El efecto del estrés osmótico en vesículas secretoras y exocitosis de monitoreo

Estrés osmótico afecta la exocitosis y la cantidad de neurotransmisor liberado durante este proceso. Demostramos cómo la combinación de métodos electroquímicos junto con microscopia electrónica de transmisión se puede utilizar para estudiar el efecto de la presión osmótica extracelular sobre la actividad de la exocitosis, tamaño cuántico de la vesícula y la cantidad de neurotransmisor liberado durante la exocitosis.

Amperometría grabación de células sometidas a choque osmótico muestran que las células secretores responden a este estrés físico reduciendo la actividad de la exocitosis y la cantidad de neurotransmisor liberado de las vesículas en eventos solo exocitosis. Se ha sugerido que la reducción en los neurotransmisores expulsado es debido a alteraciones en las propiedades biofísicas de la membrana al encogen de las células en respuesta a estrés osmótico y con supuestos no afectan a vesículas secretoras en el citoplasma de la célula por el estrés osmótico extracelular. Amperometría grabación de exocitosis monitorea lo que se libera de las células el momento una vesícula se funde con la membrana plasmática, pero no proporciona información sobre el contenido de la vesícula antes de la fusión de la vesícula se dispara. Por lo tanto, combinando Amperometría grabación con otros métodos analíticos complementarios que son capaces de caracterizar las vesículas secretoras antes exocitosis en las células se activa ofrece un panorama más amplio para examinar cómo secretoras vesículas y el proceso de exocitosis se ven afectados por choque osmótico. Aquí describimos cómo complementar Amperometría grabación intracelular citometría electroquímico y la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) la transmisión se puede utilizar para caracterizar alteraciones en tamaño y neurotransmisor contenido de vesículas secretoras en el células cromafines en relación con la actividad de exocitosis antes y después de la exposición al estrés osmótico. Al relacionar la información cuantitativa obtenida de experimentos utilizando los tres métodos analíticos, conclusiones fueron realizadas que vesículas secretoras responden al estrés osmótico extracelular reduciendo en tamaño y reduciendo el tamaño cuántico de vesícula mantener una concentración de neurotransmisores de la vesícula constante. Por lo tanto, esto le da algunas aclaraciones con respecto a por qué las vesículas, en respuesta a estrés osmótico, reducen los neurotransmisores cantidad liberados durante lanzamiento de exocitosis. Los registros amperométricos aquí indican que se trata de un proceso reversible y vesícula después de choque osmótico son rellenadas con neurotransmisores cuando son revertidas las células colocadas en un ambiente isotónico.

Las células cromafines suprarrenales son células neuroendocrinas que liberan moléculas de neurotransmisores en el torrente sanguíneo. Esto ocurre a través de un proceso celular que consiste en el acoplamiento y fusión de vesículas llenas de neurotransmisores, dando por resultado lanzamiento contenido de las vesículas al espacio extracelular en un proceso llamado exocitosis. Los neurotransmisores (adrenalina y noradrenalina) en las células cromafines son activamente transportados por proteínas de membrana en vesículas grandes de núcleo denso (LDCVs) y almacenados a altas concentraciones (~0.5-1 M)^1,2. Acumulación de neurotransmisores dentro de las LDCVs se logra por la afinidad de las moléculas de catecolaminas a la matriz de proteína de núcleo denso intravesicular de chromogranin proteínas (~ 169 mg/mL)^{3,4,5 ,6}y una solución cóctel intravesicular que contiene componentes clave para la carga de catecolaminas y almacenamiento en la vesícula como ATP (125-300 mM)⁷, Ca^{2 +} (50-100 μm en la solución y ~ 40 mM destinado a la matriz de la proteína)⁸Mg^{2 +} (5 mM)⁹, ascorbato (10-30 mM)¹⁰y un pH de ~5.5^11,12. El LDCVs mantienen una condición iso-osmótico con el citoplasma de la célula (310 mOsm/kg)¹³, aunque la concentración de soluto teórica dentro de las vesículas de la suma hasta más de 750 mM. La composición de los componentes intravesicular no sólo es esencial para la carga y almacenamiento de catecolaminas, sino también para la agregación de los solutos a la matriz de proteína de núcleo denso. Esto reduce la osmolaridad de las vesículas se reduce considerablemente y puede afectar a la catecolamina de la cantidad que se libera durante la exocitosis^5,6.

Estudios sobre el efecto de la presión osmótica extracelular en el proceso de exocitosis por grabación amperométricos han divulgado eso alta presión osmótica extracelular inhibe la actividad de exocitosis y reduce el número de neurotransmisores secretados de solo vesícula compartimentos^{4,14,15,16,17,18,19}. Las explicaciones de estas observaciones han especulado sobre el posible mejoramiento de apretadura macromolecular en los célula citoplasma inhibición vesícula fusión eventos y una alteración en las propiedades biofísicas de la membrana que afecta el número de durante la exocitosis de neurotransmisores. Estos pensamientos asumieron que el estrés osmótico extracelular alta no afecta el tamaño cuántico de la vesícula, que define el número de moléculas de neurotransmisor almacenado en un compartimiento de vesícula en fase previa de exocitosis disparada^{14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21}. amperométrico medidas de liberación de la exocitosis en las células, un microelectrodo de disco de fibra de carbono se pone en contacto con la superficie de la célula, creando un conjunto experimental hasta imitando la configuración de la sinapsis, donde el sistema amperimétrico electrodo actúa como un detector de postsynaptic (figura 1)^22,23. Mediante la estimulación de una célula a la exocitosis, uno puede inducir vesículas llenas de neurotransmisores se fusionan con la membrana plasmática de la célula y liberar el contenido de la vesícula completa o parte en el espacio extracelular. Estas moléculas de neurotransmisor liberadas en la superficie del electrodo pueden ser detectadas vía electroquímica si los neurotransmisores son electroactivos (por ejemplo, las catecolaminas) mediante la aplicación de un potencial redox de + 700 mV vs un electrodo de referencia Ag/AgCl . En consecuencia, una serie de picos de corriente marca la detección de eventos individuales de la exocitosis. De la corriente frente a rastro de tiempo en una grabación amperométrico, el área bajo cada pico amperométrico solo representa la carga detectada por evento de exocitosis y se puede convertir en el topo de neurotransmisores liberados, mediante la ecuación de Faraday. Por lo tanto, los registros amperométricos proporcionan información cuantitativa sobre los neurotransmisores de la cantidad de eventos solo exocitosis e Informe sobre la frecuencia de eventos de exocitosis, pero no presentan información cuantitativa sobre las vesículas secretoras contenido antes de la fusión de la vesícula y liberación del neurotransmisor se ha iniciado.

