Aquí, presentamos un protocolo altamente accesible para evaluar el movimiento de la célula en células de trofoblasto humano mediante tres ensayos in vitro: el ensayo de rayado, el ensayo de invasión transwell y el ensayo de proliferación celular.

Movimiento celular es una propiedad crítica de trofoblastos durante el desarrollo placentario y embarazo precoz. Se demuestra la importancia de la migración del trofoblasto adecuada e invasión por trastornos de embarazo tales como restricción del crecimiento intrauterino y de la preeclampsia, que se asocian con invasión inadecuada del trofoblasto de la vasculatura materna. Por desgracia, nuestra comprensión de los mecanismos por el que se desarrolla la placenta migre trofoblastos es limitada. Análisis in vitro de la migración celular mediante el ensayo de scratch es una herramienta útil en la identificación de factores que regulan la capacidad migratoria de trofoblasto. Sin embargo, este ensayo sólo definir los cambios celulares que pueden resultar en migración de la célula alterada. Este protocolo describe tres diferentes ensayos in vitro que se utilizan conjuntamente para evaluar movimiento de trofoblasto celular: el ensayo de rayado, el ensayo de invasión y el ensayo de proliferación. Los protocolos descritos aquí pueden modificarse para su uso en otras líneas celulares para cuantificar el movimiento de la célula en respuesta a estímulos. Estos métodos permiten a los investigadores a identificar los factores individuales que contribuyen al movimiento de la célula y un minucioso examen de los mecanismos potenciales subyacentes cambios aparentes en la migración celular.

Desarrollo placentario es un paso crucial en el establecimiento del embarazo, que afectan la salud materna y fetal. Sin embargo, la base mecanicista por el cual este proceso se produce no se entiende completamente. Migración celular es un proceso biológico importante que contribuye a la creación y funciones de la placenta durante el embarazo. Tras la implantación del blastocisto, el trophectoderm distingue en trofoblastos vellosos, que cubren la superficie de las vellosidades coriónicas y participan en el intercambio de nutrientes y gas, y trofoblastos extravillous (EVTs), que migran hacia fuera de las vellosidades e invaden la decidua y la vasculatura materna¹. La migración de las EVTs es esencial para la remodelación de las arterias espirales maternas y el establecimiento de la circulación uteroplacentaria para apoyar crecimiento fetal². Invasión inadecuada del trofoblasto durante el embarazo resulta en desarrollo placentario anormal y puede contribuir a complicaciones del embarazo como preeclampsia, hipertensión gestacional, restricción del crecimiento intrauterino y parto prematuro^{3, 4}. Por lo tanto, entender los factores que afectan la motilidad de trofoblasto es esencial para determinar los caminos necesarios para la placentación normal.

Migración del trofoblasto es controlada por una compleja red de moléculas, incluyendo factores de crecimiento, citoquinas, hormonas y de factores angiogénicos⁵de señalización. Debido a las limitaciones del estudio de la placenta en vivo, ensayos in vitro utilizando inmortalizaron células de trofoblasto humano líneas han sido cruciales para identificar factores que contribuyen a la movilidad del trofoblasto. Pruebas de Scratch y la invasión se han utilizado ampliamente para evaluar cuantitativamente la función de moléculas individuales en trofoblasto celular migración^6,7,8. Sin embargo, aunque útil para tandem para investigar cómo cambios en la migración pueden ser causados por cambios en la invasividad celular, estos dos ensayos no representan mecanismos adicionales que pueden contribuir a tasas de alteración de migración celular. Por ejemplo, las reducciones a la tasa de proliferación celular pueden resultar en menos células disponibles para migrar.

Aquí, describimos métodos cuantitativos in vitro para evaluar la migración del trofoblasto con rasguño, proliferación celular y los ensayos de invasión celular. En el ensayo de rayado, se crea una herida uniforme en una monocapa de células y la migración de células para llenar el vacío se mide por la proyección de imagen automatizada, Time-lapse del tamaño de la herida y la densidad de células dentro de la herida. El ensayo de proliferación celular se basa en calcular la proporción de células en cada punto de tiempo en comparación con una cantidad conocida a partir de las células. En el ensayo de invasión celular, las células se siembran en la cima de una cámara de inserción de cultura celular recubierto por la matriz extracelular (e.g. Transwell), y se contó el número de células que invaden a través de la matriz extracelular en respuesta a quimio-atrayente.

