PCR de fusión de alta resolución para el receptor de complemento 1 Longitud Polimorfismo Genotipificación: una herramienta innovadora para la evaluación de la susceptibilidad genética de la enfermedad de Alzheimer

En este trabajo se describe un método innovador para determinar los polimorfismos de la longitud del receptor del complemento 1 (CR1) para su uso en varias aplicaciones, en particular la evaluación de la susceptibilidad a enfermedades como la enfermedad de Alzheimer (EA). Este método podría ser útil para comprender mejor el papel de las isoformas CR1 en la patogénesis de la EA.

El receptor de complemento 1 (CR1), una glicoproteína transmembrana que desempeña un papel clave en el sistema inmune innato, se expresa en muchos tipos de células, pero especialmente en los glóbulos rojos (glóbulos rojos). Como receptor de los componentes del complemento C3b y C4b, CR1 regula la activación de la cascada del complemento y promueve la fagocitosis de los complejos inmunes y de los restos celulares, así como el péptido amiloide-beta (Aβ) en la enfermedad de Alzheimer. Varios estudios han confirmado los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) asociados a AD, así como una variación del número de copias (CNV) en el gen CR1 . Aquí, describimos un método innovador para determinar el polimorfismo de longitud del receptor CR1. El receptor incluye tres dominios, denominados repeticiones homólogas largas (LHR) -LHR-A, LHR-C y LHR-D- y un dominio n, LHR-B, donde n es un número entero entre 0 y 3. Usando un solo par De cebadores específicos, el material genético se utiliza para amplificar un primer fragmento del dominio LHR-B (thE amplicón variante B) y un segundo fragmento del dominio LHR-C (el amplicón invariante). La variante del amplicón B y el amplicón invariante muestran diferencias a cinco nucleótidos fuera de las áreas de hibridación de dichos cebadores. El número de amplicones variantes B y de amplicones invariantes se deduce utilizando una herramienta cuantitativa (curvas de alta resolución de fusión (HRM)), y la relación de la variante del amplicón B al amplicón invariante difiere de acuerdo con el polimorfismo de longitud CR1. Este método proporciona varias ventajas sobre el método del fenotipo canónico, ya que no requiere material fresco y es más barato, más rápido y, por tanto, aplicable a poblaciones más grandes. Por lo tanto, el uso de este método debe ser útil para comprender mejor el papel de las isoformas CR1 en la patogénesis de enfermedades como la EA.

AD, la causa más común de demencia, afecta a más de 30 millones de personas en todo el mundo y es un importante problema de salud pública ¹ . Clínicamente, la EA se caracteriza por trastornos neurocognitivos que conducen a una pérdida progresiva de autonomía ² . AD se caracteriza por dos signos neuropatológicos, a saber, extracelular depósitos amiloides y intracelular neurofibrillary tangles [ ^3] .

Tradicionalmente, según la edad de inicio de la enfermedad, la EA se clasifica en dos formas. La primera es la EA de inicio precoz (EOAD), donde la aparición ocurre con mayor frecuencia antes de los 65 años; Este formulario representa menos del 5% de los casos de DA. Es una forma de DA poco frecuente y autosómica, que da lugar a mutaciones totalmente penetrantes en la proteína precursora amiloide ( APP) ⁴ , presenilina 1 ( PSEN1 ) ⁵ o presenilina 2 ( PSEN2 )> 6 genes. En segundo lugar, la forma más común de la enfermedad (> 90% de los casos de EA) se llama "tardía" esporádica (LOAD) y generalmente ocurre en individuos de 65 años o más. Es el resultado de múltiples factores de riesgo genéticos y ambientales ⁷ . En LOAD, el 4 alelo de la apolipoproteína E ( APOE ) gen es el principal factor de riesgo genético ^{8 , 9} . Por otra parte, más de 20 loci genes han sido identificados por el genoma de todo los estudios de asociación (GWAS) como estando asociado con el riesgo de AD, uno de los cuales es el componente del complemento (3b / 4b) receptor 1 ( CR1 ) gen ¹⁰ , situado en Cromosoma 1q32 en un grupo de proteínas relacionadas con el complemento. El gen CR1 codifica la proteína del receptor del complemento tipo 1 (CR1), un componente de los reguladores de actividad del complemento.