Por lo tanto, para obtener una mejor comprensión de cómo secretoras vesículas en la célula citoplasma responden al estrés osmótico extracelular antes de que la célula se activa para experimentar la exocitosis, pueden utilizarse otros métodos analíticos complementarios para enriquecer esta información. Por ejemplo, para investigar si estrés osmótico altera el volumen de la vesícula, microscopía electrónica de transmisión (TEM) análisis de la proyección de imagen puede utilizarse para medir el tamaño de la vesícula de las células después de la fijación química. Para examinar si estrés osmótico afecta tamaño cuántico de vesícula, una técnica recientemente desarrollado amperométrico llamada citometría electroquímico intracelular, se puede aplicar para la cuantificación del contenido de vesículas neurotransmisor en vesículas secretoras en su estado nativo cuando todavía que residen en el citoplasma de células vivas²⁶. En la técnica de citometría electroquímico intracelular, un electrodo cilíndrico carbón de fibra de nanotip se inserta suavemente en el citoplasma de células vivas y mediante la aplicación de un potencial de + 700 mV este electrodo (electrodo de referencia de vs un Ag/AgCl), el contenido de catecolaminas de las vesículas puede ser cuantificada por la detección de un pico actual de redox de vesículas solo chocar, absorber y posteriormente estocástico ruptura en la superficie del electrodo y así liberando su contenido contra la electrodo superficial²⁶. Por lo tanto, en la amperimétrica actual versus seguimiento de tiempo, cada evento de ruptura de vesícula solo puede resultar en un transitorio actual y, al integrar el área de cada pico actual, el tamaño cuántico de vesícula puede calcularse usando la ley de Faraday.

Por lo tanto, al relacionar la información cuantitativa obtenida de mediciones de tamaño de vesícula usando proyección de imagen de TEM junto con análisis de tamaño cuántico de vesícula, según lo registrado por citometría electroquímico intracelular, concentración del neurotransmisor de vesícula puede también ser determinado. Esto permite la caracterización de la vesícula cuando las células son expuestas a diferentes condiciones osmóticas y proporciona una mejor visión de cómo las vesículas pueden responder al estrés osmótico extracelular en la etapa antes de la exocitosis. Los resultados de la combinación de estos métodos han demostrado que en presencia de extracelular alta presión osmótica, vesículas reducirán y ajustan su tamaño cuántico y comparar la información cuantitativa sobre los cambios relativos de estas mediciones muestra que al mismo tiempo que se encoge, las vesículas ajustan su contenido y su tamaño para mantener una concentración constante de neurotransmisor del²⁴. Así, esta comprensión es valiosa en la conexión a las observaciones hechas en la liberación de neurotransmisores en las células expuestas a estrés osmótico. En estos protocolos, describimos el uso de estas tres metodologías complementarias que permiten la caracterización de vesículas secretoras como en su entorno nativo responde a la osmolalidad extracelular y los efectos de esta respuesta en la exocitosis proceso. Además de nuestras observaciones anteriores sobre el efecto de alta presión osmótica en la exocitosis²⁴, presentamos experimentos adicionales que describen la recuperación de la célula después de choque osmótico y el efecto de múltiples estímulos de bario en cromafines células.

1. célula cultura de células cromafines bovinas aislado por la digestión enzimática de las glándulas suprarrenales

1. Para aislar las células cromafines de suprarrenales bovinas, esterilizar las células con solución de etanol 70%. Recortar la grasa ausente y del tejido conectivo con bisturí. Para extraer sangre, enjuagar las venas suprarrenales con solución de Locke (NaCl 154 mM, KCl 5.6 mM, NaHCO3 3.6 mM, hidroxietil-1-ácido ácido (HEPES) 5,6 mM a pH 7.4) que ha sido termostatizado a 37 ° C.
2. Para digerir el tejido, inflar cada glándula mediante la inyección de aproximadamente 2,5 mL de solución de colagenasa P caliente del 0.2% de filtrado estéril a través de la vena suprarrenal mediante una jeringa e incubar el tejido por 20 min a 37 ° C. Examinar las glándulas para garantizar que se complete el proceso de digestión de la médula. El tejido debe sentirse suave y no tenso.
3. Recoger la médula digerida por recortes de las glándulas en la dirección longitudinal. Pique el tejido de la médula con un bisturí. La suspensión de tejido del filtro sobre un tamiz de acero y diluir con solución de Locke a aproximadamente un volumen de 50 mL para reducir la actividad de la colagenasa P.
4. Sedimenten las células a 300 x g en una centrífuga durante 10 minutos a temperatura ambiente y recoger en tubos de ensayo estériles de 50 mL. Resuspenda el sedimento obtenido en solución de 20 mL Locke y filtrar la solución sobre una malla de nylon de 100 μm estéril en los tubos.
5. Mezclar la suspensión de células cromafines con Percoll estéril (1:1) y centrifugar la solución celular a 18.600 x g por 20 min a temperatura ambiente. Recoger la capa superior de la gradiente de densidad y filtrar la solución sobre una malla de nylon de 100 μm en los tubos.
6. Para excluir el Percoll, diluir la suspensión de células con solución de Locke y centrifugar a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente antes de volver a suspender el sedimento en la solución de Locke. La densidad estimada de la célula de la suspensión de células aisladas es aproximadamente 4 millones células/mL.
7. Para grabación de amperométrico de exocitosis y mediciones de citometría intracelular, las células cromafines de la placa en colágeno IV cubierto 60 platos plásticos mm a una densidad de aproximadamente 17.5 × 10³ células/cm² e incuban las células a 37 ° C en un 5% CO₂ medio ambiente. Realizar los experimentos electroquímicos en 1-3 días de cultivo celular.
8. Para el TEM de los experimentos, las células cromafines de la placa en frascos de cultivo de célula 75 cm² con una densidad de 7 millones de células por frasco e incubar a 37 ° C en un entorno de 5% CO₂ para 1 día.

