Múltiples pasos Fotolitografia variable Altura de múltiples capas con válvula dispositivos de microfluidos

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined.

Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Durante los últimos 15 años, la microfluídica como campo ha experimentado un rápido crecimiento, con una explosión de nuevas tecnologías que permiten la manipulación de fluidos en la escala micrométrica ^1. Sistemas microfluídicos son plataformas atractivas para la funcionalidad de laboratorio húmedo debido a que los pequeños volúmenes tienen el potencial de comprender el incremento de la velocidad y la sensibilidad mientras que al mismo tiempo aumentar de forma espectacular el rendimiento y reducir el costo mediante el aprovechamiento de las economías de escala ^{2, 3.} Sistemas de microfluidos de capas múltiples han hecho impactos particularmente significativas en aplicaciones de análisis bioquímicos de alto rendimiento tales como el análisis sola célula ^{4, 5, 6,} el análisis de una sola molécula (por ejemplo, digital PCR ^7), la cristalografía de proteínas ^8, ensayos de unión de factor de transcripciónf "> ^{9, 10,} y el cribado celular ^11.

Un objetivo central de la microfluídica ha sido el desarrollo de "laboratorio en un chip" dispositivos capaces de realizar manipulaciones de fluidos complejos dentro de un solo dispositivo para el análisis bioquímico total de ^12. El desarrollo de técnicas de litografía blanda multicapa ha ayudado a conseguir este objetivo al permitir la creación de válvulas on-chip, mezcladoras y bombas para el control activo de los fluidos dentro de pequeños volúmenes ^{13, 14, 15.} A pesar de sus ventajas y aplicaciones demostradas, muchas de estas tecnologías de microfluidos, siguen siendo ampliamente incontrolados que los usuarios no especializados. La adopción generalizada ha sido un desafío, en parte, debido al acceso limitado a las instalaciones de microfabricación, pero también debido a la falta de comunicación de las técnicas de fabricación. Esto es especialmente cierto for dispositivos de microfluidos de capas múltiples que ofrecen las estructuras de las válvulas o geometrías complejas: la escasez de información detallada y práctica acerca de los parámetros de diseño importantes y técnicas de fabricación a menudo hace que los nuevos investigadores de embarcarse en proyectos relacionados con el diseño y la creación de estos dispositivos.

Este artículo tiene como objetivo hacer frente a esta falta de conocimientos mediante la presentación de un protocolo completo para la fabricación de dispositivos de microfluidos de capas múltiples con válvulas y características de altura variable, a partir de los parámetros de diseño y moviéndose a través de todas las etapas de fabricación. Al centrarse en las etapas iniciales de la fabricación de fotolitografía, este protocolo complementa otros protocolos de microfluidos ¹⁶ que describen los pasos intermedios de fundición dispositivos de moldes y llevar a cabo experimentos específicos.

Los dispositivos microfluídicos con válvulas monolítico en el chip se componen de dos capas: una capa de "flujo", en el que el fluido de interés se manipula en microcanales, y una capa de "control", donde microcanales que contienen aire o agua pueden modular selectivamente el flujo de fluido en la capa de flujo ^14. Estas dos capas se fabrican cada uno en un maestro de moldeo de silicio separado, que se utiliza a continuación para polidimetilsiloxano (PDMS) de moldeo de réplica en un proceso llamado "litografía blanda ^17". Para formar un dispositivo de múltiples capas, cada una de las capas de PDMS son echados en sus respectivos maestros de moldeo y después se alinean entre sí, formando de este modo un dispositivo de PDMS compuesto con canales en cada capa. Las válvulas se forman en los lugares donde los canales de flujo y de control se cruzan entre sí y están separados por solamente una membrana fina; presurización del canal de control desvía esta membrana para ocluir el canal de flujo y desplazar localmente el fluido (Figura 1).