CR1 (el receptor C3b / C4b, CD35), una glicoproteína transmembrana de aproximadamenteEly 200 kDa ¹¹ , se une a la C3b, C4b, C3bi, C1q, la lectina de unión a manano (MBL), y las proteínas de complemento de ficolina ¹² . La función biológica de CR1 varía con los tipos celulares en los que se expresa. En los seres humanos, el 90% de la circulación total CR1 se encuentra en los glóbulos rojos (glóbulos rojos) [ ^13] . Presente en la superficie de los glóbulos rojos, CR1 se une a los microorganismos o inmunocomplejos opsonizados C3b o C4b, facilitando su eliminación de la circulación. Los complejos unidos a CR1 son de hecho transferidos a fagocitos cuando los hematíes pasan por el hígado y el bazo ^{11 , 14} . Al limitar la deposición de C3b y C4b, CR1 podría prevenir la activación excesiva del complemento. Por lo tanto, la expresión de CR1 en los glóbulos rojos se considera un elemento esencial en la protección de los tejidos, como el sistema nervioso cerebral, contra la deposición del complejo inmune y las enfermedades resultantes. El CR1 en los glóbulos rojos es también conocido porJuegan un papel importante en la infección patógena ^{15 , 16} . Además, CR1, como un actor clave en la inmunidad innata, participa en la regulación de la cascada del complemento y en el transporte y la eliminación de complejos inmunes. CR1 ejerce esta actividad uniendo fragmentos C3b y C4b y disociando las convertasas clásicas y alternativas (disociación de C2a del complejo C4b2a y disociación de C3b del complejo C3bBb). Como cofactor del factor de proteasa de serina plasmática I (FI), CR1 inhibe las vías de complemento clásicas y alternativas aumentando la escisión de C4b y C3b por FI, una propiedad conocida como actividad de cofactor (CA) e inhibiendo el bucle de amplificación C3 , Evitando a su vez la activación adicional del complemento. Rogers y colegas proporcionan evidencia de que el péptido Aβ puede unirse y activar la vía del complemento en ausencia de anticuerpos ¹⁷ y sugieren que el péptido Aβ es clEared de la circulación a través de adherencia dependiente del complemento a la CR1 expresada en RBCs [ ^18] .

CR1 exhibe tres tipos de polimorfismos: polimorfismos estructurales o de longitud, polimorfismos de densidad y polimorfismos Knops de grupos sanguíneos [ ^{11 , 19]} . El polimorfismo estructural está relacionado con una variación en el número de repeticiones homólogas largas (LHR) y, por tanto, define cuatro isoformas. De hecho, el dominio extracelular de la proteína CR1 está compuesto por una serie de unidades repetitivas, denominadas repeticiones de consenso cortas (SCR) o repeticiones de control del complemento (CCP). Estos SCR se han demostrado a partir del ácido desoxirribonucleico del complemento (ADNc) que codifica CR1. Los SCRs están dispuestos en grupos tándem de siete, conocidos como LHRs. CR1 está dispuesto en cuatro LHR, designados como LHR-A, -B, -C, y -D, que surgen de la duplicación de una unidad ^de siete SCR ^{19 , 20 ,21} .

En orden creciente de frecuencia, estas isoformas CR1 determinadas por Western blot (WB) son CR1 * 1 (A / F) (migración rápida por electroforesis en gel), CR1 * 2 (B / S) (migración lenta por electroforesis en gel), CR1 * 3 (C / F ') y CR1 * 4 (D). Las dos isoformas más comunes, CR1 * 1 (A / F) y CR1 * 2 (B / S), se componen de cuatro y cinco LHRs, respectivamente, mientras CR1 * 3 (C / F`) y CR1 * 4 (D ) Se componen de 3 y 6 LHRs, respectivamente. La isoforma más común (CR1 * 1), compuesta por 30 SCRs, contiene tres sitios de unión a C4b (SCRs 1-3; 8-10 y 15-17) y dos sitios de unión a C3b (SCRs 8-10 y 15-17) , Mientras que los SCR 22-28 se unen a C1q, ficolins y MBL ^{12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} . Por tanto, CR1 * 2 contiene un sitio de unión C3b / C4b adicionalD a CR ^ {1} * 1. La Figura 1 ilustra las estructuras, nomenclaturas y pesos moleculares de las cuatro isoformas diferentes de CR1.