2. célula exocitosis Amperometría experimentos²⁴

1. Para fabricar fibra de carbono microelectrodos para estos experimentos, tomar un vaso capilar con un diámetro exterior adecuado para el cable porta electrodo en el escenario principal que se utilizará en estos experimentos. Utilizar un capilar de vidrio de borosilicato con un diámetro exterior de 1,2 mm y un diámetro interno de 0,69 mm.
   1. Conecte uno de los extremos del capilares a un tubo de aspiración de agua. Coloque las fibras de carbono de diámetro de 5 μm en algo, como un pedazo de papel blanco, para mejorar la visualización.
   2. Identificar una sola fibra de carbono y mantenga la fibra en un extremo con un dedo para mantener la fibra de carbono en su lugar mientras coloca el extremo abierto del tubo capilar en proximidad al extremo libre de la fibra de carbono. Aspire suavemente la fibra de carbono en el capilar de vidrio para que la fibra de carbono sobresale a través de ambos extremos del tubo capilar. Mover a la fuerza de aspiración.
2. Coloque el tubo capilar con la fibra de carbono en un tirador de la micropipeta y tire el vaso capilar en dos puntas de pipeta de vidrio separados. Para desconectar la fibra de carbono que está conectada entre las puntas de dos vidrios, usar un par de tijeras para cortar la fibra de carbono y obtener dos microelectrodos de fibra de carbono.
3. Bajo el microscopio, coloque la fibra de carbono en la parte superior un grueso portaobjetos de microscopio que permite el corte manual de la fibra de carbono en el borde de donde la fibra es que se extiende desde la capa capilar de vidrio con un bisturí.
4. Después de cortar la fibra de carbono, dejando una punta de vidrio recubiertos de fibra de carbono, inserte unos pocos milímetros de la punta del electrodo en una solución de Epoxy por 10 min a tire de epoxy y sellar cualquier posible espacio abierto entre la fibra de carbono y el vidrio circundante. Levante los electrodos lentamente fuera de la solución de epoxy para impedir que formando en la punta del electrodo pegamento voluminosos gotas.
5. Coloque los electrodos en un soporte (por ejemplo, una varilla plana de madera) con cinta resistente al calor pegajoso bilateral que pueden acoplarse electrodos. Cueza al horno los electrodos epoxi tratada durante la noche en un horno a 100 ° C. El electrodo consejos fácilmente romperán si entran en contacto con una superficie, así que asegurar los electrodos siempre están a buen recaudo mediante un soporte donde los electrodos se fijan en su lugar y consejos no te arriesgues a ser tocado.
6. Para obtener una superficie de electrodo de disco plano, coloque el electrodo en el soporte de un microgrinder y cada electrodo de fibra de carbono en un ángel de 45° de bisel. Después de biselado, marque el capilar en su parte superior usando un marcador permanente para saber después cómo localizar la superficie del electrodo de disco a un ángulo de 45° al colocar el electrodo cerca de las células para la medición de la exocitosis.
   Nota: Este paso es importante que en estos experimentos, el electrodo de disco oval debe colocarse sobre las células con su superficie paralela a la superficie de la placa de Petri. También, electrodos que bisela se realizan el mismo día como experimentos para asegurar una superficie de electrodo fresco y limpio.
7. Antes de usar, coloque cada microelectrodo de fibra de carbono en una solución de prueba (p. ej., dopamina de 0,1 mM en tampón PBS (pH 7.4)) para supervisar el estado de constante actual mediante voltametría cíclica. Para un análisis de voltametría cíclica, aplicar una forma de onda de triángulo potencial desde -0.2 V a + 0,8 V vs un electrodo de referencia Ag/AgCl a 100 mV/s para asegurar buena reacción cinética datos que se obtienen están de acuerdo con los valores calculados teóricamente para un disco de diámetro de 5 μm microelectrodo de fibra de carbono²⁵.
8. Para la grabación de la Amperometría de exocitosis, coloque el plato Petri con cultivos de células cromafines en un microscopio invertido. Es importante proteger el microscopio creado con una jaula de Faraday para eliminar ruido electrónico durante la Amperometría de grabación, debido a las muy pequeñas corrientes se mide. Usar un microscopio de calentamiento etapa para mantener una temperatura de 37 ° C durante los experimentos de la célula.
9. Utilice un instrumento de abrazadera silencioso parche para aplicar un potencial constante de 700 mV en el electrodo de trabajo frente a un electrodo de referencia Ag/AgCl que también se coloca en la caja Petri del electrodo de trabajo. Para grabación de exocitosis de células cromafines, digitalizar la señal de 10 kHz y aplique un interior paso bajo filtro de Bessel a 2 kHz para filtrar la señal grabada.
10. Para realizar amperométrico de grabación en las células, Monte el microelectrodo de disco de fibra de carbono recién biselado y probado en el portaelectrodos del escenario principal que se utiliza con el potenciostato.
    1. Suavemente Coloque el electrodo con el disco plano oval forma electrodo superficial hacia abajo hacia la superficie apical de la célula y coloque el electrodo en contacto con la membrana celular utilizando un micromanipulador.
    2. Ajustar la distancia desde el electrodo a la celda mediante el control de la deformación de la célula causada por el electrodo sobre la colocación encima de la membrana celular y luego cuidadosamente retire el electrodo a una distancia donde la célula recupera una forma cerca de su forma original de la célula . Lo ideal para registro cinético y la cuantitativa es para crear una fina película líquida de cien nanómetros para separar la superficie del electrodo y de célula, que son condiciones similares para la detección de postsynaptic de liberación de químico en sinapsis.
11. Para estimular las células exocitosis, coloque una micropipeta de vidrio con un tamaño de punta de 2-3 μm de diámetro, lleno de solución volver₂ de 5 mM a una distancia de al menos 20 μm de la célula, para evitar cualquier solución que se escapa de la punta de la pipeta para influir en la experimentar y aplicar un pulso de inyección s 5 5 mm solución de₂ volver a la superficie de la célula para estimular la célula a la exocitosis.
12. Para estudiar los efectos reversibles de la presión osmótica en el proceso de exocitosis, preparar una solución tampón isotónica (150 mM NaCl, 5 mM KCl, MgCl2, 5 mM de glucosa, de 1,2 mM 10 mM HEPES, pH 7,4) con presión iso-osmótica de 310 mOsm/kg y un buffer hipertónico por ajuste de la Concentración de NaCl de la solución tampón isotónica con una osmolalidad corresponde a 730 mOsm/kg.
13. Colocar las células en el buffer isotónico y estimulan la exocitosis la célula aplicando un pulso de inyección de bario durante la grabación de los transitorios corriente amperométrica durante la actividad de exocitosis Iniciado por aproximadamente 3 minutos.
    1. Para comparar las respuestas de la exocitosis en condiciones isotónicas a condiciones hipertónicas, incubar las células durante 10 minutos en solución hipertónica tamponada y posteriormente aplicar un pulso de inyección de bario para estimular exocitosis y realizar 3 minutos de grabación amperométrico.
    2. Para la respuesta reversible de las células, incubar las células nuevamente por 10 minutos en solución tampón isotónica y estimular las células mediante la aplicación de un 5s inyección de bario pulso y realizar 3 minutos de grabación de la respuesta de la exocitosis de la célula.
14. Como control de experimentos para determinar el efecto sobre la actividad de la exocitosis por múltiples estímulos de bario, realizar una grabación amperométrico de exocitosis liberación de tres consecutivos volver₂ estímulos en una misma célula en buffer isotónico y utilizando el mismo protocolo de tiempo para los experimentos de incubación celular consecutivos con osmolaridad diferentes.

