Amplificación de cerca integrales provirus VIH-1 para secuenciación de próxima generación

La secuencia proviral individual completa (FLIPS) proporciona un método eficiente y de alto rendimiento para la amplificación y secuenciación de sola, cerca de larga duración (intactos y defectuosos) de provirus de HIV-1 y permite la determinación de su potencial capacidad de replicación. FLIPS supera limitaciones de anteriores ensayos diseñados para secuenciar la reserva latente de VIH-1.

El ensayo de largometraje individuales Proviral secuenciación (FLIPS) es un método eficiente y de alto rendimiento diseñado para amplificar y secuencia única, cerca de provirus de HIV-1 (intactos y defectuosos), integrales. FLIPS permite la determinación de la composición genética del HIV-1 integrado dentro de una población celular. A través de la identificación de defectos dentro de secuencias de HIV-1 proviral que ocurren durante la transcripción inversa, tales como canceladuras internas grandes, codones de parada deletéreos/hipermutación, mutaciones del mutágeno ' frameshift ' y mutaciones/deleciones en cis elementos temporarios requeridos para la maduración del virión, tirones pueden identificar provirus integrados capaces de replicación. El análisis de saltos pueden ser utilizado para identificar el provirus de HIV-1 que carecen de estos defectos y por lo tanto son potencialmente réplica-competente. Consiste en el protocolo de FLIPS: lisis de células infectadas por VIH-1, nested PCR de cerca integrales provirus VIH-1 (usando las cartillas para el VIH-1 5' y 3' LTR), purificación de DNA y cuantificación, preparación de biblioteca para Next generation Sequencing (NGS), NGS, Asamblea de novo de contigs proviral y un simple proceso de eliminación para identificar provirus réplica-competente. FLIPS ofrece ventajas sobre los tradicionales métodos diseñados para secuencia integran provirus VIH-1, como la secuencia proviral solo. FLIPS amplifica secuencias cerca de provirus integrales permitiendo la competencia de replicación que se determinará y también utiliza menos los cebadores de amplificación, previniendo las consecuencias de los desajustes de la cartilla. FLIPS es una herramienta útil para la comprensión del paisaje genético de provirus de HIV-1 integrados, especialmente dentro del reservorio latente, sin embargo, su utilización se puede extender a cualquier aplicación en que se requiere la composición genética del HIV-1 integrado.

Caracterización genética de la reserva latente de VIH-1, que persiste en personas en tratamiento antirretroviral a largo plazo (ART), ha sido vital para la comprensión de que la mayoría de los provirus integrados es defectuosos y replicación incompetente^{1 , 2}. durante el proceso de transcripción reversa, se introducen errores en la secuencia proviral integradora. Algunos mecanismos que generan secuencias proviral defectuosas incluyen los errores de enzima de transcriptasa inversa de VIH-1³, plantilla de conmutación⁴o^5,de hipermutación APOBEC inducido⁶. Dos estudios recientes han encontrado que aproximadamente el 5% del provirus VIH-1 aisladas de individuos en el arte a largo plazo son genéticamente intacto y potencialmente réplica-competente y puede contribuir a la rápida recuperación en los niveles plasmáticos de VIH-1 sobre el abandono del hábito de arte ^{1 , 2 , 7}. los estudios anteriores han identificado que provirus VIH-1 réplica-competente persisten en ingenuo y la reclinación memoria CD4⁺ T subconjuntos (incluyendo central, transicional y células de memoria T efectoras), indicando la importancia de la célula dirigidos a estas células en el futuro estrategias de erradicación^2,8,9.

Primeras ideas sobre la distribución, dinámica y mantenimiento de la reserva latente de VIH-1 fueron alcanzados mediante la utilización de métodos de secuenciación solo proviral (SPS) que genéticamente caracterizar regiones sub-genómicas del VIH-1 genoma^{10 ,11,12,13}. SPS es una herramienta versátil, capaz de secuenciar un provirus VIH-1 solo desde dentro de una sola célula infectada. Sin embargo, MSF es incapaz de determinar la capacidad de replicación de provirus, ya que sólo secuencias de sub-genomic provirus regiones y falta que contienen grandes deleciones dentro de sitios de unión del cebador. Un estudio anterior ha demostrado que SPS sobreestima el tamaño del depósito réplica-competente de 13 a 17 veces por secuenciación selectivamente las regiones sub-genómica intacta².

Para abordar las limitaciones de los SP, Ho et al. ⁴ y Bruner et al. ¹ desarrollado análisis de la secuencia cerca de larga duración provirus VIH-1. Esto permitió que la frecuencia de provirus de HIV-1 genéticamente intactos y potencialmente réplica-competente, en los individuos en el arte a largo plazo a ser determinado. Estos ensayos amplificado y secuenciado (vía Sanger secuenciación) sub-genomic regiones que luego se ensamblaron para obtener un provirus de HIV-1 secuencia del (intacta o defectuoso). Tres limitaciones de este enfoque son: 1) el uso de cebadores de secuencia múltiple aumenta el riesgo de involuntariamente introducir defectos en la secuencia proviral, 2) cartilla desajustes pueden prevenir la amplificación de provirus particular y 3) a menudo el toda secuencia proviral no puede resolverse debido a la tecnicidad de estos métodos.