El polimorfismo de densidad corresponde a un fenotipo estable que representa el nivel de expresión constitutiva de CR1 en los glóbulos rojos. En sujetos caucásicos sanos, se ha demostrado que el número de moléculas CR1 por RBC puede variar hasta un factor de diez (variando de 150 a 1.200 moléculas por célula) ²⁶ . Los glóbulos rojos del fenotipo Helgeson tienen una densidad CR1 muy baja, que se mostró ser inferior a 150 moléculas por célula ^{27 , 28} . La densidad de CR1 en los glóbulos rojos está genéticamente asociada con un sistema bialélico codominante autosómica en el gen CR1 , correlacionado con un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción Hin dIII (RFLP) [ ^29] . Una mutación de punto único en Intron 27 del gen CR1, entre los exones que codifican el segundoSCR en LHR-D, da lugar a la generación de un polimórfico Hin dIII sitio dentro de esta región [ ^30] . Los fragmentos genómicos Hin dIII de 7,4 y 6,9 kDa identifican alelos asociados con alta densidad de alelo (H alelo) o baja (alelo L) CR1 en glóbulos rojos, respectivamente. Sin embargo, no se encontró correlación entre la densidad de CR1 en los glóbulos rojos y polimorfismos Hin dIII en algunas poblaciones de África occidental ^{31 , 32} . El mecanismo que une la regulación de la densidad CR1 a un polimorfismo Hin dIII no codificante sigue siendo desconocido. Entre varios polimorfismos, Q981H en SCR16 y P1786R en SCR28 se han informado de estar vinculados a la CR1 densidad en los glóbulos rojos ^{30 , 33} .

El polimorfismo Knops (KN), según la nomenclatura internacional, es el 22º sistema de grupos sanguíneos que será indexado por la Sociedad Internacional de Transfusión de Sangre. Contiene 9 antígenos específicosY KN3 / KN6, así como 3 antígenos aislados, KN5, KN8, KN9, KN1 / KN2, KN3 / KN6 y KN4 / KN7. Los antígenos KN1, KN3, KN4 y KN5 son antígenos de alta frecuencia del sistema KN ( es decir, expresados ​​en más del 99% de la población general). Sin embargo, el papel de este polimorfismo en la DA aún no se ha determinado [ ^13] .

El protocolo descrito en este trabajo fue diseñado para determinar la CR1 longitud polimorfismo genotipos implicados en la susceptibilidad a varias enfermedades, como la EA, el lupus eritematoso sistémico, y la malaria. Nuestro método para la determinación del polimorfismo de longitud de CR1 aprovecha el número de LHR-Bs que comprende las isoformas CR1 y de las diferencias de secuencia entre LHR-B y LHR-C ( Figura 2 ).

El protocolo para la recolección y manejo de sangre humana fue revisado y aprobado por el comité regional de ética (CPP Est II), y el número de protocolo es 2011-A00594-37.

NOTA: El siguiente protocolo describe el manejo de la sangre humana. Por favor siga las pautas institucionales mientras que elimine el material biohazardous. Equipo de seguridad de laboratorio, como batas de laboratorio y guantes, deben ser usados. En la Figura 3 se muestra un diagrama de flujo que describe el protocolo.

1. Sangre y extracción de ADN fluido corporal

1. Pipetee 20 μL de proteinasa K (15 μg / μl) en el fondo de un tubo de 1,5 ml.
2. Añadir 200 μl de muestra al tubo de 1,5 ml. Utilizar hasta 200 μL de sangre entera, plasma, suero, capa leucocitaria o fluidos corporales, o hasta 5 x 10 ⁶ linfocitos en 200 μl de PBS.
3. Añadir 200 μl de tampón de lisis a la muestra. Mezclar por vórtice de pulso durante 15 s.
4. Incubar a 56 ° C durante 10 min en un baño de agua.
5. Centrifugar brevemente el tubo de 1,5 ml para eliminar las gotas del interior de la tapa.
6. Añadir 200 μl de etanol (96-100%) a la muestra y mezclar de nuevo mediante vórtex pulsado durante 15 s. Después de mezclar, centrifugar brevemente el tubo de 1,5 ml para retirar las gotas del interior de la tapa.
7. Aplicar cuidadosamente la mezcla del paso 1.6 a la columna de membrana (en un tubo de recogida de 2 ml). Sin mojar la llanta, cerrar la tapa y centrifugar a 6.000 xg durante 1 minuto. Coloque la columna de membrana en un tubo de recogida limpio de 2 ml y deseche el tubo que contiene el filtrado.
8. Abra cuidadosamente la columna de membrana y añada 500 μl de tampón de lavado 1 sin mojar la llanta. Cerrar la tapa y centrifugar a 6.000 xg durante 1 min. Coloque la columna de membrana en un tubo de recogida limpio de 2 ml y deseche el tubo que contiene el filtrado.
9. Abrir cuidadosamente la columna de membrana y añadir 500 μl de tampón de lavado 2 sin mojarBorde Cerrar la tapa y centrifugar a velocidad máxima (20.000 xg) durante 3 min.
10. Coloque la columna de membrana en un nuevo tubo de recogida de 2 ml y deseche el tubo de recogida con el filtrado. Centrifugar a 20.000 xg durante 1 min.
11. Coloque la columna de membrana en un tubo limpio de 1,5 ml y deseche el tubo de recogida que contiene el filtrado.
12. Abra con cuidado la columna de membrana y añada 200 μl de agua destilada. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego centrifugar a 6.000 xg durante 1 min.
13. Proceder a la determinación del paso de concentración de ADN o congelar las muestras de ADN a -20ºC