3. intracelular citometría electroquímico^24,26

1. Para fabricar electrodos para mediciones de tamaño cuántico de vesícula, utilizar los mismos materiales y empezar a preparar un 5 μm en el electrodo de fibra de carbono de diámetro según los plazos indicados en las secciones 2.1 y 2.2 de la fabricación de microelectrodos para exocitosis amperométrico mediciones.
2. Bajo el microscopio, utilice un bisturí para cortar la fibra de carbono que se extiende fuera de la punta de vidrio para que una fibra de carbono con una longitud que van desde 30 hasta 100 μm se quede sobresaliendo de la punta de vidrio.
3. Para preparar una punta grabado de llama del electrodo de fibra de carbono, utilice una llama de butano. Para lograr un uniformemente grabado al agua fuerte, punta del electrodo en forma cilíndrica, sostenga el electrodo cilíndrico en forma de fibra de carbono mientras gira y coloque la fibra de carbono que se extiende desde el vidrio en el borde azul de la llama de butano hasta la punta del carbón desarrolla un color rojo Color. Esto a menudo toma menos de 2 s. Si tiene éxito, esto resulta en un tamaño de punta de grabado electrodo de 50-100 nm de diámetro (una imagen de SEM de tal extremo se muestra en la figura 5B). Después de llama aguafuerte, coloque el electrodo bajo un microscopio para evaluar la punta del electrodo.
4. Inserte el microelectrodo de nanotip cilíndrico en la solución de epoxy para 3 minutos seguido de una s 15 inmersión de la punta del electrodo en una solución de acetona. Esto permite epoxi sellar el espacio potencial de la brecha entre la fibra de carbono y la pared capilar de vidrio aislante, mientras que la acetona borra el de epoxy de la superficie del electrodo de grabado al agua fuerte de fibra de carbono. Para curar el epoxi, cueza al horno los electrodos en un horno durante la noche a 100 ° C.
5. Antes de usar, prueba de la corriente de estado estacionario de cada microelectrodo de fibra de carbono, como se explica en la sección 2.7 mediante voltametría cíclica. Para los experimentos, utilice únicamente electrodos que muestran una meseta actual alrededor de 1.5-2.5 nA²⁷.
6. Para las mediciones de la Amperometría intercelular, colocar las células en el microscopio tal como se describe en 2.8 y utilizar la misma configuración experimental de potenciostato como se describe en 2.9.
7. Realizar medición amperométrica intracelulares y para prevenir daño físico significativo a la celda, insertar el microelectrodo cilíndrico nanotip en la célula mediante la adición de una mecánica suave de la fuerza, lo suficiente como para empujar el electrodo a través del plasma de la célula membrana y en el citoplasma de las células utilizando un micromanipulador.
8. Después de la inserción y con la membrana de la célula sellada alrededor del electrodo cilíndrico, iniciar la grabación de amperométrico in situ en células vivas. En la oxidación potencial se aplica al electrodo, las vesículas se adsorben a la superficie del electrodo y la ruptura estocástico.  Por lo tanto, no es necesario para cualquier tipo de estímulo para iniciar este proceso.
9. Para determinar el efecto osmótico de tamaño cuántico vesícula, recoger las mediciones intracelulares citometría de un grupo de células que han sido incubados en isotónicas y en buffer hipertónico mediante la condición experimental como se describe en la sección 2.13.