El scratch es una herramienta sencilla y eficaz que puede utilizar para determinar cómo las diferentes condiciones ambientales afectan la migración de la célula. Los ensayos de proliferación y la invasión pueden utilizarse posteriormente para determinar la contribución de la proliferación celular y la invasión a general cambios en la migración celular. Colectivamente, estos ensayos proporcionan medidas robustas de los procesos biológicos que pueden contribuir a la movilidad de la célula. Dos líneas de células inmortalizadas trofoblasto durante el primer trimestre fueron utilizadas en el análisis descritos, Swan.71 (Sw.71) y HTR-8/SVneo^9,10. Sin embargo, estos ensayos también pueden ser optimizados para su uso en otros tipos celulares para identificar los principales moduladores de la migración celular y la invasión.

1. preparación de la célula

1. Mantener las células en frascos de T-75 en medios de crecimiento estándar a 37 ° C, 5% CO₂y 95% de humedad.
   Nota: Las células utilizadas en estos experimentos fueron el inmortalizado células de trofoblasto en el primer trimestre las líneas Swan.71 (Sw.71) y HTR-8/SVneo^9,10. Las células Sw.71 se mantuvieron en DMEM/F-12 suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio 1,0 mM, 10 mM HEPES, 0.10 m m MEM no esenciales aminoácidos, 100 unidades/mL de penicilina y estreptomicina μg/mL 100. Las células de HTR-8/SVneo se mantuvieron en RPMI-1640 suplementado con 5% SFB inactivado con calor.
2. Permitir a las células para replicarse hasta llegar a 90-100% de confluencia. Utilizar una campana de flujo cultivo de tejido estéril, aspirar los medios de comunicación de las células del frasco y lavado con 10 mL de estéril 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Aspire el PBS y añadir 5 mL de 1 x (0.05%) tripsina-EDTA al matraz, asegurándose de que las células están cubiertas por la tripsina. Coloque el matraz en la incubadora de laboratorio mantenida a 37 ° C, 5% CO₂y 95% de humedad hasta que todas las células han separado de la parte inferior del matraz (aproximadamente 5-10 min).
4. Añadir 10 mL de medio de crecimiento precalentado al matraz para desactivar el tripsina-EDTA.

2. ensayo de rayado

1. Siguiente paso 1.4, semillas el número apropiado de células en una placa de 24 pocillos para lograr 100% de confluencia en 48 h.
   Nota: Es posible realizar el ensayo de rayado con una variedad de diseños diferentes de la placa. El número máximo de pozos permitido por la herramienta del fabricante de la herida es un formato de 96 pozos.
2. Al día siguiente (día antes del ensayo rasguño), cambiar los medios de comunicación a rojo de fenol libre medios complementado cuando sea necesario, incluyendo FBS despojado de dextrano inactivado con calor, carbón de leña.
   Nota: Otros estudios han recomendado el uso de medios con baja concentración de FBS (por ejemplo, 1%) para minimizar la proliferación de la célula, que puede ser utilizada como una alternativa en este protocolo¹¹.
3. En el día de la prueba de scratch, pretratar las células durante 30 minutos mediante la adición de tratamiento deseado para los medios de comunicación en cada pozo. Los experimentos utilizaron vehículos (1 x PBS) y 100 dexametasona nM diluido en 1 x PBS.
4. Para crear heridas uniforme, coloque estéril 10 μl las puntas de pipeta en los alfileres de la herramienta del fabricante de la herida. Baje las puntas en la primera fila de pozos y la placa a lo largo de la pista de la fábrica de herida hasta las puntas de pipetas llegar al otro lado del pozo.
   1. Mueva el plato hacia atrás a la posición inicial, permitiendo que las puntas de pipeta tocar continuamente la parte inferior de la placa para asegurar una constante herida en todo el diámetro del pozo. Quite y reemplace las puntas de pipetas estériles de 10 μl y baje los consejos en la siguiente fila de pozos.
5. Repita el paso 2.4 hasta que todos los pocillos están rayados.
   Nota: Si no hay disponible una herramienta de máquina de la herida, las heridas pueden crearse manualmente raspando el centro de los pozos con una pipeta de 10 μl.
6. Aspirar con cuidado los medios de comunicación y lave suavemente las células dos veces con 1 x PBS. Después de un lavado final, añadir suplido-rojo de fenol libre, despojado o media baja-FBS con tratamiento deseado o vehículo (como se indica en el paso 2.3).
   Nota: HTR-8/SVneo las células se deben lavar con medios suplidos de rojo de fenol, como lavado con PBS x 1 hará que las células separar.
7. Coloque la placa de 24 pocillos que contienen pozos rayados en el reproductor de imágenes automatizado, Time-lapse (véase Tabla de materiales) ubicados en una incubadora de laboratorio mantenida a 37 ° C, 5% CO₂y 95% de humedad. Pozos de imagen a intervalos regulares según sea necesario para permitir la completa cicatrización de la herida (por ejemplo, cada 2 h durante 72 h) de las células.
8. Calcular la densidad de la herida y el ancho por el software asociado con el reproductor de imágenes automatizado, Time-lapse (véase Tabla de materiales). Para calcular el porcentaje de cambio en el tamaño de la herida en relación con el tamaño de la herida inicial, establezca el ancho de la herida a tiempo 0 igual al 100%. Divida el tamaño de la herida en cada punto de tiempo posterior por el tamaño de la herida a tiempo 0 y multiplicar por 100 para obtener el porcentaje (figura 1).