Para superar las limitaciones de los ensayos de la secuencia proviral de VIH-1 integrales existentes, hemos desarrollado el Full -Length yoindividual Proviral Sequencing (FLIPS) ensayo. FLIPS es una secuenciación de próxima generación (NGS)-ensayo basado que amplifica y secuencias cerca de larga duración (intactas o defectuosos) de provirus VIH-1 de una manera eficiente y de alto rendimiento. FLIPS proporciona ventajas sobre el análisis anteriores, ya que limita el número de iniciadores utilizados; por lo tanto, disminuye la probabilidad de la cartilla desajustes, que pueden limitar la población de provirus capturaron o defectos sin querer introducen una secuencia viral. FLIPS también menos técnicamente es difícil que los anteriores y consiste en 6 pasos principales: células de lisis 1), de infectados por VIH-1, 2) la amplificación de solo provirus VIH-1 por PCR anidada realizada en limitación de dilución utilizando primers específicos para el altamente conservado HIV-1 5' y la región 3' LTR U5 (figura 1A), 3) purificación y cuantificación de productos amplificados, 4) preparación de la biblioteca de provirus amplificados para NGS, 5) NGS y 6) Asamblea de novo de provirus secuenciados para obtener contigs de cada uno los provirus.

Secuencias generadas por tirones pueden someterse a un riguroso proceso de eliminación para identificar a los que son genéticamente intacto y potencialmente réplica-competente (figura 1)². Provirus intactos genéticamente carecen de todos los defectos conocidos que resultan en la generación de un provirus replicación incompetente. Estos defectos incluyen: secuencias de la inversión, canceladuras internas grandes, codones de parada hypermutation/deletéreos, mutágeno ' frameshift ' o mutaciones en el 5' empaquetado mayor o señal empalme sitio dispensador de aceite (MSD).

Figura 1: pasos críticos en el análisis de la secuencia proviral individuales completos (FLIPS). (A) genoma de ADN de VIH-1 con sitios de unión de cartilla en 5' y 3' regiones U5 litros utilizados por tirones para amplificar cerca de larga duración (defectuosas e intactos) VIH-1 provirus por PCR anidada. (B) diseño de una placa PCR de 96 pocillos que contienen 80 pozos de muestra (20 pozos para cada dilución), 4 pozos de control negativo y control positivo 1 bien. (C) proceso de eliminación para identificar genéticamente intactos y potencialmente réplica-competente, provirus VIH-1. Esta figura ha sido modificada desde Hiener et al. ² . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por las juntas de revisión institucional de la Universidad de California en San Francisco y el distrito de salud de Western Sydney Local, que incluye el Instituto de Westmead para investigación médica.

1. lisis de células infectadas por VIH-1

Nota: Las células pueden ser aisladas de sangre periférica, leukapheresis muestras, biopsia de médula ósea o biopsia de tejido. Poblaciones celulares pueden ordenarse mediante celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación.

1. Preparar un tampón de lisis que contiene 10 mM Tris-HCl 0,5% Nonidet P–40, 0,5% Tween-20 y proteinasa K. de 0.3 mg/mL A un sedimento de celulares, añadir 100 μl de tampón de lisis por 1 x 10⁶ células. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar a 55 ° C durante 1 hora seguida de 85 ° C durante 15 min para lyse las células y liberar ADN genómico para la amplificación por PCR.
   Nota: La lisis celular son suficiente para obtener ADN genómico para la amplificación. No se requiere de ADN o purificación. El protocolo se puede detener en este punto y ADN genómico puede ser almacenado a-20 ° C indefinidamente.

2. amplificación de ADN de VIH-1 solo provirus por PCR anidada

1. Mezclar los reactivos de la primera ronda de PCR (PCR1) listados en la tabla 1 (véase Tabla de materiales). Añadir 38 μl de la mezcla principal a 85 pozos (80 muestras, 4 controles negativos, 1 control positivo) de una placa PCR de 96 pocillos (siga el trazado en la figura 1B). Designar esta placa 'PCR1'.

Tabla 1: Volúmenes y reactivos para PCR master mezclas.

Nota: Los iniciadores utilizados para PCR1 son:
BLOuterF: 5'-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3' (HXB2 posición 623-649)
BLOuterR: 5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3' (HXB2 posición 9662-9686)

2. Después de preparar la mezcla principal, mueva la placa PCR1 a un área limpia para la incorporación de la DNA genomic.
   1. ADN genómico en serie diluido de 1:3 para 1:81 con Tris-HCl (5 mM, pH 8), preparación 45 μl de cada dilución (suficiente para 20 pozos para cada dilución). Añadir 2 μl de ADN genómico diluido a cada muestra bien y 2 μl de Tris-HCl (5 mM, pH 8) para cada control negativo bien (siga el trazado en la figura 1B). Selle todos los pocillos de la placa PCR1, excluyendo el positivo controlan el pozo, con una junta adhesiva del claro (véase Tabla de materiales).
      Nota: Las diluciones recomendadas anteriormente sólo sirven como una guía inicial para determinar la dilución de punto final. Las diluciones dependerá de la concentración de ADN de VIH-1 integrado dentro de las muestras.
3. Mueva a un área designada para la adición del control positivo. Añadir 2 μl de control positivo (pNL4-3 diluido a 10⁵ copias/μL) para el control positivo de la placa PCR1 y sello de la placa. Girar brevemente la placa PCR1 en un spinner de la placa PCR o centrífuga (400 x g durante 10 s a temperatura ambiente) para tirar abajo cualquier contenido residual de los lados de los pocillos.
4. Ejecutar la placa PCR1 en un termociclador: 94 ° C por 2 min; luego de 94 ° C por 30 s, 64 ° C por 30 s, 68 ° C durante 10 minutos para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 61 ° C por 30 s, 68 ° C durante 10 minutos para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s, 68 ° C durante 10 minutos para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 68 ° C durante 10 minutos para ciclos de 21; entonces 68 ° C 10 minutos (total de 30 ciclos). Mantener a 4 ° C.
   Nota: Puede detener aquí el protocolo y la placa PCR1 mantuvieron a 4 ° C durante 2 días.
5. Mezclar los reactivos para la segunda ronda de PCR (PCR2) listados en la tabla 1. Añadir 28 μl a los 85 pocillos (80 muestras, 4 controles negativos, 1 control positivo) de una nueva placa de PCR de 96 pocillos (siga el trazado en la figura 1B). Designar esta placa 'PCR2'.