4. Análisis de grabaciones Amperometría

1. Para analizar los datos registrados Amperometría de exocitosis y análisis cuántico vesícula intracelular, utilizar un programa de software que permite el análisis de transitorios de corriente en la corriente registrada frente a rastro de tiempo así que cinético parámetros de pico y la carga total de picos de corriente individuales puede ser determinado. Para análisis de datos, hemos utilizado el software desarrollado en el laboratorio de Sulzer que fue escrito para el programa de análisis de datos Igor²⁸.
2. Al analizar la amperimétrica espigas, seleccionar un límite umbral para picos de tres veces la raíz media cuadrada (RMS) desviación estándar del ruido para cada grabación.
3. Recoger las espigas amperométrico de cada grabación de celular manualmente para evitar picos falsos que no siga la forma gaussiana, doble de puntos que pueden ser el resultado de eventos combinados exocitosis y sólo se aceptan picos con forma Gaussianas con un umbral de tres veces más alto que el ruido RMS.
4. Recoger los datos de cargo total por única amperométrico pico y utilizar ley de Faradays (N = QnF) para calcular la cantidad molar del neurotransmisor de catecolamina detectado por exocitosis o evento de ruptura intracelular vesícula única, donde N es moles de neurotransmisores que van a través de una reacción redox en la superficie del electrodo, Q = la carga total detectada en cada punto, n = número de electrones transferidos en la reacción redox (n = 2 para las catecolaminas) y la constante de Faraday F = 96485 C/mol.
5. Realizar el análisis estadístico de los datos recogidos mediante el primer cálculo de la carga promedio detectada por evento para cada celda. Para la varianza entre las células, calcular la carga promedio entre las células y utilizar la prueba t de student entre células asumiendo varianza desigual. Este estudio utilizó el programa MATLAB para el análisis estadístico.

5. TEM imágenes para análisis de tamaño de la vesícula

1. Para realizar la proyección de imagen de TEM de las células en las diferentes condiciones osmóticas, primero incubar las células en solución tampón isotónica o hipertónica durante 10 min a 37 ° C en un 5% CO₂ ambiente antes de la fijación química de las células.
2. Realizar fijación de la célula usando el método fijador de Karnovsky²⁹. Usando este método, incubar las células con una solución que contiene 0,01% de azida sódica 1% formaldehído y glutaraldehído 1.25% la muestra puede guardarse a 4 ° C.
3. Después de la fijación, se lavan las células con buffer de cacodilato de sodio de 0,15 M.
4. Para teñir la célula muestras post fijación y preparación para la proyección de imagen de TEM, incuban las células con tetraóxido de osmio 1% solución por 2 h a 4 ° C, seguido de 1 h de incubación en solución de acetato de uranilo de 0,5% a temperatura ambiente en la oscuridad.
5. En un paso de la fijación final, deshidratar las células primero aclarando las células en etanol al 100% y luego enjuague las células con acetona.
6. Incrustar las muestras celulares en epoxyresin y posteriormente realizar la centrifugación a 4.000 x g durante 30-40 minutos y la muestra de células polimerizar a 40 ° C durante 15 h seguido de 48 h de incubación a 60 º C.
7. En preparación para la proyección de imagen, sección la muestra celular incrustado en Agar 100 resina en láminas con espesor de 60 nm, utilizando un ultramicrótomo.
8. Someter las células a una solución del etanol 4% uranilo acetate/25% durante 4 minutos seguido de 20 s de enjuague con agua. Lavar las células con citrato de plomo de Reynolds por 3 min, seguido de 20 s de enjuague con agua.
9. Realizar la proyección de imagen de microscopia electrónica transmisión de muestras de células. En nuestros experimentos, hemos utilizado un microscopio electrónico de transmisión que ha sido operado a 120 kV.
10. De cada imagen grabada de una sección de la célula que ilustra la ultraestructura de la célula que muestra una población de las vesículas en el citoplasma de la célula, primero calibrar el tamaño de píxel de la imagen relacionadas con píxeles a la barra de escala registrado en cada imagen TEM. Uso de software para determinar el tamaño de la vesícula en cada imagen de las células expuestas a condiciones isotónicas o hipertónicas. En nuestros experimentos, hemos utilizado el software ImageJ para el análisis de la imagen. Cabe señalar que para el análisis de la imagen de la ultraestructura celular imágenes de TEM de las células, ajuste del tamaño de estas medidas basado en el grueso de las secciones de la célula debe ser considerado y se han descrito previamente por Almers´s lab³⁰.

Aquí describimos el protocolo de cómo combinar la proyección de imagen de TEM junto con dos metodologías electroquímicas, Amperometría de fibra de carbono y citometría electroquímico intracelular, puede proporcionar información que adquiere una visión más amplia, aludiendo al efecto de presión osmótica extracelular en el proceso de exocitosis y vesículas secretoras. Mediante la comparación de grabaciones amperométrico representante de liberación de la exocitosis en las células cromafines uso experimental establecido (se muestra en la figura 1), una reducción significativa en la actividad exocitóticas aparecía cuando las células fueron expuestas a osmótico estrés en comparación con las células en condiciones isotónicas (figura 2A)²⁴. De estas grabaciones y utilizando la ley de Faraday, la carga total detectada por cada sensor individual actual spike se utilizó para calcular el número de moléculas de eventos de exocitosis de una vesícula en células expuestas a los diferentes osmótico condiciones. En comparación, como se muestra en la figura 2B por el área más pequeña de la amperométrica promedio actual punto detectado por las células en solución hipertónica, menos moléculas de neurotransmisor se liberaron de cada vesícula por las células de detección de estrés osmótico²⁴ .