Activo válvulas en el chip pueden ser fabricados de varias maneras, dependiendo de la aplicación final deseada. válvulaspuede ser configurado, ya sea en una geometría de "empujar hacia abajo" o "empujar hacia arriba", dependiendo de si la capa de control está por encima o por debajo de la capa de flujo (Figura 1) ^15. "Empuje hacia arriba" geometrías permiten presiones de cierre más bajos y mayor estabilidad dispositivo contra la deslaminación, mientras que "empuje hacia abajo" geometrías permiten los canales de flujo para estar en contacto directo con el sustrato adherido, que confiere la ventaja de funcionalización selectiva o patrón de la superficie del sustrato para una funcionalidad más tarde ^{18, 19.}

Las válvulas también pueden ser de forma deliberada con fugas válvulas "tamiz" o completamente sellable, dependiendo del perfil de la sección transversal del canal de flujo. Válvulas Sieve son útiles para la captura de perlas, células u otros macroanalytes ^1, y se fabrican mediante el uso de las resinas fotosensibles negativos típicos (es decir, SU-8 de la serie), que hacinco perfiles rectangulares. Cuando un canal de control se somete a presión sobre estas regiones de la válvula, la membrana de PDMS entre el control y la capa de flujo desvía isótropa en el perfil rectangular de la válvula sin el sellado de las esquinas, lo que permite el flujo de fluido pero atrapando las partículas de macro escala (Figura 1). Por el contrario, las válvulas de microfluidos totalmente herméticos se fabrican mediante la inclusión de un pequeño parche de resina fotosensible redondeada en lugares de válvula. Con esta geometría, la presurización del canal de control desvía la membrana contra la capa de flujo redondeada para sellar completamente el canal, deteniendo el flujo de fluido. Perfiles redondeados en la capa de flujo se generan a través de la fusión y el reflujo de fotoprotector positivo (por ejemplo, XT AZ50 o SPR 220) después de las etapas típicas de fotolitografía. Hemos demostrado anteriormente que las alturas de post-reflujo de las regiones de las válvulas dependen de las dimensiones de características elegidas ^21. Este protocolo demuestra la fabricación de válvulas con ambas geometríasen un dispositivo de síntesis de perlas.

Figura 1: múltiples capas de microfluidos Válvula de geometrías. "empuja hacia arriba" arquitecturas de dispositivos típicos para la criba y válvulas totalmente herméticos antes y después de la presurización (arriba) (parte inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los dispositivos también pueden incluir características pasivas complejas tales como mezcladores caóticos y ¹³ en el chip resistencias ²⁰ que requieren características de múltiples alturas diferentes dentro de una sola capa de flujo. Para lograr una capa de flujo de altura variable, diferentes grupos han empleado muchos métodos que incluyen el grabado impresos del circuito ^22, de múltiples capas PDMS alineación de alivio ^23, o de múltiples pasos photolithography ^24. Nuestro grupo ha encontrado multi-paso de fotolitografía en un único maestro de moldeo para ser un método eficaz y reproducible. Para ello, se emplea una simple técnica de fotolitografía de la construcción de canales de gruesos fotorresistente negativo (por ejemplo, SU-8 resinas fotosensibles de la serie) en las capas sin desarrollo en entre la aplicación de cada capa. Cada capa se hace girar en fotoprotector negativo de acuerdo a su espesor utilizando las instrucciones del fabricante ²⁵ en el maestro de silicio. Las características de esta altura son luego modelada sobre la capa usando una máscara de transparencia específico (Figura 2) fijado a una placa de máscara de cristal y alineados a la capa previamente hilado antes de la exposición. En múltiples pasos fotolitografía, una alineación precisa entre las capas es fundamental en la formación de un canal de flujo completo de altura variable. Después de la alineación, cada capa se somete a una cocción posterior a la exposición espesor-dependiente. Sin el desarrollo, la siguiente capa es similarly modelado. De esta manera, las características de altura se pueden construir en una única oblea de flujo de la capa por capa a través del uso de múltiples máscaras. Omitiendo el desarrollo entre cada paso, las capas fotorresistentes anteriores se pueden utilizar para generar características de altura de material compuesto (es decir, dos capas 25 micras pueden hacer una función de 50 micras) ^24. Además, las características del piso del canal, como ranuras de espiga mezclador caótico ¹³ se pueden hacer usando capas con características anteriormente expuestas. Un paso desarrollo final completa el proceso, la creación de una sola oblea de flujo con características de altura variable (Figura 3).