2. Determinación de la concentración de ADN

NOTA: Consulte la Figura 4 .

1. Pulse 1 para seleccionar el modo de ADN en un espectrofotómetro. Seleccione una longitud de trayectoria de 5 mm usando las flechas izquierda y derecha. Seleccione un factor de dilución de 1 usando las flechas izquierda y derecha.
2. Seleccione la unidad (μg / ml)E flechas izquierda y derecha. Seleccione un factor de 50 usando las flechas izquierda y derecha. Presione OK .
3. Pipetee 10 μl de agua destilada en la cubeta. Colocar la cubeta en el espectrofotómetro. Presione el botón OA / 100% T.
4. Pipetear 10 μL de la muestra de ADN (dilución 1/4 en agua destilada) en la cubeta. Colocar la cubeta en el espectrofotómetro. Pulse el botón verde (lectura / inicio). Observe la concentración.
5. Congelar la muestra de ADN a -20ºC.

3. Protocolo HRM-PCR

1. Descongele las muestras de ADN. Diluir las muestras de ADN en tubos de 1,5 mL con agua para ajustarlas a una concentración de 10 ng / μl
   NOTA: El volumen total de ADN diluido debe estar entre 2 μL y 10 μL.
2. Descongele las soluciones de imprimación. Diluir las soluciones de imprimación en tubos de 1,5 ml con agua para ajustarlas a la misma concentración de 6 μM.
   NOTA: Las secuencias de cebador y las condiciones de reacción se proporcionan en TCapaz 1.

Tabla 1: Primers y parámetros utilizados en el análisis de fusión de alta resolución.

3. Descongelar las soluciones del kit de HRM-PCR y mezclar cuidadosamente mediante vortex para asegurar la recuperación de todos los contenidos. Brevemente girar los tres viales que contienen la mezcla enzimática con ADN colorante de unión, MgCl _2, y el agua en una microcentrífuga antes de abrirlos. Guárdelos a temperatura ambiente.
4. En un tubo de 1,5 ml a temperatura ambiente, preparar la mezcla de PCR para una reacción de 20 μL añadiendo los siguientes componentes en el orden que se muestra a continuación:
   1. 10 μL de mezcla enzimática con un colorante de unión al ADN;
   2. 2 mu l de MgCl _ { ₂ } 25 mM;
   3. 1 μl de cebador 1, 6 μM (concentración final: 300 nM);
   4. 1 μl de cebador 2, 6 μM (concentración final: 300Nuevo Méjico); y
   5. 5 μl de agua.
      NOTA: Para preparar la mezcla de PCR para más de una reacción, multiplique los volúmenes anteriores por el número de reacciones a ejecutar, más una reacción adicional.
5. Mezclar cuidadosamente con vórtex.
6. Pipetee 19 μL de mezcla de PCR, preparada anteriormente, en cada pocillo de una placa de pocillos blancos.
7. Añadir 1 μl de molde de ADN ajustado a la concentración, preparado en el paso 3.1.
   NOTA: Para las reacciones de control, ejecute siempre un control negativo con las muestras. Para preparar un control negativo, reemplace el ADN molde con agua.
8. Selle la placa blanca multihusillo con papel de sellado.
9. Coloque la placa blanca multipocillos en la centrífuga y equilibrela con un contrapeso adecuado ( es decir, otra placa multipocillos). Centrifugar durante 1 minuto a 1.500 xg en una centrífuga de balancín estándar que contiene un rotor para placas de pozo múltiple con adaptadores adecuados.
10. Cargue la placa de pocillos blancos en el instrumento HRM-PCR.
11. Inicie el programa de HRM-PCR con las siguientes condiciones de PCR:
    
    Desnaturalización: 95ºC durante 10 min; 1 ciclo.
    Amplificación: 95ºC durante 10 s, 62ºC durante 15 s, y 72ºC durante 20 s; 47 ciclos.
    Curva de fusión: 95ºC; Velocidad de rampa: 0,02 ° C / s; 25 adquisiciones por ° C; 1 ciclo.
    Enfriamiento: 40ºC durante 30 s; Velocidad de rampa 2,2 ° C / s; 1 ciclo.