Nota: Los iniciadores utilizados para PCR2 se encuentran:
275F: 5'-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3' (HXB2 posición 646-666)
280R: 5'-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3' (HXB2 posición 9650-9676)

6. Girar brevemente la placa PCR1 en un spinner de la placa PCR o centrífuga (400 x g durante 10 s a temperatura ambiente) para tirar abajo cualquier contenido residual de los lados de los pocillos. Añadir 80 μl de Tris-HCl (5 mM, pH 8) a cada pocillo de la placa PCR1.
   1. Transferencia de 2 μl de la PCR1 placa a la placa de PCR2 usando una pipeta multicanal. Asegurar que las muestras se transfieren bien para bien (es decir, 2 μl de bien A1 de PCR1 placa es transferida al bien A1 de PCR2 placa). Sellar la placa de PCR2 con una junta adhesiva del claro (véase Tabla de materiales).
   2. Girar brevemente la placa PCR2 en un spinner de la placa PCR o centrífuga (400 x g durante 10 s a temperatura ambiente) para tirar abajo cualquier contenido residual de los lados de los pocillos. Selle la placa PCR1 con una soldadura de film para almacenamiento a largo plazo a-20 ° C (véase Tabla de materiales).
7. La placa PCR2 se ejecutan en un termociclador: 94 ° C por 2 min; luego de 94 ° C por 30 s, 64 ° C por 30 s, 68 ° C durante 10 minutos para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 61 ° C por 30 s, 68 ° C durante 10 minutos para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s, 68 ° C durante 10 minutos para 3 ciclos; 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 68 ° C durante 10 minutos para ciclos de 31; entonces 68 ° C 10 minutos (total de 40 ciclos). Mantener a 4 ° C.
   Nota: Puede detener aquí el protocolo y la placa PCR2 mantuvieron a 4 ° C durante 2 días.
8. Brevemente, haga girar la placa PCR2 en un spinner de la placa PCR o centrifugar para bajar cualquier contenido residual de los lados de los pocillos. Añadir 60 μL de Tris-HCl (5 mM, pH 8) a cada pocillo con una pipeta multicanal.
   1. Ejecutar 15 μl de cada pocillo en pozo de 2 x 48 piezas prefabricado 1% geles de agarosa con bromuro de etidio (0.1\u20120.3 μg/mL, ver Tabla de materiales). Utilice una escalera con un rango de hasta 10 kb (véase Tabla de materiales). Visualizar para identificar los pozos que contienen el producto amplificado y sus tamaños aproximados. Guarda la imagen del gel.
      Nota: Asegúrese de que el control positivo contiene bien el producto amplificado. Si los pozos de control negativo contienen producto amplificado, considerar contaminación y descartar la placa.
9. Determinar la dilución a la cual no más del 30% de los pozos son positivo para el producto amplificado.
   Nota: Esta es la dilución de punto final en la que la mayoría (80%) de los pozos contienen producto amplificado de una sola plantilla. Esta dilución debe preparada y utilizada en posteriores PCRs para obtener amplicones proviral. Anote el tamaño aproximado de cada producto amplificado.