Aquí, se proporciona un protocolo completo para multi-paso de fotolitografía que incluye ejemplos de todos los procedimientos necesarios para la fabricación de válvulas en el chip y canales de flujo con múltiples alturas. Este protocolo de fabricación se presenta en el contexto de un sintetizador de microfluidos de talón de múltiples capas que requiere válvulas y variable-altura cuenta por su funcionalidad. Este dispositivo incluye uniones en T para la generación de gotitas de agua en una funda de aceite, resistencias en el chip para modular las tasas de flujo a través de controlar la resistencia a Poiseuille, un mezclador caótica para la homogeneización de los componentes de las gotitas, y ambas válvulas completamente sellado y de tamiz para permitir flujos de trabajo automatizados implican reactivo múltiple insumos. El uso de múltiples pasos de fotolitografía, estas características son cada fabricados en una capa diferente según la altura o resina fotosensible; las siguientes capas se construyen en este protocolo: (1) capa de la Ronda de flujo de la válvula (55 micras, AZ50 XT) (2) flujo de capa baja (55 micras, SU-8 2050) (3) Flujo de capa alta (85 m, SU- 8 2025, 30 m de altura aditivo), y (4) ranuras de espiga (125 micras, SU-8 2025, 40 m de altura aditivo) (Figura 3).

perlas de hidrogel se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo la funcionalización selectiva de superficie para los ensayos de aguas abajo, la encapsulación de fármacos, radiotracing de imágenes y ensayos, y la incorporación de células; hemos utilizado anteriormente una versión más compleja de estos dispositivos para producir perlas de hidrogel de PEG espectralmente codificados que contienen lantánidos nanophosphors ^20. Los diseños aquí descritos están incluidos en recursos adicionales para cualquier laboratorio para utilizar en sus esfuerzos de investigación si se desea. Anticipamos que este protocolo proporcionará un recurso abierto para los especialistas y no especialistas interesados ​​en la fabricación de dispositivos de microfluidos de capas múltiples con válvulas o geometrías complejas para bajar la barrera de entrada en la microfluídica y aumentar las posibilidades de éxito de la fabricación.

Diseño del dispositivo 1. Multi-capa

NOTA: Las características de diferentes alturas y / o resinas fotosensibles deben añadirse secuencialmente a la oblea durante las diferentes etapas de fabricación para crear funciones compuestas finales. Por lo tanto, los diseños para cada altura y separada fotoprotector que se incluirán en una oblea debe ser impresa en su propia máscara (Figura 4).

1. Descarga un diseño (CAD) Programa de redacción asistida por ordenador (por ejemplo, AutoCAD versión educativa).
2. Definir la "zona de oblea dibujando un 4" 4 círculo. Diseños de obleas (Figura 4, Recursos adicionales) se proporcionan como un ejemplo.
3. Dentro del "esquema 4 oblea, dispositivo de lugar limita el uso de 300 micras rectángulos de polilínea. Utilice estas fronteras de dispositivos para la alineación durante la fotolitografía.
4. Crear diferentes capas para cada altura diferente o resina fotosensible necesaria para el diseño final (es decir, el flujo redonda, bajo flujo, flujo alto,y el control en el diseño) con el panel Capas.
   1. Las características de diseño de una determinada altura deseada en la capa correspondiente. El diseño de ejemplo muestra 4 capas activas diferentes, cada uno con su propio color (Figura 4).
      NOTA: las fronteras de dispositivo, texto mundial, y el perfil de la placa se deben hacer en su propia capa (es decir, 1-negativo en los diseños), que, más tarde, aparecerán en todas las capas de alineamiento global. Características de diferente fotoprotector (tales como válvulas totalmente herméticos, que deben ser fabricados con resisten positivo) debe aparecer en diferentes capas, independientemente de la altura.
5. Uso de polilíneas cerradas de ancho cero, las funciones del dispositivo de diseño dentro de las fronteras del dispositivo.
   1. Considere los parámetros de diseño de la Tabla 1 para aumentar las posibilidades de éxito de fabricación.
   2. Para cada altura, seleccionar esa capa en el panel Capas y añadir todas las características de esa altura.
6. Listodiseños para la impresión de transparencias utilizando el archivo de máscara de base (Recursos adicionales), donde "se inserta dentro de un círculo de obleas 5" cada 4 borde rectangular. Cada capa se imprime en una película de transparencia separada para la adición secuencial de cada capa de resina fotosensible.
   NOTA: Este archivo de máscara de base representa los diseños finales utilizados para la impresión.
   1. Para completar el diseño, convertir todas las capas apagadas, excepto 1-negativo y la capa válvula AZ50 XT. Copiar toda la oblea con la capa activa (es decir, válvulas) y las características globales (es decir., Bordes de dispositivos).
   2. Abra el archivo de máscara de base y pega este diseño en el rectángulo titulado válvulas AZ50 XT. Use el borde exterior de la oblea para la alineación y posteriormente eliminarlo después de pegar.
   3. Repita para el resto de las capas (por ejemplo, en el ejemplo de diseño: el flujo bajo y cuadrado, cuadrado de flujo alto, y el control). Ejemplo de los archivos de transparencia (se proporcionan recursos adicionales).
   4. Enviar archivos a un comempresa comercial de impresión (por ejemplo, FineLine Imaging) para imprimir en una transparencia. Utilice 32.000 DPI para la impresión> 10 micras características y hasta 50.000 DPI para las características más pequeñas. Si se necesitan funciones de menos de 7 micras, pedir una máscara de cromo en lugar de una película de transparencia.