3. invasión ensayo

1. Siguiente paso 1.4, semillas el número apropiado de células en placas de 6 pocillos para permitir que las células llegar a la confluencia del 90% en 48 h. mantener las células en una incubadora de laboratorio a 37 ° C, 5% CO₂y 95% de humedad.
2. Al día siguiente, cambiar los medios de comunicación a rojo de fenol libre medios complementado cuando sea necesario, incluyendo FBS despojado de dextrano inactivado con calor, carbón de leña.
   Nota: Las células pueden ser pretratadas en este momento dependiendo del diseño experimental.
3. En este momento, coloque el frasco de la matriz extracelular de 10 mg/mL (véase Tabla de materiales) en hielo y deje que se descongele en el refrigerador durante la noche.
4. Al día siguiente, fuentes de ensayo de invasión pre-enfriar colocando placas de 24 pocillos, cultivo celular insertos, tubos de microcentrífuga y puntas de pipeta en el refrigerador (4 ° C) durante al menos 2 h antes de trabajar con la matriz extracelular.
5. Usando provisiones refrigerados en la campana de cultivo de tejidos, diluir 10 mg/mL de matriz extracelular 1:1 con medios libre de rojo fenol, libre de suero para una concentración final de 5 mg/mL.
   Nota: Mantener siempre el stock y matriz extracelular diluida en el hielo. La proporción de matriz extracelular a los medios de comunicación puede ser ajustada en base a las propiedades de la línea celular utilizada en el ensayo.
6. Usando provisiones refrigerados en la campana de cultivo de tejidos, añada 100 μL de matriz extracelular diluida a los insertos (véase Tabla de materiales) que se han colocado en la placa de 24 pocillos. Asegúrese de que la matriz esté nivelada sin burbujas. Coloque la placa de 24 pocillos que contengan insertos recubiertos por la matriz en la incubadora a 37 ° C para permitir que la matriz a.
7. Para preparar las células para el ensayo de invasión, lavar las células con 1 mL de PBS 1 x, aspirar el PBS y agregar 500 μl de 1 x tripsina-EDTA a cada pocillo. Coloque la placa de 6 pozos en la incubadora de laboratorio mantenida a 37 ° C, 5% CO₂y 95% de humedad hasta que todas las células han separado de la parte inferior de la placa.
8. Una vez que las células se han separado, agregar 500 μl de medio libre de suero libre de rojo fenol en cada pocillo de las células trypsinized.
9. Transferencia 1.000 μl de células separadas para tubo de microcentrífuga y desactivación por 5 min a 400 x g a 4 ° C.
10. Aspire los medios de comunicación y resuspender las células en medio libre de suero libre de rojo fenol (el volumen dependerá de la concentración de células). Cuenta las células usando una célula automatizada contra (véase Tabla de materiales) y ajustan el volumen de la suspensión celular a una concentración final de 5 x 10⁵ células por mL.
    Nota: Un hemocitómetro y microscopio pueden usarse para contar las células.
11. Añadir 600 μL de medio de crecimiento completo a los pocillos de la placa de 24 pocillos que se utilizarán para el ensayo de invasión.
    Nota: Más atrayentes o tratamientos pueden añadirse al medio de crecimiento completo en el pozo (cámara inferior). Los experimentos se ha añadido vehículo (1 x PBS) o dexametasona de nM 100 diluido en 1 x PBS para la cámara baja.
12. Lugar el prelacado Inserte en cada pocillo que contenga medio de cultivo completo que se utilizará para el ensayo de invasión. Luego añadir 200 μL de células en la parte superior cada inserción celular prelacado (cámara alta) para un total de 1 x 10⁵ células.
