Nicotiana benthamiana, Tomate oder Sojabohnen. Die Konzentration des Tensids, das zur Verringerung der Oberflächenwasserspannung verwendet wird, um die Infiltration der Bakteriensuspension zu erleichtern, muss je nach Pflanzenart im Voraus angepasst und getestet werden, da höhere Konzentrationen des Tensids in einigen Fällen zu Gewebenekrosen führen können. Außerdem müssen die Höhe des ausgeübten Drucks und die Dauer des Inokulationsprozesses an die Widerstandsfähigkeit des Pflanzenblattes bei verschiedenen Arten angepasst werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

In Bezug auf die Apoplastenextraktion minimiert die derzeitige Methode auch die Gewebezerstörung und reduziert so die Menge an Pflanzenresten, die in der extrahierten Probe vorhanden sind. Dies ermöglicht sauberere Proben, was zu einer effizienteren Analyse durch verschiedene Techniken wie RNA-seq, Durchflusszytometrie oder Mikroskopie führt, wie im Beispiel gezeigt. Die Wiederherstellung der pathogenen Bakterienpopulation aus ihrer apoplastischen Umgebung mit minimalem Gewebe- und Pflanzenzellaufschluss ist eine Herausforderung. P. syringae besiedelt die Interzellularräume des Apoplast und bildet Mikrokolonien. Die Verwendung eines extrazellulären Erregers wie P. syringae ermöglicht Methoden wie die hier vorgestellte, da für die bakterielle Regeneration kein Gewebe- und Zellaufschluss erforderlich ist. Die Runden von Über- und Unterdruck stören die Mikrokolonien, zerstreuen die Bakterien und ermöglichen ihre einfache und schnelle Extraktion durch natürliche Öffnungen (Stomata), wodurch jede Veränderung der Genexpression vermieden wird, die mit langen Inkubationszeiten einhergehen kann, wie sie für schonendere Methoden der apoplastischen Genesung erforderlich sind. Die mikroskopische Untersuchung des übrig gebliebenen Pflanzengewebes unterstützt die Entfernung des größten Teils der Bakterienpopulation. Extraktionsprotokolle für apoplastische Flüssigkeiten wurden häufig verwendet, um die Komplexität der apoplastischen Flüssigkeit¹⁷ zu untersuchen. Diese Protokolle enthalten einen letzten Schritt der Zentrifugation, um die gewonnene apoplastische Flüssigkeit weiter zu reinigen. Hier wurden stattdessen sanfte Über- und Unterdruckzyklen mit dem Spritzenkolben verwendet, wodurch die Kontamination der Probe mit Wirtszelltrümmern reduziert wurde, während die Effizienz der bakteriellen Rückgewinnung nur sehr gering war. Eine klassische schonende bakterielle Extraktionsmethode besteht in der Inkubation von Blattscheiben oder Sämlingen mit einem Tensid für 1-2 h¹⁸. Diese Methode ist nicht so effizient wie die hier vorgestellte, um Bakterien zu extrahieren; Die Haupteinschränkung für die Genexpressionsanalyse ist jedoch der Einfluss der erforderlichen Inkubationszeit auf das Expressionsprofil der Population. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht eine schnelle Genesung und sofortige Analyse der apoplastischen Population, wodurch das Risiko einer Umgehung der Genexpressionsergebnisse auf zellulärer Ebene verringert wird.

Die phänotypische Heterogenität in pathogenen Bakterien wurde unter Verwendung homogener Labormedien umfassend untersucht. Die Untersuchung von Bakterienpopulationen, die in ihrer natürlichen Nische gezüchtet werden, ist oft aufgrund technischer Barrieren begrenzt, wie z. B. der Schwierigkeit, Bakterienpopulationen ohne übermäßige Kontamination mit Wirtszelltrümmern zu gewinnen, die nachgelagerte Einzelzellanalysen stören. Diese kombinierte Methode der Inokulation und Extraktion ermöglicht die Erzeugung großer apoplastischer Populationen bakterieller Krankheitserreger für Einzelzellanalysen.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Arbeit wurde durch den Projektzuschuss RTI2018-095069-B-I00 unterstützt, der von MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ finanziert wurde, und durch "ERDP A way of making Europe". J.S.R. wurde durch den Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020) finanziert. N.L.P. wurde durch den Projektzuschuss P18-RT-2398 von Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación finanziert.