Tabla 1: Parámetros y sugerencias de diseño. Las consideraciones de diseño para evitar los errores comunes durante el proceso de diseño CAD de dispositivos de microfluidos. Haga clic aquí para ver esta tabla. (Haga clic aquí para descargar.)

2. Preparación de una oblea por fotolitografía

NOTA: Estos pasos, además, aparecen en formato de tabla en la Tabla 2.

1. En la sala blanca o área designada limpia, limpia y la deshidratación de la 4 "oblea de silicio de grado de prueba (de un solo lado polished).
   1. Enjuague la oblea bien con metanol.
      NOTA: Los pasos de limpieza No se necesitan más si se utiliza la capa de adhesión SU-8 se describe a continuación. Otras capas de adhesión que se desvían de este protocolo (por ejemplo., HMDS) a menudo requieren una limpieza más profunda, como el grabado de la piraña.
   2. Secar con _N2 o aire comprimido.
   3. Hornear en una placa caliente de aluminio a 95 ° C durante 10 min para evaporar completamente el disolvente.
2. Fabricar un 5 m de espesor de capa uniforme de SU-8 de 2005 para mejorar la adherencia de las capas de resina fotosensible posteriores.
   1. Colocar la oblea limpiada en una recubridora de rotación, encienda el vacío para pegarla en el mandril de giro, y soplar el polvo con _N2 o aire comprimido.
   2. Aplicar 1-2 ml de SU-8 2005 fotoprotector negativo en el centro de la oblea y el giro de la siguiente manera: difusión: 500 rpm, 10 segundos, 133 rpm / s aceleración; fundido: 3.000 rpm, 40 seg, / s de aceleración 266 rpm.
   3. Retire la obleay hornear suave cambiando la oblea entre dos placas de cocción regulado a 65 ° C y 95 ° C de acuerdo con el siguiente programa: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 3 min, 65 ° C: 2 min.
   4. Permitir que la oblea se enfríe a temperatura ambiente.
   5. Colocar la oblea en el mandril de una máscara alineador UV y exponer sin máscara ( 'exposición a inundaciones') para una deposición de energía total de 124 mJ (en este caso, 20 segundos a ~ 6,2 mW intensidad de la lámpara / ^cm2). Si está disponible, seleccione el modo de contacto duro para lograr una oblea de 300 micras: Máscara de separación.
   6. Eliminar oblea y hornear posterior a la exposición al cambiar la oblea entre dos placas de cocción fijados a 65 ° C y 95 ° C de la siguiente manera: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 4 min, 65 ° C: 2 min.