3. cuantificación y purificación de ADN

1. Brevemente, haga girar la placa PCR2 en un spinner de la placa PCR o centrifugar para bajar cualquier contenido residual de los lados de los pocillos. Transferencia de 40 μl de los pozos que contienen producto amplificado (en o por debajo de la dilución de punto final) a una placa de 96 pocillos midi nuevo (con un volumen bien de 0,8 mL, ver Tabla de materiales).
   Nota: Anote la original y nueva bien posición de cada producto amplificado en una hoja de cálculo como un registro de cada producto amplificado para ser secuenciado.
2. Purificar el amplificado productos de ADN usando una grano magnético basado en PCR purificación kit (véase tabla de materiales) para quitar cebadores, nucleótidos, enzimas, aceites y sales. Antes de empezar, poner bolas magnéticas a temperatura ambiente y preparar etanol al 80% fresco. Usar puntas de pipeta nueva cuando sea necesario evitar la contaminación cruzada de muestras de ADN.
   1. Bolas magnéticas de vórtice para asegurarse de que están completamente suspendidas. Usando una pipeta multicanal, agregar 40 μl de granos a 40 μl del producto amplificado en la placa de 96 pocillos midi de 0,8 mL. Pipetee suavemente arriba y abajo 10 veces para mezclar. Alternativamente, mezclar la solución de sellado de la placa de agitación en un agitador de microplacas a 1.800 rpm por 2 min incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos después.
   2. Coloque el plato en un magnético soporte (véase Tabla de materiales) para 2 minutos retirar y desechar sobrenadante.
   3. Lavar los granos mediante la adición de 200 μL de etanol al 80% a cada pocillo con la placa en el soporte. Incubar a temperatura ambiente durante 30 s. Quite y descarte el sobrenadante. Repetir una vez. Utilizando una pipeta multicanal con puntas finas, retire cualquier exceso etanol después del segundo lavado. Con la placa en el soporte, seque los granos al aire durante 15 minutos.
   4. Retire la placa del soporte. Añadir 30 μl de tampón de elución (véase Tabla de materiales) a cada pocillo. Pipetee suavemente arriba y abajo 10 veces para mezclar. Alternativamente, mezclar la solución de sellado de la placa de agitación en un agitador de microplacas a 1.800 rpm por 2 min incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos después.
   5. Colocar la placa sobre un soporte magnético para 2 minutos usando una pipeta multicanal, transferir 25 μl del sobrenadante (DNA purificado) a una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Asegurar que las muestras se trasladan bien a bien (es decir, sobrenadante de A1 bien en chapa de 0.8 mL se transfiere al pocillo A1 de la nueva placa de 96 pocillos).
      Nota: 5 uL de la muestra eluída se quede atrás para no garantizar la transferencia de granos residuales de la purificación.
3. Determinar y registrar la concentración aproximada de cada producto amplificado de DNA tras purificación utilizando un espectrofotómetro (absorbancia a una longitud de onda de 260 nm).
   Nota: Medir la concentración aproximada de cada producto amplificado es necesario en esta etapa que no muestras se pierden durante los pasos de purificación y que la concentración aproximada dentro de la gama de la curva estándar utilizada en la siguiente etapa ( 0.001 a 1 ng/μl de ADN en 100 μl de volumen). El protocolo se puede detener aquí y limpiar las muestras pueden almacenarse a-20 ° C hasta por 6 meses.
4. Cuantificar la concentración de ADN de cada producto purificado mediante una cuantificación de dsDNA kit (véase tabla de materiales).
   Nota: Se trata de usar una curva estándar para determinar la concentración de dsDNA en una muestra. El kit incluye buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), un estándar de dsDNA de lamda y un tinte fluorescente. Mantenga todos los reactivos en el hielo. Cubrir el tubo que contiene el tinte con papel aluminio para evitar la exposición a la luz. Medir la concentración de cada producto amplificado por triplicado.
   1. Tampón diluido a 1 x en estéril DNasa libre H₂O. Añadir 99 μl de buffer a un número adecuado de pozos vacíos (3 veces el número de productos amplificados a medir, ver tabla 2 para un diseño de ejemplo) de una placa de cultivo de tejidos de fondo plano. Añadir 100 μl de buffer a 3 pozos en blanco.
   2. Para que cada producto amplificado para medirla, añadir 1 μl de DNA purificado (del paso 3.2.5) por triplicado a cada bien que contiene tampón (ver tabla 2 para un diseño de ejemplo).
   3. Para preparar las normas, diluir 10 veces lamda dsDNA de 2 ng/μl a 0.002 ng / μl. 100 μl de cada dsDNA estándar a 3 pozos.
      Nota: Siguiente paso 3.4.4, la concentración final de las normas que van desde 1 a 0,001 ng/μl
   4. Diluir el colorante fluorescente 1: 200 con el tampón. Rápidamente añadir 100 μl a cada uno que también contiene normas, espacios en blanco y muestra. De la mezcla hacia arriba y hacia abajo con una pipeta. Cubra la placa con papel aluminio para evitar el contacto con la luz.
   5. Leer la emisión en un lector de microplacas de fluorescencia (excitación a 480 nm, emisión a 520 nm). Registro de resultados en una hoja de cálculo.
   6. Determinar la concentración de dsDNA en cada muestra usando las medidas de la fluorescencia. Restar la fluorescencia en los pocillos del blanco de la muestra y los estándares. Determinar la fluorescencia media para cada muestra y el patrón de los triplicados. Dibujar una curva estándar basada en las mediciones de fluorescencia de las normas. Determinar la concentración de las muestras con respecto a los estándares.

Tabla 2: Esquema de ejemplo de placa de 96 pocillos para la cuantificación de dsDNA.

5. Diluir cada producto purificado (obtenido en paso 3.2.5) con H₂O a 0,2 ng/μl.

4. secuencia biblioteca elaboración

1. Preparar ADN proviral amplificado y purificado para NGS utilizando una preparación de biblioteca NGS DNA kit (véase Tabla de materiales). Siga las instrucciones del fabricante para todos los tagmentation, amplificación por PCR y los pasos de limpieza [excepto que los volúmenes de reacción incluyendo entrada ADN (de paso 3.5) pueden ser reducido a la mitad para ampliar el uso de reactivos de preparación de biblioteca].
2. Normalizar bibliotecas manualmente mediante una cuantificación de biblioteca basada en qPCR NGS kit (véase Tabla de materiales) para determinar la concentración individual de provirus. Combinar las bibliotecas individuales de provirus en cantidades equimolares a una concentración final de 4 nM, o como especificado por el proveedor de servicios de secuenciación.
   Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí y la biblioteca agrupada almacenado a-20 ° C.
3. Cuantificar la biblioteca combinada final utilizando el mismo kit de cuantificación de dsDNA utilizado en el paso 3.4. Siga las instrucciones del fabricante. Determinar las longitudes promedio fragmento ejecutando 1 μl de la biblioteca agrupada en un sistema de electroforesis automatizada usando un kit (véase la Tabla de materiales). Utilice la concentración y longitudes de fragmento promedio para determinar la molaridad de la biblioteca combinada.
4. Combina 5 μl de la biblioteca combinada con 5 μl de 0.2 N NaOH para desnaturalizar la biblioteca. Añadir 5 μl de 200 mM Tris-HCl para neutralizar. Diluir la biblioteca final a 12:05 con tampón de hibridación refrigerado (disponible con el kit de preparación de la biblioteca de DNA) inmediatamente antes de la secuencia.
5. Realizar la secuencia del extremo apareado nucleótido (nt) 2 x 150 en una plataforma adecuada de NGS (véase Tabla de materiales).
   Nota: Cuando 96 bibliotecas proviral están indexadas por ejecutar, esto rinde aproximadamente 20 millones extremo apareado lecturas por ejecutar o 200.000 lecturas por biblioteca de provirus individuales para análisis que demultiplexa. Medidas 4.4 y 4.5 se realizan normalmente por un centro de secuenciación.