4. Análisis de HRM para determinar el polimorfismo de longitud CR1

NOTA: La metodología descrita ( Figura 5 ) es específica de nuestro software (ver la Tabla de Materiales ), aunque se pueden usar otros paquetes de software.

1. Abra un software de exploración génica para realizar el análisis de polimorfismo de longitud de polimorfismo CR1.
2. Abrir el experimento que contiene el programa de amplificación y el programa de la curva de fusión.
3. Haga clic en Editor de muestras en la barra de módulos y, a continuación, seleccione SProceso de envasado .
4. Definir las propiedades de las muestras ( es decir, nombre, control desconocido o negativo).
5. Haga clic en Análisis en la barra de módulos .
6. En la lista Crear nuevo análisis , seleccione Exploración de genes.
7. Haga clic en la ficha Normalización para normalizar las curvas de fusión.
8. Haga clic en la pestaña Cambio de temperatura para restablecer el eje de temperatura (eje x) de las curvas de fusión.
   NOTA: El gráfico inferior muestra las curvas de fusión que están normalizadas y cambiadas de temperatura.
9. Haga clic en el botón Calcular para analizar los resultados y determinar el agrupamiento.
10. Haga clic en la pestaña parcela Diferencia en el área de gráficos para ver las curvas de fusión normalizados y se movió y la trama normalizado y la diferencia de temperatura desplazado.

La Figura 6 A muestra el fenotipado del polimorfismo de longitud CR1 por WB. La Figura 6 B y C muestra las curvas que se obtienen durante el análisis de HRM-PCR, permitiendo la determinación del polimorfismo de la longitud de CR1. El análisis de las curvas de fusión usando el software después de la fusión de alta resolución de los amplicones derivados de PCR del ADN genómico de sujetos con diferentes isoformas CR1 produce curvas que discriminan sujetos de acuerdo con sus fenotipos de expresión alotípicos de CR1.

La Figura 6 B muestra un primer modo de presentación, denominado "Curvas de fusión normalizadas y desplazadas", mientras que la Figura 6 C muestra un segundo modo de presentación, denominado "Trazado de diferencia normalizado y desplazado por temperatura".

Los perfiles de las curvas se distribuyen de acuerdo con los grupos que representan los fenotipos mostrados en la Figura 6 A : (CR1 * 3, CR1 * 1); (CR ^ {1} * 1, CR ^ {1} * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Y (CR1 * 2, CR ^ {1} ^ {4}). Esto permite el genotipado del polimorfismo de longitud CR1 utilizando este nuevo método de biología molecular.

Figura 1: Representación esquemática de la estructura y polimorfismos de la proteína del complemento receptor 1. Cada repetición de consenso corto (SCR) o proteína de control del complemento (PCC) está representada por un círculo. Los SCR se agrupan en estructuras repetitivas de orden superior llamadas LHRs. Desde el dominio extracelular hasta la membrana celular, las LHR son: LHR-A, -B, -C, -D y -S (LHR suplementaria o adicional). En la isoforma CR1 más común(CR1 * 1), el sitio de unión de actividad de aceleración de C4b / decaimiento (DAA) se localiza en LHR-A (SCRs 1-3, círculos verdes), el sitio de unión de actividad C3b / C4b / cofactor (CA) Los SCR N-terminales de LHR-B (SCRs 8-10, círculos rojos) y LHR-C (SCRs 15-17, círculos púrpuras) y el sitio de unión para C1q / MBL y ficolina se encuentran en el LHR-D (SCRs 22-28, círculos azules). Las estructuras homólogas están coloreadas de forma idéntica. La isoforma CR1 * 2 (S) presenta una LHR adicional (LHR-S) y por lo tanto contiene un sitio de unión C3b / C4b adicional. KDa, kilodalton. NRC, condiciones no reducidas. RC, condiciones reducidas. TM, dominio transmembrana. Esta figura fue adaptada de Brouwers et al. ³⁶ con el permiso de Nature Publishing Group. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