La fabricación de válvulas redondeadas

3. Para usar en línea AZ50 XT predictor de recursos válvula ²⁶ para planificar las velocidades de centrifugado para las dimensiones y alturas de las válvulas deseados.
   NOTA: Los siguientes pasos Deposentar una capa de 55 micras de resina fotosensible positiva para la definición de la válvula y el redondeo de reflujo.
4. Colocar la oblea en una recubridora de rotación, encienda vacío para pegarla en el mandril de giro, y soplar el polvo con _N2 o aire comprimido.
5. Aplicar 2-3 ml de resina fotosensible AZ50 XT positiva al centro de la oblea. Giro de la siguiente manera: difusión: 200 rpm, 10 s, 133 rpm / s de aceleración; reparto: 1200 rpm, 40 seg, 266 rpm / s de aceleración; Snap de centrifugado para eliminar bordes gruesos: 3.400 rpm, 1 seg, 3.400 rpm / s aceleración.
6. En un "plato de Petri 5, establecen la oblea con cuidado y dejar descansar durante 20 minutos.
7. hornear la oblea suave sobre una placa caliente: 65 ° C - 112 ° C, 22 min, 450 ° C / h de velocidad de rampa.
8. Retire la oblea y dejar reposar durante la noche a temperatura ambiente en una placa de Petri para la rehidratación ambiente.
9. Cinta Ronda de flujo máscara de transparencia a "cara de impresión hacia abajo la placa de cristal 5 (la más cercana a la oblea) y cargar en la máscara posicionador del alineador de máscara UV. Exponer la oblea de 930 mJ de UV en 6 ciclos ( por ejemplo, 6 ciclos de 25 segundos a intensidad de la lámpara ~ 6,2 mW / cm ^2, 30 s el tiempo de espera entre la exposición).
10. Desarrollar oblea inmediatamente por inmersión en un baño de agitación de 25 ml de AZ500k 1: 3 desarrollador en el plato de 6 "de vidrio durante 3-5 minutos o hasta que el baño se vuelve púrpura y características emergen.
    1. Retire la oblea y enjuagar bien con agua DI.
    2. Evaluar la altura pre-reflujo usando un perfilómetro (fuerza de la aguja de 10,5 mg).
       NOTA: Utilice el perfilómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante, colocando cuidadosamente el lápiz fuerza al lado de un canal de función en la capa deseada antes de perfiles. Ajustes utilizados en este protocolo fueron los siguientes: fuerza de la aguja 10,5 mg, 1,000 m de longitud, velocidad de 200 micras / s, régimen de abajo-arriba.
11. Refluir dura hornear la oblea para fundir y características de válvula redondeadas de la siguiente manera: 65 ° C - 190 ° C, 15 h, 10 ° C / h de velocidad de rampa.
12. Deje enfriar la oblea para RT. Evaluar la altura posterior a reflujo usando un perfilometer (fuerza de la aguja de 10,5 mg). Alturas de 55 micras ± 2 micras se debe esperar para esta geometría del dispositivo.