5. Asamblea de Novo del provirus VIH-1 secuenciadas

Nota: Para obtener la secuencia genética de cada provirus amplificado, contigs están reunidos de nuevo el extremo apareado Lee. Muchas plataformas (por ejemplo, Banco de trabajo de genómica CLC¹⁴) permiten el diseño de flujos de trabajo personalizados para el montaje de novo . Otro software de código abierto como FastQC¹⁵, Trimmomatic¹⁶, Cutadapt¹⁷y¹⁸ de FLASH también puede ser utilizado para procesamiento de lecturas, así como herramientas como Bowtie2¹⁹ y espadas²⁰ para leer mapas y de novo Asamblea. Los pasos para el montaje de novo de VIH-1 contigs usando una plataforma comercial específica (véase la Tabla de materiales) se describen a continuación (figura 2). Archivo de flujo de trabajo modificado para requisitos particulares está disponible a petición.

1. Importar secuencias y comprobar la calidad: importar la secuencia de pares Lee (formato fastq.gz) en el software, que luego se combinarán como único conjunto de lecturas emparejadas. Generar una secuencia de informe de control de calidad y examinar la calidad de sus datos.
2. Control de calidad
   1. Realizar lectura de corte según el informe de control de calidad. Retire cualquier adaptador secuencias y nucleótidos ambiguos. Recortar 15 5' y dos 3' terminal nucleótidos. Descarte dice menos de 50 nucleótidos de longitud. Utilice un límite de calidad de 0.001 correspondiente a una puntuación de phred de control de calidad de 30.
3. Fusión de pares superpuestos
   1. Forma solo Lee extendida por la fusión de pares hacia adelante y atrás Lee con la superposición de las regiones.
4. Asamblea de novo
   1. Utilice el ensamblador de novo de genómica CLC nativo con un tamaño de palabra (o k-mer) de 30 nt y un tamaño máximo de la burbuja de 65 nt para montar una submuestra aleatoria de 10.000 lecturas emparejadas no superpuestos. La cobertura esperada para el contig de novo montado es x ~ 200 para una secuencia de ~ 9 kb.
      Nota: Este submuestreo puede reducir la carga computacional que la mayoría de las computadoras de escritorio pueden manejar la Asamblea y el análisis y dado el clonality de cada provirus (una biblioteca es un provirus), esto no limita la diversidad.
5. Re-mapping todas las lecturas de contigs
   1. Para obtener la secuencia de consenso de la mayoría final de cada provirus, mapa de la lectura completa en el contig de novo montado. Acepte sólo contigs con una cobertura promedio mínima de 1.000 x y asegurar que la longitud final contig corresponde al tamaño de la banda en el gel de agarosa original (paso 2.8.1). Guardar la secuencia de consenso de la mayoría final como un archivo .fasta.
      Nota: La mayoría contigs se pueden montar con los pasos anteriores. Sin embargo, en algunos casos, para un único provirus, se montan contigs múltiples con un cobertura similar. En estas circunstancias, contigs están alineados a una próxima larga duración (~ 9 kb) secuencia de consenso de los mismos participantes y montado manualmente en un contig único. Todas las lecturas se asignan entonces a contig montado manualmente y el consenso final aceptado si leer la cobertura es uniforme a lo largo de la Asamblea y no solo nucleotide polimorfismos (SNPs) > 40% están presentes.
6. Más control de calidad
   1. Pantalla Lea para cada contig representa un provirus sola y no es debido a la amplificación de múltiples provirus dentro de un solo pozo, cobertura y la llamada variante de contig final.
   2. Múltiples plantillas proviral presentes durante la PCR se identifican a menudo con cobertura lea muy desigual (debido a la amplificación conjunta de provirus de diferentes tamaños) cuando mapeo a un consenso integral desde el mismo participante, o por la presencia de SNP con un frecuencia de > 40% (ver resultados representativos, figura 4). Caso omiso de poblaciones mixtas en análisis posteriores.
7. Alineación
   1. Importar el consenso final de cada secuencia proviral en secuencia ver software como Molecular evolutiva genética análisis (MEGA) 7²¹. Alinee cada secuencia manualmente para la secuencia de referencia HXB2. Recortar 5' y 3' extremos a las posiciones 666-9650 de HXB2 quitar secuencias de la cartilla.
   2. Exportar la lista de secuencia en formato fasta y luego alinear usando MAFFT versión 7²², con edición manual, en su caso obtener la alineación final.
      Nota: Si cualquier secuencia no se alinea, primero invierta la secuencia del complemento. Si la secuencia no se alinea todavía realizar una búsqueda BLAST para asegurar que la secuencia sea VIH-1. Es posible amplificar plantillas de VIH-1 y éstos se pueden identificar en esta etapa. Si las secuencias son VIH-1 pero no se alinean, considerar la presencia de inversiones (ver paso 6.1).