"/files/ftp_upload/56012/56012fig2.jpg" />
Figura 2 : Representación esquemática de la estructura de la isoforma CR1 con posiciones de amplicón de secuencia obtenidas por HRM-PCR. Cada cuadro representa un SCR. Los SCR se agrupan en LHRs: LHR-A, -B, -C y -D. Las estructuras homólogas están coloreadas de forma idéntica. Las isoformas CR1 * 2 y CR1 * 4 presentan LHRs adicionales (LHR-B) y por lo tanto contienen un área de amplicón adicional (amplicón B, en rojo). CR1 * 3 carece de LHR-B y contiene menos área de amplicón (falta de amplicón B). Las diferencias de nucleótidos entre el amplicón B (196 pb) y el amplicón invariante (197 pb) se representan en rojo y azul, respectivamente. Las diferencias en la proporción: (amplicón B, en rojo / amplicón invariante, en azul) entre cada isoforma CR1 son determinados por la HRM-PCR, lo que permite el genotipo. Las secuencias de cebador CN3 y CN3re están subrayadas. TM, dominio transmembrana. CYT, cola citoplasmática.Pg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diagrama de flujo del protocolo para el genotipo del polimorfismo de la longitud CR1 de muestras de sangre humana. Recoger una muestra de ADN humano. Extraer el ADN para obtener una muestra de sangre de ADN. Determine la concentración de ADN y diluya para obtener la concentración de ADN a 10 ng / μl. Utilizar HRM-PCR para obtener el genotipo del polimorfismo de longitud CR1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Capturas de pantalla del espectrofotómetro Para determinar la concentración de ADN. Pulse 1 ( A ) para seleccionar el modo de ADN en el espectrofotómetro. Seleccione una longitud de la trayectoria de 5 mm ( B ) usando las flechas izquierda y derecha ( C ). Seleccione la unidad (μg / mL) ( D ) usando las flechas izquierda y derecha ( C ). Seleccione el factor de dilución 1 ( E ) usando las flechas izquierda y derecha ( C ). Seleccione un factor de 50 ( F ) usando las flechas izquierda y derecha. Pulse OK ( G ). Pipetee 10 μl de agua destilada en la cubeta. Colocar la cubeta en el espectrofotómetro ( H ). Pulse el botón OA / 100% T ( I ). Pipetar 10 μL de muestra de ADN (1/4 de dilución en agua destilada) en la cubeta. Colocar la cubeta en el espectrofotómetro ( K ). Pulse el botón verde (lectura / inicio) ( L ). Obsérvese la concentración ( M ).Es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Capturas de pantalla de la interfaz gráfica del software utilizado en el paso 4 del protocolo. ( A ) Abra el software de exploración genética. ( B ) Programa de amplificación y programa de curva de fusión. ( C ) Haga clic en Sample editor en la barra de módulos . ( D ) Seleccione Explorar . ( E ) Definir las propiedades de las muestras. ( F ) Haga clic en Análisis en la barra de módulos . ( G ) Haga clic en la ficha Normalización para normalizar las curvas de fusión. ( H ) Haga clic en la pestaña Cambio de temperatura para mostrar las curvas de fusión que son ambasNormalizado y con cambios de temperatura. ( I ) Haga clic en el botón Calcular para analizar los resultados y determinar el agrupamiento. ( J ) Haga clic en la pestaña Pliego de diferencias para ver las curvas de fusión normalizadas y desplazadas y la trama de diferencia normalizada y desplazada por temperatura . ( K ) Agrupación de color de las muestras de acuerdo con los genotipos de longitud CR1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Fenotipado de los polimorfismos de longitud de CR1 observados en el WB y sus correspondientes curvas de perfil obtenidas por HRM-PCR. ( A ) Fenotipificación de los polimorfismos de longitud CR1 utilizando WB. B ) y ( C ) genotipificación de los polimorfismos de la longitud CR1 mediante análisis de HRM-PCR. El análisis de la curva HRM de amplicones de PCR obtenidos del ADN genómico de sujetos que muestran diferentes isoformas de CR1 condujo a la identificación de perfiles de curvas específicos: (CR1 * 3, CR1 * 1) (morado); (CR1 * 1, CR1 * 2) (azul); CR1 * 1 (verde); CR1 * 2 (rojo); Y (CR1 * 2, CR1 * 4) (gris). Estos corresponden a los alelos de polimorfismo de longitud CR1. Como se muestra por los dos modos de presentación, las curvas de fusión normalizada y desplazada (B) y la trama de diferencia normalizada y desplazada por temperatura (C), los perfiles de las curvas se distribuyen de acuerdo con (CR1 * 3, CR1 * 1) ; (CR ^ {1} * 1, CR ^ {1} * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Y (CR1 * 2, CR1 * 4). Esta figura fue adaptada de Mahmoudi et al. ³⁸ con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí, describimos una metodología ampliamente accesible para el estudio de los polimorfismos de longitud CR1. Las técnicas de biología molecular para la amplificación o la hibridación segmentaria nunca han sido capaces de dar resultados satisfactorios que permitan la determinación de los polimorfismos de longitud CR1 en todos los individuos. Esto se debe a la estructura repetitiva del gen CR1 ( es decir, los SCR altamente repetitivos de CR1). El método de biología molecular descrito aquí explora la distribución cuantitativa de LHR-B en la molécula CR1. La molécula CR1 incluye n dominios LHR-B, donde n es un número entre 0 y 3, y solo un dominio LHR-C, tal como se describe e ilustra en la Figura 2 . La detección cuantitativa del dominio B permite discriminar perfectamente un dominio adicional o faltante B.