3. Fabricación Características altura variable en tándem

1. Proceder a la fabricación de altura variable con la oblea desarrollado con bajo flujo, flujo y espiga mezclador transparencias del diseño del grano del sintetizador.
2. Para ajustar el protocolo de los diseños, utilizar hojas de datos de fabricación ²⁵ para determinar la energía de exposición, velocidades de centrifugado y los parámetros de tiempo de horneado, lo que permite la tolerancia de ± 5%.
   NOTA: Este protocolo fabrica una 55 m de altura bajo flujo de la capa usando SU-8 2050 fotoprotector negativo hilada sobre las características de las válvulas.
3. Colocar la oblea limpiada en recubridora de rotación, encienda el vacío para pegarla en el mandril de giro, y soplar el polvo con _N2 o aire comprimido.
   1. Aplicar 1-2 ml de SU-8 2050 fotoprotector negativo al centro de la oblea y el giro de la siguiente manera: difusión: 500 rpm, 10 seg, 133 rpm / seg aceleración; fundido: 3.000 rpm, 40 seg, 266 rpm / seg aceleración. fotorresistente de la vuelta sobre las características de la válvula desarrollados.
4. Con cuidado, coloque la oblea hecho girar en "plato de Petri 5 y dejar descansar durante 20 minutos sobre una superficie plana o hasta que se desvanecen los patrones de rayas.
5. Retire la oblea y hornear suave mediante la colocación en dos placas de cocción fijados a 65 ° C y 95 ° C de la siguiente manera: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 8 min, 65 ° C: 2 min.
6. Dejar que la oblea se enfríe a temperatura ambiente.
7. Cinta de la máscara de caudal bajo de transparencia a un lado de impresión hacia la placa de cristal de cuarzo 5 "hacia abajo (la más cercana a la oblea) y cargar en el posicionador de la máscara de la máscara UV alineador.
8. Colocar la oblea en la máscara UV mandril alineador y, usando ocular del microscopio o de la cámara, alinee con cuidado nuevas características capa de baja el flujo para la Ronda características de la capa de la válvula. Comience por la alineación de ejes horizontales, verticales y de inclinación de las fronteras de dispositivos para las características fronterizas dispositivo en la máscara. A continuación, alinee características retícula se apuestaween capas. Por último, confirman que las características de las válvulas se cruzan características de flujo bajo en su caso.
9. Exponerlo a 170 mJ deposición UV (28 seg a ~ 6,2 mW / ^cm2).
10. Eliminar la oblea y post-exposición hornear por conmutación entre dos placas de cocción fijados a 65 ° C y 95 ° C de la siguiente manera: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 9 min, 65 ° C: 2 min.
11. Sin desarrollar, permite la oblea se enfríe a temperatura ambiente y se proceda a la fabricación de capa alta de flujo. Esta capa alta de flujo añadirá 30 micras de resina fotosensible a la capa de resina fotosensible 55 micras sin desarrollar para producir 85 micras características en lugares no expuestos previamente.
12. Repita los pasos 3.3 a 3.10 usando SU-8 2025 y la máscara de capa alta de flujo con estas modificaciones de la configuración de la capa de centrifugado: Extensión: 500 rpm, 10 segundos, 133 rpm / s de aceleración; fundido: 3.500 rpm, 40 seg, 266 rpm / seg aceleración.
    1. Exponerlo a 198 mJ deposición UV (32 s a ~ 6,2 mW / ^cm2).
13. sin desaping, permita que la oblea se enfríe a temperatura ambiente y se proceda a la fabricación de la capa caótico mezclador de espiga. Características finales de esta capa tendrá una altura total de 125 micras: 55 micras de la capa de flujo bajo, 30 micras de la capa de la plaza de flujo, y 40 micras de esta capa Chaotic Mixer espiga (véase la Figura 3) e incluyen 35 ranuras micras de espiga .
14. Repita los pasos 3.3 a 3.10 usando SU-8 2025 y la máscara de capa en espiga con las siguientes modificaciones, asegurando que las ranuras de espiga estén completamente dentro de alto caudal de canal se describen.
    1. Utiliza el siguiente programa de horneado suave: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 7 min, 65 ° C: 2 min.
    2. Exponerlo a 148 mJ deposición UV (24 s a ~ 6,2 mW / ^cm2).
15. Después de haber completado todas las capas, desarrollar mediante la inmersión de la lámina en un baño de agitación de 25 ml de SU-8 desarrollador en una placa de 6 "de vidrio durante 3,5 minutos o hasta que emergen claramente características. Compruebe que featurES tienen límites de las entidades claras, definidas utilizando un estereoscopio.
16. Duro hornear la oblea para estabilizar todas las características de una capa fotorresistente en una placa caliente de la siguiente manera: 65 ° C - 165 ° C, 2 h 30 min, 120 ° C / h de velocidad de rampa.
17. Evaluar la altura característica en todas las capas usando un perfilómetro (fuerza de la aguja de 10,5 mg).