Para determinar la reversibilidad de esta disminución en el número de moléculas de neurotransmisor liberado, realizamos grabaciones amperométrico de exocitosis en las células expuestas a un ambiente hipertónico y, posteriormente, en las células después de colocado en una isotónica medio ambiente. En estos experimentos, las células cromafines se estimulan tres veces consecutivas con volver₂ solución: primero en un buffer isotónico, seguido de un segundo estímulo después de que las células se incubaron por 10 min en una solución hipertónica y, finalmente, una tercera estimulación después de la incubación de células de 10 min en condiciones isotónicas. Los resultados como se muestra en la Figura 3A presente que se reduce la cantidad de neurotransmisores liberados en un ~ 50% cuando las células fueron expuestas a la condición hipertónica en comparación con la primera Ba^{2 +} estimulación en la condición isotónica. Posteriormente, cuando las células fueron traídas de nuevo a un ambiente isotónico y sometidas a un tercer estímulo^{2 +} Ba, se revirtió el neurotransmisor de la cantidad liberado por evento de exocitosis hacia la cantidad original registrada en el primer estímulo, que confirman observaciones anteriores¹⁴. Experimentos de control con tres sucesivas Ba^{2 +} estímulos de las células en condiciones isotónicas (véase figura 3B) demuestran que múltiples secuenciales Ba^{2 +} estímulos en condiciones isotónicas no alteraba el neurotransmisor de la cantidad liberado durante la exocitosis. Esto sugiere que tamaño cuántico de vesícula se ajusta rápida y reversiblemente con la osmolaridad extracelular.

Sin embargo, al analizar los rastros amperométrico de estos experimentos en términos de actividad de exocitosis, se hizo evidente, como se muestra en la Figura 4A, esa actividad de exocitosis fue obstaculizada significativamente cuando las células fueron expuestas a estrés hipertónico. Durante el estrés osmótico, eventos de exocitosis se redujeron al 12% de la actividad de las células en condiciones isotónicas. Posteriormente, después de que el choque osmótico y las células se colocaron en un entorno isosmóticas, células recuperaron el 41% de su actividad original de exocitosis. Curiosamente, los experimentos de control realizada en condiciones isotónicas demostradas, como se muestra en la Figura 4B, que después de realizar tres estímulos consecutivos de BaCl2, se redujo la frecuencia de eventos de exocitosis a 53% después de un segundo estímulo y aún más hasta un 26% por el tercer estímulo en comparación con el primer estímulo. Por lo tanto, está claro que consecutivos Ba^{2 +} estímulos no parecen afectar la cantidad de neurotransmisores liberados de cada vesícula de exocitosis se dispara, pero influye significativamente en la eficiencia de lo proceso de liberación de la vesícula.

Para investigar cómo secretoras vesículas en su medio ambiente nativo se ven afectados por el estrés osmótico extracelular en términos de volumen de la vesícula o tamaño cuántico, análisis de tamaño de vesícula usando proyección de imagen de TEM se combinó con citometría electroquímico intracelular en las células expuestos a condiciones isotónicas e hipertónicas. En los experimentos de citometría electroquímico intracelular, un electrodo de nanotip de fibra de carbono fue insertado en el citoplasma de células cromafines que vivo cuando se colocan en solución isotónica e hipertónica (como se muestra en la figura 5). El repunte actual de amperométrico resultante fue supervisado de cada vesícula en el citoplasma de la célula que chocan, absorber y estocástico ruptura y liberando el contenido de la vesícula en la superficie del electrodo amperométrico a explosión²⁶. La carga total detectada para cada pico en la corriente versus la huella del tiempo se utilizó para calcular el tamaño cuántico vesícula media en cada celda de grabación por la ley de Faraday. Estas medidas intracelulares citometría electroquímico, que se muestra en la figura 6 y figura 7B, demostrada que el tamaño cuántico vesículas en células expuestas a estrés osmótico se redujeron significativamente en comparación con las células en condiciones isotónicas. Comparando la magnitud de la alteración de tamaño cuántico vesícula según lo medido por citometría de electroquímica intracelular, a la declinación fraccionaria en la cantidad de neurotransmisor liberado durante la exocitosis en las células experimentan estrés osmótico extracelular , mostró una disminución relativa de 60% de tamaño cuántico y el neurotransmisor de la cantidad liberada en comparación con las células en condiciones isotónicas (figura 7)²⁴. Para relacionar el ajuste de tamaño cuántico vesícula a una potencial variación en la concentración de neurotransmisores de vesícula de células experimentan la presión osmótica, TEM imagen análisis fue realizado para determinar el tamaño de la vesícula de células expuestos a bebidas isotónicas e hipertónica condiciones. Además, la coloración oscura de la matriz de proteína de núcleo denso dentro de las LDCVs que se visualiza en las imágenes TEM como límite de una esfera oscura en la membrana de vesículas se utilizó para medir el volumen de la matriz de base densa de estas vesículas. Tal como se presenta en la figura 8, tamaño de la vesícula se redujo a 60% en las células expuestas a estrés osmótico extracelular en comparación con las células en condiciones isotónicas. Desde el volumen calculado del diámetro medido de la LDCV y el núcleo denso, el volumen de la solución circundante de halo que aparece como una solución clara dentro de las LDCVs en las imágenes TEM se calculó también. Los resultados resumidos del análisis de imagen TEM mostró, como se muestra en la figura 8, que durante el choque de osmótico extracelular es principalmente el volumen de la solución de halo en el LDCVs que redujo²⁴.