    Nota: Como control negativo para este ensayo, un volumen igual de fenol rojo-suero-libre y medios de comunicación (sin células) se puede Agregar a la sala superior.
13. Coloque la placa de 24 pozos en la incubadora de laboratorio mantenida a 37 ° C, 5% CO₂y 95% de humedad durante 24 horas.
    Nota: El período de incubación de 24 h fue optimizado para las células inmortalizadas trofoblasto durante el primer trimestre y otras pruebas pueden ser necesario para determinar el período de incubación requerido en otras líneas celulares.
14. Después de incubación durante la noche, la succión de los restantes medios de comunicación de la cámara superior e inferior sin afectar a la matriz extracelular. Entonces, retire con cuidado la matriz extracelular y no invade las células de la parte superior del inserto con un hisopo aplicador tantas veces como sea necesario para quitar la matriz extracelular.
15. Lavado cada Inserte 3 veces con PBS 1 x, agregando PBS a las cámaras superiores e inferiores del pozo. Aspire PBS después de cada lavado.
16. Fijar las células Unidas a las inserciones colocando insertos en metanol helada 100% durante 30 min a 4 ° C. Lavado inserta 3 x 1 x PBS y quitar PBS después de lavado el final. Las células de los insertos por 10 min con violeta cristal de 0.2% en etanol al 20% de la mancha.
17. Enjuagar 3 veces con agua desionizada y aspirar agua desionizada después del último lavado.
18. Insertos de secado al aire durante 1 hora a temperatura ambiente. Utilizando pinzas y una navaja, corte cuidadosamente la membrana de la parte inferior del parte movible y montar en un portaobjetos de vidrio con la parte inferior hacia arriba. Permiten medios de montaje secar a temperatura ambiente.
19. Obtener al menos 4 imágenes únicas de las células invadidas por muestra con un microscopio de luz con un objetivo de 20 x. Contar el número total de células en cada imagen y normalizar el número de células control de muestras y esquemas de datos (figura 2).

4. proliferación ensayo

1. Siguiente paso 1.4, contar las células tripsinizaron del frasco usando un contador de células automatizado y semillas en placas de 6 pozos a una densidad de 2 x 10⁵ células por pocillo en medio de crecimiento estándar.
2. Colocar las células en una incubadora de laboratorio mantenida a 37 ° C, 5% CO₂y 95% de humedad durante 4 horas o hasta que las células se han adherido.
3. Medios de cambio a rojo de fenol libre de medios complementados según sea necesario, incluyendo FBS despojado de dextrano inactivado con calor, carbón de leña y añadir tratamiento deseado. Los experimentos se ha añadido vehículo (1 x PBS) o dexametasona de nM 100 diluido en 1 x PBS. Coloque las placas de 6 pozos en una incubadora de laboratorio mantenida a 37 ° C, 5% CO₂y 95% de humedad.
4. Quitar los medios de comunicación y reemplace con tratamiento y nuevos medios de comunicación cada 48 h.
5. Después de 24, 48 o 72 h tratamiento, lavar las células con 1 mL de 1 x PBS y agregar 500 μl de tripsina-EDTA a cada pocillo. Colocar placa de 6 pozos en incubadora hasta que las células han separado de la placa.
6. Una vez las células han desprendido de la placa, Añadir 500 μl de los medios libres suplementados de rojo de fenol para desactivar tripsina.
7. Añadir 5 μl de células tripsinizaron a 5 μl de azul tripán en un tubo separado y mezclar mediante pipeteo.
8. Contar las células de cada pozo por duplicado utilizando un contador de células automatizado.
9. Promedio del número de células por pocillo en cada punto del tiempo y la trama en función del tiempo (figura 3).