6. determinación del potencial competencia de la replicación de HIV-1 Proviral secuencias

Nota: Para identificar secuencias de genéticamente intacto y potencialmente réplica-competente, provirus VIH-1 que es un riguroso proceso de eliminación seguida (figura 1). Proviral secuencias falta inversiones, canceladuras internas grandes, deletéreas parada codones / hipermutación, frameshift mutaciones o defectos en la señal de sitio o embalaje de MSD se consideran genéticamente intacto y potencialmente réplica-competente.

1. Inversiones de
   1. Durante la etapa de alineación, identificar las inversiones. Inversiones son regiones donde la secuencia no se alinea a la referencia HXB2 a menos que la región es inversa complementa.
      Nota: Dependiendo de la aplicación de los datos, secuencias que contienen inversiones deba ser omitido del análisis.
2. Grandes deleciones internas
   1. Identificar contigs con canceladuras internas grandes (> 600 bp) en la etapa de alineación. A menos que la supresión se asienta en nef, la secuencia puede definirse como defectuoso.
      Nota: Cualquier secuencia con las canceladuras internas < 600 bp se identificará por Gene Cutter (paso 6.3.1) como secuencias de genes incompletos.
3. Codones de parada deletéreos, frameshift mutaciones y deleciones
   1. Compruebe todos los contigs de longitud > 8400 nucleótidos para la presencia de codones de parada deletéreos, mutágeno ' frameshift ' y secuencias de genes incompletos usando el Los Alamos Nacional laboratorio VIH secuencia de base de datos gen cortador herramienta²³.
      Nota: La herramienta Gene Cutter divide la secuencia proviral en los genes gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env y nefy traduce a aminoácidos. Gene de Cutter y pantallas para la presencia de codones de parada y las mutaciones del mutágeno ' frameshift ' (debido a inserciones o deleciones). Contigs que contienen codones de parada o mutágeno ' frameshift ' en cualquier gen, excepto nef²⁴, se clasifican como defectuosos. Gene de Cutter también identifica secuencias de genes incompletos y cualquier provirus con una canceladura < 600 PB en un gen distinto nef puede reclasificado como defectuoso debido a una canceladura interna grande.
4. Hypermutation
   1. Generar un consenso de las restantes secuencias de larga duración proviral utilizando el Los Alamos Nacional laboratorio VIH secuencia base de datos consenso máquina herramienta (fabricante del simple consenso)²⁵. Agregue la secuencia de consenso a la parte superior de una alineación que contiene sólo las restantes secuencias proviral integrales. Usando esta alineación y la herramienta de Los Alamos Nacional laboratorio VIH secuencia base de datos Hypermut²⁶ identificar inducida APOBEC hypermutation G-A en la secuencia proviral larga duración restante.
5. Defectos en la MSD y empaquetado
   1. Inspeccione cada uno de los contigs restantes para defectos en el MSD y la señal de empaquetado (HXB2 región 670-810) que hacen la secuencia proviral defectuosos⁴. Busque una mutación de punto en el sitio MSD (secuencia GT, HXB2 744-745) o cualquier canceladura en los cuatro bucles de la señal de embalaje del tallo (SL1 SL2 (HXB2 691-734), (HXB2 736-754), SL3 (HXB2 766-779) y SL4 (HXB2 790 810)).

El ensayo de FLIPS amplifica y secuencias individual, cerca de larga duración provirus VIH-1. El protocolo consiste en 6 pasos para obtener cerca de secuencias proviral integrales. Estos pasos incluyen: infectaron por lisis de las células, polimerización en cadena jerarquizada de larga duración (intactos y defectuosos) de provirus VIH-1, purificación de DNA y cuantificación, secuencia de preparación de la biblioteca, NGS, y montaje de novo de secuenciado provirus. Al final de cada paso puede ser considerado un puesto de control en el que puede evaluarse la calidad del producto (e.g. amplificado ADN, el ADN purificado, biblioteca de la secuencia o secuencia) antes del siguiente paso. Un resumen de la evaluación realizada al final de cada paso y los resultados esperados se describe a continuación.

Después de la polimerización en cadena jerarquizada, productos amplificados se ejecutan en un gel de agarosa al 1% (figura 3). La calidad inicial de la PCR se puede determinar por la inspección de los controles positivos y negativos. Pozos de control negativo que contiene el producto amplificado indican contaminación y pozos de control positivo ausente del producto amplificado indican la amplificación insuficiente. A continuación, pozos que contienen producto amplificado se seleccionan para la secuencia. Para evitar pozos que contienen mezclas de múltiples provirus amplificados, se consideran sólo pozos que contienen producto amplificado en dilución de punto final para la secuencia. Según la distribución de Poisson, la dilución de punto final se encuentra al 30% de los pozos son positivo para el producto amplificado. A esta dilución, hay un 80% la oportunidad de estos pozos contienen un único provirus amplificado. Además, pozos que contienen múltiples provirus amplificados de diferentes longitudes se pueden visualizar en esta etapa como múltiples bandas aparecerán en el gel. Estos pozos no deben seleccionarse para la secuencia (figura 3).

Tras la purificación de los provirus amplificados para secuenciación, cuantificación asegura que ninguna DNA proviral se pierde durante la etapa de purificación. Si la concentración de ADN de un provirus amplificado es < 0,2 ng/μl, la muestra restante en la PCR2 placa puede ser purificada. Un control similar ocurre después de la preparación de la biblioteca, en la que se cuantifica cada biblioteca individual. Esto asegura provirus individuales han sido correctamente fragmentados, Tags y amplificada antes de la secuencia. Bibliotecas proviral individuales son agrupadas en cantidades equimolares a una concentración final de la biblioteca de 4 nM (o como especificado por el proveedor de secuenciación). Si la concentración de una biblioteca proviral individual es demasiado baja, puede ser excluido de la piscina de la biblioteca de la secuencia, o la biblioteca individual preparado otra vez. Una verificación final de la concentración de la biblioteca combinada se realiza antes de la secuencia junto con confirmar la longitud media del fragmento.