Figura 1 : Célula exocitosis Amperometría. Un esquema de la configuración experimental para la medición amperométrica de exocitosis en solo cromafin células²⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: amperométrico rastros de las mediciones de la exocitosis.  (A) A representante amperométrico grabación de exocitosis en células cromafines en isotónico (color negro) y en entornos extracelular hipertónico (color rojo). (B) ampliación de una espiga promedio amperométrica de medición exocitosis de células cromafines en isotónica (negro) e hipertónica ambientes extracelulares (rojo)²⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : La reversibilidad de la cantidad de catecolaminas publicado en exocitosis después de choque osmótico. (A) el número de moléculas liberadas durante la exocitosis de células cromafines (n = 4) por tres consecutivos Ba^{2 +} estímulos, con el primer estímulo en isotónica, el segundo en hipertónica y la tercera en buffer isotónico. Se muestran los resultados estadísticos de la prueba de t no pareado. El valor de ppara la comparación de la primera Ba^{2 +} estimulación (Ba^{2 +} stim 1) en buffer isotónico con la segunda Ba^{2 +} estimulación (Ba^{2 +} stim 2) en buffer hipertónico es p= 0.1088 y el p-valor la comparación de la segunda Ba^{2 +} estimulación en solución hipertónica con el tercer Ba^{2 +} estímulo (Ba^{2 +} stim 3) en buffer isotónico es p = 0.059. (B) Control de experimento demostrando la cantidad de moléculas de neurotransmisor liberado en tres consecutivos Ba^{2 +} estímulos de células cromafines (n = 4) en buffer isotónico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : El efecto de la presión osmótica sobre la actividad de la exocitosis. (A) el efecto de la osmolaridad extracelular sobre la actividad de la exocitosis se presenta como la frecuencia de eventos de exocitosis cuando cromafines células (n = 4) son estimulados con solución de bario en isotónica e hipertónica y finalmente en condiciones isotónicas. Los valores se presentan como el número medio de puntas de cada celda y el promedio de todas las células de muestra (error estándar de la media (SEM)). La significación estadística de los cambios se presenta utilizando una prueba t para datos no apareados (el p -valor de isotónica Ba^{2 +} estimulación 1 e hipertónica Ba^{2 +} estimulación 2 es p= 0.0126 y el p-valor para la comparación de hipertónica Ba^{2 +} estimulación isotónica y 2 Ba^{2 +} 3 es p= 0,037). (B) Control de experimento que presenta la frecuencia de eventos de exocitosis después de tres estímulos consecutivos bario en células cromafines (n = 4) en condiciones isotónicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Vesícula intracelular citometría electroquímico para monitorizar los cambios de tamaño cuántico de vesícula. (A) un esquema experimental establecido usado para citometría electroquímico intracelular. (B) una exploración imagen de microscopia electrónica de una típica nanotip de electrodo cónico de fibra de carbono²⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Mediciones de citometría electroquímico intracelular mostrando (A) representante rastros de grabaciones de citometría amperométrico intracelular en células cromafines en isotónica (negro) e hipertónicas ambientes extracelulares (rojo). (B) ampliación de una espiga media amperométrico de medida cytometry intracelular en células cromafines en isotónica (negro) e hipertónica ambientes extracelulares (rojo)²⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : Cuantificación del número de las catecolaminas en la exocitosis y la determinación de tamaño cuántico vesícula. (A) el número medio de moléculas liberadas durante las grabaciones de la exocitosis en las células cromafines en bebidas isotónicas (n = 22) e hipertónica (n = 20) ambientes. Los valores se presentan como un número promedio de moléculas liberados por evento de cada célula y exocitosis y un promedio de las células de muestra (± SEM). La significación estadística de los cambios se presentan utilizando la prueba t para datos no apareados (p -valor = 0,0003) (B) el número medio de moléculas por vesícula como detectados por citometría electroquímico intracelular en células cromafines en bebidas isotónica (n = 19) e hipertónica (n = 16) condiciones. Los valores se presentan como el número medio de moléculas por espiga que de cada célula y un promedio de todas las células de muestra (± SEM). La significación estadística de los cambios se presenta utilizando la prueba t para datos no apareados (p - valor = 0.0108)²⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8 : Efecto de la presión osmótica en tamaño de vesículas grandes de núcleo denso. El volumen calculado de las LDCVs, la proteína de núcleo denso y la solución de halo que rodea la matriz de proteína de núcleo denso se calculó en attolitres (aL) de análisis de imágenes de imágenes TEM de las células cromafines en bebidas isotónicas (n = 12) e hipertónica (n = 9) buffers. Los resultados se obtuvieron de un promedio de 311 vesículas por célula y los promedios de las células (± SEM). P-valores se divulgan de impares t-pruebas comparando buffers isotónicas e hipertónicas. El P-valor es 0.0385 (*) para el volumen de la vesícula, 0.3967 para volumen de núcleo denso, 0.0047 (*) para halo volumen²⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí presentamos un protocolo y las ventajas de la combinación de tres métodos analíticos complementarios para analizar vesículas secretoras y el proceso de exocitosis para lograr una mejor comprensión de cómo una fuerza física como la presión osmótica puede afectar a las vesículas secretoras y el proceso de exocitosis en células secretoras. Estos métodos incluyen Amperometría de microelectrodo de fibra de carbono, que es un método establecido para grabar la actividad de la exocitosis, citometría electroquímico intracelular, que se utiliza para determinar el tamaño cuántico de vesículas en su ambiente nativo, y Análisis de imágenes de microscopia electrónica transmisión para controlar el volumen de la vesícula secretora. En este trabajo, por la recogida de datos cuantitativos de las grabaciones de la Amperometría de eventos de exocitosis de una vesícula en células cromafines expuestas a una isotónica y un ambiente extracelular hipertónico, confirmamos que choque osmótico reduce significativamente la neurotransmisores de cantidad liberados durante la exocitosis y que estas células reversiblemente pueden recuperar y liberar la cantidad original, si colocado en un ambiente isotónico (figura 3).