Las líneas de células inmortalizadas trofoblasto humano de primer trimestre Sw.71 y HTR-8/SVneo fueron utilizadas en estos experimentos para determinar el papel de los glucocorticoides en el trofoblasto celular migración¹². Glucocorticoides fueron utilizados en estos experimentos, como recientemente han demostrado para alterar las funciones del trofoblasto, aunque los tratamientos alternativos pueden ser utilizado¹². Ambas líneas celulares fueron tratados con el vehículo (1 x PBS) o 100 nM de la dexametasona (Dex) del glucocorticoide sintético para todos los experimentos. Tamaño y densidad de herida fueron medidos cada 2 h durante 72 h mediante un sistema de proyección de imagen automatizado, Time-lapse. La figura 1 muestra un ejemplo de imágenes y resultados obtenidos en el ensayo de rayado en diferentes puntos de tiempo. Se han proporcionado imágenes de la muestra de los puntos 0, 8 y 18 h de tiempo para ambos tratamientos (figura 1A). La densidad de la herida y el tamaño de la herida se graficaron con el tiempo para las muestras tratadas con control del vehículo (Veh) o 100 nM Dex (figura 1B). DEX el tratamiento redujo la velocidad de cierre de la herida por herida densidad y tamaño de la herida, lo que indica que los glucocorticoides inhiben la migración celular en células del trofoblasto en el primer trimestre.

La figura 2 muestra un ejemplo de imágenes tomadas de la célula cultura insertar tras el ensayo de invasión. Las células fueron tratadas durante 24 h con Veh o 100 nM Dex. Las células invadidas fueron contadas a partir de cuatro repeticiones independientes por tratamiento con cuatro campos de vista único por repetición. Tratamiento con glucocorticoides reduce la invasividad celular, como se muestra por una reducción del 15% en el número de células invadidas.

La figura 3 muestra un ejemplo del ensayo de proliferación celular. Las células fueron contadas en 24, 48 y 72 h después del tratamiento con Veh o 100 nM Dex. Tratamiento con glucocorticoides reduce la proliferación celular, según lo indicado por las células menos en cada momento. En general, estos ensayos demuestran que la exposición glucocorticoide reduce motilidad celular por inhibición de la proliferación celular y la invasión.

Figura 1: ensayo de rayado de la célula. (A) imágenes representativas de las heridas para Veh-Dex tratados y se muestran las células Sw.71 en 0, 8 y 18 h. Líneas rojas indican el tamaño de la herida. (B) herida tamaño densidad y herida se midió en células Sw.71 y HTR-8/SVneo tratadas con vehículo (Veh) o 100 nM Dex. Fotos fueron tomadas cada 2 h durante 72 h utilizando un microscopio automatizado, Time-lapse. Datos representan el promedio de cuatro repeticiones independientes ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: ensayo de invasión de la célula. Se realizaron ensayos de invasión con Sw.71 y HTR-8/SVneo de las células tratadas por 24 h con vehículo (Veh) o 100 nM Dex. (A) imágenes representativas del ensayo de invasión de células tratadas con Veh y Dex después de 24 h de incubación. Imagen de recuadro es control negativo sin las células a la cámara alta. Imágenes tomadas con 200 aumentos. Barras de escala son 120 μm. (B) invadido las células fueron contadas y los gráficos de barras representan la media normalizada de cuatro repeticiones independientes ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis de la proliferación de la célula. Las células SW.71 y HTR-8/SVneo trataron con vehículo (Veh) o 100 nM Dex fueron contados cada 24 h, usando un contador de células automatizado. Recuento se graficaron como la media ± SEM de al menos 11 independiente Replica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este procedimiento basa en el uso de migración y la invasión ensayos para incluir la tasa de proliferación celular como un colaborador potencial medidos diferencias en el movimiento de células de trofoblasto. Juntos, estos ensayos in vitro son métodos sencillos y eficaces que pueden utilizarse para identificar las vías celulares que regulan la migración del trofoblasto. Como se describió anteriormente, las células del trofoblasto pueden tratarse con hormonas, citoquinas, factores de crecimiento y otras moléculas para determinar su impacto en el movimiento de trofoblasto. Alternativamente, pueden agotar proteínas blanco de las células para dilucidar su papel funcional en la movilidad del trofoblasto. Identificar los principales moduladores de la migración del trofoblasto puede proporcionar una mejor comprensión de los mecanismos básicos subyacentes las complicaciones del embarazo relacionadas con defectos placentarios, como preeclampsia, restricción del crecimiento intrauterino y parto prematuro.