Fabricación 4. Control de la oblea

1. Limpio, deshidratar, y fabricar una capa de adhesión 5 micras en una nueva oblea de 4 "de silicio como en la Sección 4.
2. Fabricar una capa de 25 micras de control usando SU-8 2025 fotoprotector negativo.
3. Colocar la oblea en una recubridora de rotación, encienda vacío para pegarla en el mandril de giro, y soplar el polvo con _N2 o aire comprimido.
4. Aplicar 1-2 ml de SU-8 2025 fotorresistente negativo en el centro de la oblea y el giro de la siguiente manera: propagación: 500 rpm, 10 seg, 133 rpm / s de aceleración; fundido: 3.500 rpm, 40 seg, 266 rpm / seg aceleración.
5. Retire la oblea y hornear suave cambiando entredos placas de cocción fijado en 65 ° C y 95 ° C de la siguiente manera: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 5 min, 65 ° C: 2 min.
6. Dejar que la oblea se enfríe a temperatura ambiente.
7. Alinear la máscara de control de la transparencia a una placa de vidrio de 5 "y cargar en alineador de máscara UV.
8. Colocar la oblea en el mandril de la máscara UV alineador y exponer a 155 mJ deposición UV (25 segundos a intensidad de la lámpara ~ 6,2 mW / ^cm2).
9. Eliminar la oblea y post-exposición hornear por conmutación entre dos placas de cocción fijados a 65 ° C y 95 ° C de la siguiente manera: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 6 min, 65 ° C: 2 min.
10. Desarrollar mediante la inmersión de la lámina en un baño de agitación de 25 ml de SU-8 Developer en 6 "plato de vidrio durante 1 minuto o hasta que emergen características. Compruebe las funciones usando un estereoscopio.
11. Duro hornear la oblea para estabilizar características fotorresistentes de la siguiente manera: 65 ° C - 165 ° C, 2 h 30 min, 120 ° C / h de velocidad de rampa.

5. El tratamiento de la oblea por Silano Fácil PDMS Lift-Off

1. Coloque las obleas terminados en estante oblea dentro de un desecador de vacío campana de cristal dentro de una campana de humos libre de agua o solubles en agua reactivos.
2. Bajo el capó, use un gotero para aplicar 1 gota de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H -perfluorooctyl) silano (PFOTS) a un portaobjetos de vidrio y el lugar en el interior del desecador.
3. Cierre la tapa del desecador y aplicar vacío durante 1 min.
4. Después de 1 minuto, apagar el vacío sin volver a presurizar o evacuar campana de vidrio.
5. Deja reposar la mezcla durante 10 minutos mientras que la superficie en forma de aerosol PFOTS capas de la oblea.
6. Abra la tapa del frasco de campana y retire obleas utilizando pinzas. Colocar en una placa de Petri para el moldeo réplica de PDMS. Disponer de silano revestido con diapositivas en residuos peligrosos.
   NOTA: Las obleas recubiertas con silanos fluorados se pueden utilizar cientos a miles de veces sin repetir el tratamiento. Una capa de sacrificio de 1:10 PDMS se puede lanzar sobre obleas, curado, y se desecha después del primer tratamiento con silano para eliminar el correogrupos silano xcess de superficie de la oblea.

6. PDMS Réplica Moldeo

1. Fabricar dispositivos de microfluidos de capas múltiples en una geometría "empuje hacia arriba" en el vidrio de acuerdo a los protocolos de acceso abierto existentes ^16.
   NOTA: Un protocolo detallado, además, se puede encontrar en el sitio web ^27.
2. Por inspección visual, asegúrese de que todas las válvulas están correctamente alineados para controlar las líneas y todas las entradas (en ambas capas de flujo y control) se perforan completamente antes de continuar.