Los registros amperométricos proporcionaron información de la frecuencia de eventos de exocitosis frente al tiempo y por lo tanto también pueden usarse para monitorear los cambios en la actividad de la exocitosis en las células en diferentes ambientes osmóticos. Estos datos pueden ser interpretados y utilizados para discernir si alteraciones en la actividad ocurren al instante o como una función del tiempo. Como mostró en trabajos anteriores, aunque estrés osmótico había obstaculizado actividad exocitótico, no parecía impedir la fusión de la piscina fácilmente liberable de vesículas²⁴. Los datos de actividad de la exocitosis pueden utilizarse también para analizar la actividad exocitóticas total durante un período de tiempo de grabación. Aquí presentamos el número acumulado de exocitosis eventos de un registro de 3 minutos de la exocitosis en las células cromafines, expuestos a las diferentes condiciones osmóticas. Estos datos muestran una inhibición en la actividad de la exocitosis de células experimentan estrés osmótico y que se puede lograr una recuperación parcial de la actividad células regresar a un ambiente extracelular isotónico. Sin embargo, muy importante, los experimentos de control demostraron que múltiples Ba^{2 +} estímulos dentro del marco de tiempo utilizado en estos experimentos causaron una reducción significativa en la actividad de la exocitosis por cada vez que una célula se estimuló la secreción. Por la tercera consecutiva Ba^{2 +} estimulación, sólo un tercio de la actividad de la exocitosis se mantuvo, y claramente el bario y quizás también la sincronización de estímulos en estos experimentos, fue que afectan el ciclo de la vesícula. Esto podría ser relevante para explicar por qué actividad exocitóticas fue recuperado en las células que se colocan en solución isotónica después el choque osmótico y por qué estas células muestran una reducción relativa similar en actividad en comparación con las células en condiciones isotónicas después de tres Alternativamente Ba^{2 +} estímulos. Por lo tanto, Amperometría grabación de exocitosis proporciona información sobre vesículas secretoras a partir de que las vesículas se activan para fusionarse con la membrana plasmática, liberación de neurotransmisores a través del poro de fusión. Tal modo datos cuantitativos sobre neurotransmisores de la vesícula solo soltar y puede recoger información sobre la actividad de la exocitosis.

La cantidad de neurotransmisor liberado puede ser regulada por el régimen de exocitosis que se activa, donde se libera el contenido de la vesícula completa o parte de los contenidos. Únicamente estudiando el lanzamiento de exocitosis mediante Amperometría de fibra de carbono que sólo detecta lo que es expulsado de una vesícula, es difícil distinguir si un cambio en la cantidad detectada de neurotransmisor liberada está relacionada con una alteración en el modo de disparo de exocitosis, un cambio en las propiedades biofísicas celulares afectando la liberación contenido de la vesícula, o a los cambios de tamaño cuántico de vesícula. Por lo tanto, complementando el registro amperométrico de exocitosis con mediciones utilizando la citometría electroquímico intracelular, en situ medidas de tamaño cuántico vesículas en células vivas pueden caracterizadas y por lo tanto se utiliza para comparar la fracción de liberación contenido vesícula de vesículas de exocitosis²⁶.

En este trabajo, para investigar si el tamaño cuántico de vesícula fue afectado por el estrés osmótico, aplicamos esta técnica para la cuantificación y evaluación de tamaño cuántico vesículas en células expuestas a condiciones isotónicas e hipertónicas. Como la inserción del electrodo de nanotip en el citoplasma de una célula viva se considera bastante invasiva, estos experimentos fueron realizados solamente una vez por la célula y no fueron repetidos en la misma célula. Por lo tanto, estos experimentos se realizan preferentemente como mediciones individuales de grupos de células seleccionadas al azar expuestas una isotónica y un ambiente extracelular hipertónico. Para comparar cambios en vesícula de tamaño cuántico medido por citometría de electroquímica intracelular a las alteraciones en el neurotransmisor de la cantidad en la exocitosis, uno debe considerar que empareja las condiciones experimentales de grabación intracelular y también realizar grabación Amperometría de exocitosis en las células al azar independientes. Si los estudios se realizan sobre la misma célula individual, es importante en estos protocolos experimentales también considerar la influencia de estímulos de₂ volver consecutivos y asegúrese de las condiciones experimentales coinciden con los utilizados en citometría de intracelular mediciones. También cabe señalar que es difícil controlar la ubicación exacta y la profundidad del electrodo cuando se inserta en una celda. Así, cada celda proporciona una muestra aleatoria para el análisis de tamaño cuántico de vesícula. Además, sondeo tamaño cuántico de vesícula mediante este método no distingue diferencias en, por ejemplo, madurez de vesícula y por lo tanto, también podría añadir variación a las mediciones. Experimentos intracelulares demostraron que tamaño cuántico de vesícula fue reducida en las células expuestas a la presión osmótica extracelular. La reducción relativa de tamaño cuántico detectado por este método se comparó con las observaciones de cambios relativos en la liberación de neurotransmisores durante la exocitosis. Este estudio encontró que la disminución relativa de tamaño cuántico en el mismo orden que la caída en la liberación de neurotransmisores en las células de detección de estrés osmótico.

Para verificar si el estrés osmótico fue alterando la concentración de neurotransmisores de la vesícula, el volumen de la vesícula se evaluó mediante TEM imagen análisis de células cromafines químicamente fijos que habían sido expuestos a condiciones isotónicas e hipertónicas. Análisis de la proyección de imagen de TEM demostró que las vesículas se encogen cuando las células se exponen a un choque osmótico y que la relativa reducción de tamaño se ajusta con el tamaño cuántico de la vesícula para mantener una concentración constante de neurotransmisor del²⁴. El análisis de imágenes TEM, que proporciona la resolución de la imagen de nanómetros puede distinguir las dos fases, la matriz de proteína de núcleo denso y la solución de halo circundante dentro de LDCVs y así es posible determinar el volumen de la matriz de proteína de núcleo denso y calcular el volumen de la solución de halo. De este análisis, la disminución en el volumen de la vesícula se determinó principalmente relacionado con un menor volumen de la solución de halo que rodea la base densa proteína matriz²⁴.

En Resumen, este estudio presenta un protocolo de demostración de tres métodos analíticos se combina y permite la caracterización de vesículas secretoras antes neurotransmisor lanzamiento y lo que se liberan de estas vesículas cuando las células se activan a exocitosis, para lograr una mejor comprensión de cómo secretoras vesículas y funciones como exocitosis es afectada por el estrés extracelular de la célula. Este protocolo puede utilizarse también para ayudar a responder preguntas sobre cómo liberar neurotransmisor en exocitosis y tamaño cuántico de vesícula es afectada por otras alteraciones en el ambiente físico o por fármacos potenciales que pueden afectar células secretoras.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores desean agradecer al Consejo Sueco de investigación (349-2007-8680) para la financiación y Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Suecia) para la donación de suprarrenales bovinas.