Medidas de control de calidad antes de la etapa de montaje de novo asegura la calidad de la Lee solía montar el final contig proviral. Estos pasos incluyen: eliminación de secuencias de adaptador, corte de 5' y 3' nucleótidos, un límite de calidad y haciendo caso omiso de lecturas cortas. CLC genómica Workbench puede proporcionar informes de control de calidad que pueden utilizarse antes de evaluar la calidad inicial de los ajustes de recorte guía y Lee y entonces después de determinar si el ajuste fue suficiente para eliminar regiones de baja calidad. Además, para el montaje de novo , evaluó la calidad de los contigs montado puede ser de suficiente profundidad (> 1000 X) y de la uniformidad de la cobertura (Figura 4A). Poblaciones mixtas pueden identificarse también en esta etapa. Mezclas de provirus múltiples de larga duración (~ 9 kb) se identifican por la presencia de múltiples SNPs con una frecuencia de más de 40%, mientras que mezclas de corto (contiene una canceladura grande interna) y larga duración provirus pueden ser identificados por desigual Lea la cobertura de después de asignación para una referencia completa del misma participante (Figura 4B).

Dependiendo de la aplicación, la alineación final se puede visualizar usando herramientas como ggtree disponible como un paquete de "R: A lenguaje y entorno para computación estadística"²⁷. En un reciente estudio, se utilizó tirones a provirus secuencia VIH-1 de ingenuo, central, transición y efectoras memoria CD4⁺ T células aisladas de individuos en el arte a largo plazo, con el objetivo de identificar si los subconjuntos de la célula particular demostraron mayor proporciones de HIV-1 genéticamente intacto y potencialmente réplica-competente². Aquí, la representación visual de las secuencias aisladas de un participante de este estudio (participante del 2026) se presenta (figura 5). Este participante, la mayoría (97%) de las secuencias era defectuosa, con secuencias intactas encontradas efectoras y de memoria transitorio CD4⁺ T las células. Esta herramienta de visualización es útil para mostrar el número de secuencias con grandes deleciones internas y su posición en el genoma. Puede anotarse más para indicar secuencias de codones de parada deletéreo mutaciones del mutágeno ' frameshift ' y eliminaciones/mutaciones en el sitio MSD o señal de empaquetado.

Una aplicación de la prueba de saltos es la identificación de provirus de HIV-1 genéticamente intactos y potencialmente réplica-competente. En un estudio reciente de 531 secuencias aisladas de CD4⁺ T células de 6 participantes en el arte a largo plazo, 26 provirus de HIV-1 genéticamente intactos (5%) fueron identificados². El provirus defectuosos restantes incluyen aquellos con secuencias de inversión (6%), grandes deleciones internas (68%), codones de parada deletéreos/hypermutation (9%), mutaciones del mutágeno ' frameshift ' (1%) y defectos en la señal de empaquetado o mutaciones en el sitio MSD (11%) .

Figura 2: Resumen de flujo de trabajo para el montaje de novo del provirus VIH-1. Los pasos principales en el flujo de trabajo incluyen: 1) secuencia de lectura de control de calidad, 2) fusión de pares superpuestos, 3) montaje de novo y 4) reasignación y consenso ha sido de color rojo, azul, verde y naranja, respectivamente. Esta figura ha sido modificada desde Hiener et al. ² . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: gel de agarosa al ejemplo de PCR amplificado provirus VIH-1. Pozos 1, 2, 3, 6, 9 y 10 contienen el provirus de HIV-1 amplificados. Bien 10 contiene un provirus con una canceladura interna grande, bien 2 contiene la amplificación de dos provirus VIH-1 de diferentes longitudes (mezcla), y 12 bien contiene control positivo. Tenga en cuenta el porcentaje de pozos que contienen producto amplificado es 60%, que es superior el porcentaje requerido para aislar solo plantillas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: ejemplo de salida de asignación leer. Ejemplo (A) cobertura incluso debido a la amplificación de un solo largometraje provirus de HIV-1. Después de nuevo montaje, todas las lecturas se asignan al contig reunido para producir una secuencia consenso. La plataforma de software permite a las lecturas asignadas a inspeccionar para cobertura suficiente e incluso. Ejemplo (B) la amplificación de dos provirus VIH-1 de diferentes longitudes (mezcla). Para determinar mezclas, Lee es asignado a una secuencia de referencia de larga duración (~ 9 kb) desde el mismo participante y leer cartografía inspeccionado. La presencia de cobertura desigual indica una mezcla. Esta figura es reproducida con permiso de Qiagen¹⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Visualización de ejemplo de secuencias proviral VIH-1 aisladas de CD4⁺ T subconjuntos de un individuo en el arte a largo plazo de la célula. Individual HIV-1 proviral secuencias están representadas por líneas horizontales. Esta figura ha sido modificada desde Hiener et al. ² . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El ensayo de VOLTERETAS es un método eficiente y de alto rendimiento para la amplificación y secuenciación individuales, cerca de larga duración provirus VIH-1. Se han identificado múltiples factores y pasos críticos en el protocolo que influyen en la cantidad y calidad de las secuencias obtenidas. En primer lugar, el número de células y la frecuencia de infección de VIH-1 de la población de células influyen en el número de provirus amplificado. Por ejemplo, en una publicación anterior, aproximadamente la mitad como muchas secuencias se obtuvieron el mismo número de ingenuo CD4⁺ T las células en comparación con memoria efectoras CD4⁺ T las células. Esto es porque las células ingenuas suelen tienen una menor frecuencia de infección de las células de memoria efectora². En segundo lugar, la lisis celular es preferible a métodos basados en la columna de extracción para la obtención de ADN genómico como no hay riesgo de perder el ADN en el proceso de extracción. Por último, como con cualquier análisis de la polimerización en cadena-basado, prevención de la contaminación es crítico. Separadas las áreas limpias deben ser designadas para la preparación de mezclas principales, manejo de ADN genómico, agregar controles positivos, purificación de DNA y cuantificación y preparación de la biblioteca. Esto es particularmente importante para los ensayos de solo copia como la que aquí se presenta.