Hay varios pasos críticos en este protocolo que se requieren para obtener resultados precisos. Rojo de fenol tiene actividad estrogénica en las concentraciones utilizadas en medios de cultivo de célula¹³, es importante que medios de comunicación libres de rojo de fenol se utilizan para extremos experimentales para prevenir una activación indeseada de los receptores de estrógeno en las células. Durante el ensayo de invasión transwell, es importante asegurarse de que la matriz extracelular es homogénea, nivelada, y que fuentes de frío se utilizan para evitar la polimerización prematura de la matriz. Cuando se realizan los ensayos de proliferación y la invasión de la célula, es importante contar las muestras inmediatamente para evitar re adherencia de las células en placas de cultivo de tejidos. Se debe también tener en consideración que muerte celular debido a un tratamiento experimental puede influir en los resultados de los tres ensayos. Por lo tanto, los marcadores de la muerte celular (por ejemplo, liberación de lactato deshidrogenasa, externalización de fosfatidilserina o degradación del ADN) en respuesta al tratamiento deben ser evaluados en la línea celular experimental antes de la evaluación de la migración, invasión, y proliferación¹⁴. Existen algunas limitaciones para estos ensayos, por ejemplo, el proceso de crear una herida en una monocapa de células induce una respuesta de la lesión de la célula que pueden confundir el proceso de migración celular. Además, el raspado manual puede introducir variabilidad interexperiment, aunque utilizando una herramienta de herida-maker que crea heridas uniformes anchuras puede mitigar parcialmente esta limitación. La desventaja de la prueba de la invasión es que es un ensayo de punto final, y la cinética del movimiento no se logran fácilmente. A pesar de estas limitaciones, los ensayos aquí descritos proporcionan datos cuantitativos, reproducibles en un costo relativamente bajo.

Los ensayos aquí descritos pueden modificarse también para medir la migración celular en otros tipos celulares, aunque estos análisis no sería adecuados para los tipos de células no adherentes. En el ensayo de rasguño, los intervalos de proyección de imagen de microscopía de Time-lapse pueden ajustarse para captar suficientemente las diferencias en la tasa de migración de la célula. Sistemas automatizados para la proyección de imagen viva de la célula pueden captar imágenes tan frecuentemente como cada 15 minutos imágenes tomadas por lo menos cada 30 min se suturan para crear una película de cicatrización de la herida del tamaño de la herida. En el ensayo de invasión, la concentración de la matriz extracelular, el número total de células sembradas, y la duración de incubación antes de la fijación y el recuento de las células puede ajustarse para tener en cuenta la velocidad específica de la invasión en diferentes tipos celulares. En el ensayo de proliferación celular, el número de células sembradas sobre las placas y los puntos del tiempo para el recuento celular puede ajustarse para tener en cuenta diferentes tasas de crecimiento de la célula. En general, estos ensayos son herramientas flexibles y muy accesibles que pueden utilizarse en una amplia gama de tipos de la célula para identificar los mecanismos subyacentes de la migración de la célula.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores agradecen a Dr. Gil Mor para proporcionar las células Sw.71. Esta investigación fue apoyada por un Premio Albert McKern erudito para S.W.