A partir del material genético extraído, se amplifica un primer fragmento de ADN de LHR-B por PCR utilizando un solo par de cebadores específicos,Una variante característica de LHR-B llamada "variante del amplicón B". Un segundo fragmento de ADN, llamado "amplicón invariante" y perteneciente a LHR-C, también se amplifica. Este segundo fragmento de ADN es un fragmento de LHR-C, pero también se puede usar otro fragmento invariante de LHR-A o -D.

Los dos fragmentos de ADN, variante del amplicón B y el amplicón invariante, son amplificados por los mismos cebadores y presentan cinco diferencias en las secuencias de nucleótidos. Esta característica hace posible en el siguiente paso determinar el número de variantes de amplicón B y el número de amplicones invariantes utilizando una herramienta de biología molecular cuantitativa HRM, que fue adaptada para este propósito. La relación entre el número de amplicón B y el amplicón invariante (proporción: amplicón B / amplicón invariante) varía según la longitud de la molécula CR1. De hecho, CR1 * 4 muestra 3 unidades de amplicón B a 1 amplicón invariante, CR1 * 2 muestra 2 unidades de amplicón B a 1 amplicón invariante, CR1 * 1 muestra 1 amplicón B a 1 amplicón invariante, y CR1 * 3 muestra 0 unidades de amplicón B a 1 amplicón invariante ( Figura 2 ). Por lo tanto, este método HRM-PCR permite la genotipificación de la CR1 longitud polimorfismo.

Sin embargo, al inicio del estudio, esta técnica requiere el uso de sujetos de referencia cuyos fenotipos CR1 ya son conocidos ( es decir, previamente establecidos por WB) para poder establecer el genotipado de CR1 según el perfil de referencia de las curvas obtenidas Por HRM-PCR. Se dispone de dos tipos de representación, a saber, "Curvas de fusión normalizadas y desplazadas" y "Gráfico de diferencias normalizadas y desplazadas en función de la temperatura". Presentan grupos distintos de perfiles de curvas coloreados de acuerdo con el fenotipo de polimorfismo de longitud CR1 obtenido por WB ( Figura 6 ). Desde el paso "Curvas de fusión normalizadas y desplazadas", nuestro método permite discriminarE grupos distintos de curvas correspondientes a las isoformas de CR1, agrupadas por color. Sin embargo, el "Gráfico de diferencia normalizado y desplazado por temperatura", que corresponde a una representación matemática diferente, permite una visualización más fácil de los distintos grupos de curvas. Aunque el software del fabricante se usó rutinariamente en este estudio, otro software (como uANALYSE) podría ser utilizado como un programa de extracción de datos para el análisis de curvas.