Aplicación de la prueba de saltos debe incluir primero ejecuta un control positivo como plásmidos pNL4-3 en lugar de las muestras participantes. Esto permitirá que cualquier solución de problemas antes de la utilización de las células positivas VIH-1, como se pueden comparar las secuencias obtenidas con secuencias de referencia disponibles para estos plásmidos. Cuando se utilizan las células positivas VIH-1, es importante considerar el subtipo VIH-1 (cartillas diseñadas para FLIPS son específicos de subtipo B) y la frecuencia de infección de la población de células si poco no provirus se amplifica. Secuencias de la cartilla pueden ser modificado/rediseñado para que coincida con otros subtipos. Además, un bien que contiene un control positivo se debe incluir en cada PCR realizada.

VOLTERETAS ha superado las limitaciones del anterior análisis de la secuencia, incluyendo SPS. A través de la amplificación y secuenciación cerca de provirus VIH-1 integrales, tirones pueden determinar la potencial competencia de replicación del provirus VIH-1. Esto no fue posible utilizar SPS, que ordenados sólo las regiones sub-genómica y por lo tanto seleccionada para secuencias con sitios de unión del primer intacto. Además, FLIPS supera las limitaciones asociadas con la utilización de múltiples amplificación y secuenciación cartillas, como fue contratado por la anterior secuencia largos ensayos^1,4. A través de dos rondas de PCR dirigidas a las regiones LTR de HIV-1 combinadas con NGS, FLIPS disminuye el número y la complejidad de los primers requeridos. TIRONES por lo tanto es menos susceptible a las consecuencias de los desajustes de la cartilla, es decir, la identificación errónea de provirus defectuosos y una incapacidad para amplificar algunos provirus dentro de una población. El protocolo de FLIPS también es más eficiente y permite una mayor transferencia de secuencia que los métodos anteriores.

Evidentemente, FLIPS ofrece ventajas sobre los métodos existentes que determinan la composición genética del provirus VIH-1. Sin embargo, es importante reconocer las limitaciones de tirones. En primer lugar, el ensayo de tirones no se ha desarrollado como una herramienta para medir el tamaño de la reserva latente de VIH-1, como no se han completado los análisis para determinar si los tirones amplifica cada provirus VIH-1 en una población celular. TIRONES en cambio es útil para hacer comparaciones relativas de la composición del embalse entre las poblaciones de células diferentes². En segundo lugar, la capacidad de replicación de intactas provirus VIH-1 no se puede determinar con certeza sin análisis en vivo , como los realizados por Ho et al. ⁴. en tercer lugar, tirones no está diseñado para determinar el sitio de integración del provirus VIH-1.

Pequeñas variaciones en el protocolo de tirones pueden aumentar su aplicación. Por ejemplo, cambios en la cartilla secuencias pueden permitir diferentes y múltiples subtipos de VIH-1 amplificado y secuenciado. La secuencia de viriones de VIH-1 de plasma es posible mediante la adición de la síntesis de cDNA antes de la polimerización en cadena jerarquizada. Futura utilización de métodos de secuenciación de molécula única eliminará la necesidad para el montaje de novo .

Secuenciación genética de integrado provirus VIH-1 ha aumentado nuestra comprensión de la reserva latente de VIH-1. FLIPS es una herramienta importante para futuros estudios elucidar la composición y distribución del reservorio latente. Sin embargo, la aplicación de tirones puede extenderse más allá del depósito. Los estudios futuros pueden utilizar FLIPS para determinar objetivos particulares para tecnología CRISPR-Cas, o ayudar en la identificación de la codificación y las regiones no codificantes que hacen más sensible a la latencia de agentes de inversión el virus. Recombinación viral puede entenderse mejor observando los sitios de cruce de grandes deleciones internas.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado el Delaney SIDA investigación empresa (DARE) para encontrar una cura (1U19AI096109 y 1UM1AI126611-01); un amfAR Consorcio de investigación sobre la erradicación del VIH (ARCHE) Collaborative Research Grant de la Fundación para la investigación del SIDA (amfAR 108074-50-RGRL); Centro Australiano para el VIH y Hepatitis investigación de Virología (ACH²); UCSF-GIVI centro para investigación del SIDA (P30 AI027763); y el nacional australiano de salud y Consejo de investigación médica (AAP1061681). Nos gustaría agradecer a Dr. Joey Lai, Gerente de centro de genómica en el Instituto de Westmead para la investigación médica para su entrenamiento en la preparación de la biblioteca y el uso de sus instalaciones y el centro de Ramaciotti genómica (Universidad de New South Wales, Sydney, Australia) para la realización de la secuencia. Reconocemos con gratitud los participantes quienes donaron muestras para este estudio.