Hasta la fecha, la técnica de análisis de WB es la técnica original que permite la identificación de los diferentes polimorfismos de longitud de CR1 a nivel de la proteína. Sin embargo, esta técnica tiene una serie de desventajas. En particular, el análisis de proteínas por WB sólo puede hacerse después de la extracción de las membranas celulares. Como resultado, es complejo y requiere mucho tiempo. Por otra parte, esta técnica requiere la obtención de una muestra de sangre fresca en condiciones apropiadas al comienzo del procedimiento para lograr res útilesUlts. Por el contrario, HRM-PCR realizada en el ADN hace posible utilizar incluso manchas de sangre seca o muestras después de un almacenamiento a largo plazo. HMR-PCR requiere un instrumento especializado en la fundición de ADN, ya sea un instrumento dedicado o un termociclador de capacidad HMR con software HRM. SNP detección depende de varios factores: i) SNPs incluidos en grandes fragmentos de PCR son más difíciles de detectar que los mismos SNPs en pequeños fragmentos de PCR; Ii) los SNP pertenecientes a las clases III y IV son más difíciles de detectar que los de las clases I y II ³⁴ ; Y iii) los SNP que están flanqueados por la simetría de base del vecino más próximo ( por ejemplo, 5'-G (G / C) C-3 ') no pueden clasificarse por fusión, independientemente del poder de resolución de la plataforma HMR. Puede ser útil probar los fragmentos de PCR predichos que contienen el SNP de interés con el software uMELT ³⁵ para evaluar la validez del ensayo. Por último, HMR-PCR es un método analógico, lo que significa que la similitud de las curvas de fusión apuestaEntre una referencia y una plantilla no implica necesariamente que la secuencia de molde sea idéntica a la referencia, ya que la secuencia de plantilla puede ser diferente de la referencia pero termodinámicamente equivalente. Sin embargo, estas limitaciones no se aplican al método descrito aquí, que se basa en la fusión de una mezcla de amplicones que difieren en términos de secuencias de 5 nucleótidos.

Además, la técnica descrita aquí, basada en el análisis de HRM, tiene muchas ventajas. En primer lugar, los polimorfismos de longitud de CR1 se determinan más rápidamente, ya que los resultados se obtienen en aproximadamente 2 h una vez que se ha realizado la extracción del material genético. Por el contrario, las técnicas bioquímicas tradicionales basadas en análisis de proteínas WB requieren etapas que son relativamente largas: la electroforesis de los extractos de membrana celular a través de un gel de acrilamida, un paso para transferir proteínas a una membrana de nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno (PVDF) Isoformas delCR1 por inmunoquimioluminiscencia. En segundo lugar, la técnica HRM-PCR también tiene la ventaja de no ser demasiado costosa, lo cual es particularmente importante para un método que se puede aplicar a muchos individuos ( es decir, a gran escala) para determinar su susceptibilidad al desarrollo de patologías como la enfermedad de Alzheimer, Lupus o malaria.

Recientemente, nosotros y otros hemos demostrado que la isoforma CR1 * 2, que contiene un sitio adicional de unión C3b / C4b, se asoció con AD ^{36 , 37 , 38} . En nuestro estudio publicado anteriormente, los polimorfismos de longitud CR1 a nivel del gen y la proteína fueron consistentes en el 98,9% de los sujetos [ ^38] . Los resultados discordantes obtenidos al comparar los polimorfismos de longitud obtenidos por HRM-PCR con los obtenidos por WB correspondieron a sujetos con un perfil de genotipo (CR1 * 1, CR1 * 2) determinado por HRM (gen) pero exPresionando sólo la isoforma CR1 * 1 en la superficie del eritrocito según WB (proteína). En nuestro estudio, la falta de expresión de la isoforma CR1 * 2 (individuos portadores de un alelo silencioso) fue reproducible cuando el WB se realizó con un tiempo de exposición más largo y podría explicarse por la existencia de un alelo silencioso CR1 (CR1 * 2), descrito En la literatura por Helgeson [ ^39] . Sin embargo, se necesitan más estudios sobre poblaciones más grandes para apoyar esta hipótesis.

Cabe señalar que los SNPs privados (SNPs que sólo se producen en un pequeño grupo familiar o incluso en un solo individuo) condujo a perfiles de curva distinta que debe ser descifrado utilizando la determinación de fenotipo de referencia (WB), pero que no se puede confundir con el perfil canónico para evitar Cualquier mala interpretación del genotipo del polimorfismo de longitud CR1.

Los autores son los inventores de una patente propiedad de la Universidad de Reims Champagne-Ardenne (URCA) (número de patente WO 2015166194)

Agradecemos a todos los miembros de la Plataforma Regional de Biología Innovante, al personal del Departamento de Inmunología y al personal del Departamento de Medicina Interna y Geriatría, quienes contribuyeron a optimizar y validar el protocolo. Este trabajo fue financiado por los Hospitales de la Universidad de Reims (número de la concesión AOL11UF9156). También agradecemos a Fiona Ecarnot (EA3920, Hospital Universitario de Besançon, Francia) por su ayuda editorial.