7. La producción de los granos de hidrogel de Gotitas

1. Conectar los tubos (por ejemplo, Tygon) cargado de agua para un sistema de control de flujo (por ejemplo, bombas de jeringa, controladores fluídicos, o una matriz válvula de solenoide de código abierto con depósitos ^28).
2. Conectar los pines de metal a una tubería y conectarse a los puertos del dispositivo de control en las entradas de línea. Presurizar las líneas de control de dispositivo mediante el ajuste del flujo contROL sistema de elección a 25 psi para cada línea. Asegúrese de que las válvulas de cierre y vuelva a abrir mediante inspección bajo el microscopio.
   NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para el sistema de control de flujo de elección. En este trabajo, un sistema neumático controlado por el software a la medida de presión se aplica a cada línea utilizando válvulas de solenoide que cambian entre 25 psi de aire comprimido (presión) y la presión atmosférica (sin presión). Los detalles sobre este sistema se pueden encontrar en Discusión.
3. Preparar los recipientes a presión de encargo de microfluidos para reactivo y carga de aceite.
   1. El uso de un alfiler, perfore dos agujeros en la parte superior de un tubo vial criogénico, inserte tubo de PEEK capilar en un agujero, e insertar un perno de metal conectada a la tubería en el segundo hoyo.
   2. Sellar la tubería en su lugar con epoxi. Deje secar durante 1 hora.
4. Mientras espera, en un tubo de microcentrífuga, suspender 3,9 mg de fotoiniciador LAP en 100 l de agua DI ([LAP] = 39 mg / ml) para preparar fotoiniciadorsolución utilizada para la polimerización de las gotitas a rebordea el hidrogel. Proteger de la luz.
5. En un segundo tubo de microcentrífuga, añadir 132 l de agua DI, 172 l de PEG diacrilato, 12 LAP solución de l, y 85 l de tampón HEPES para obtener una solución de hidrogel de gotas.
6. Transferir la solución de hidrogel de gota al recipiente de tubo criogénico completado.
   NOTA: Aditivos para otras aplicaciones tales como nanocristales, partículas magnéticas o moléculas biológicas se pueden incluir dentro del componente de HEPES.
7. Conectar el tubo del recipiente de tubo criogénico a una fuente de presión controlable y conectar el tubo de PEEK a la entrada de reactivo del dispositivo.
8. Preparar 10 ml de aceite mineral ligero con 2% v / v tensioactivo no iónico (por ejemplo, Span 80) y 0,05% EM90 para emulsión de gotitas de aceite. Filtrar el uso de un filtro de jeringa de 0,22 micras y la carga 1 ml en un segundo recipiente de tubo criogénico.
9. Inserte tubo de PEEK en la salida del dispositivo para la recogida de las gotas.
10. Retire bubbl airees desde el dispositivo de presurización de aceite, agua o entradas de la mezcla de PEG (4 psi de presión de funcionamiento). Abra todas las válvulas. Secuencialmente desactivar cada válvula en una vía de fluido después de 1 minuto o hasta que las burbujas de aire han permeado a través del dispositivo de PDMS. Por ejemplo, para de-burbuja mezcladores de espina de pescado, activar las válvulas de admisión 1, Mezcla 1, y la mezcla de residuos. Entonces despresurizar la entrada 1, Mezcla 1, y la mezcla de residuos hasta que todas las burbujas se han ido.
11. Cuando el dispositivo está a presurizar después de quitar las burbujas, despresurizar la válvula de aceite Ro1 y ajustar la presión de aceite a 10 psi.
12. Establecer PEG presión de la mezcla a 9 psi, depresión que genera válvulas aguas arriba (entrada 1, gotas 1) y ajustar si es necesario para producir gotitas del tamaño deseado. El tamaño de gota se puede determinar a través de microscopía utilizando una cámara con 50 fps o más.
13. Cuando las gotas se han estabilizado, la posición de un punto a 5 mm de una fuente de luz UV (por ejemplo, un sistema de curado UV punto con guía de luz líquida (LLG) o un LED UV enfocada) sobre la región de la polimerización de la device y aplicar 100 mW / cm ² UV (365 nm) de la fuente de UV.
14. Presurizar la válvula tamiz de cuentas para ver perlas polimerizadas recogen y asegurar que las gotas se han endurecido en perlas. Ajuste LLG como sea necesario para lograr la polimerización completa.
15. Despresurizar válvula tamiz talón y recoger los granos en el tubo a través de tubo de PEEK de salida.

Aquí, demostramos la fabricación de válvulas, de altura variable de moldes de microfluidos de capas múltiples mediante la fabricación de dispositivos capaces de generar poli etilenglicol (PEG) perlas de hidrogel de gotitas (Figura 2). Una visión general del proceso de fabricación completa se incluye en la Figura 3. El uso de elementos de diseño de trabajos anteriores, el sintetizador de cuentas emplea a 4 alturas en su capa de flujo que incluye (1) redondeado válvulas XT AZ50 para la modulación de flujo laminar (55 micras) (2) flujo canales de baja para la introducción de los reactivos a una mayor resistencia (55 micras) (3) el flujo de los canales de alta para dirigir el flujo en una menor resistencia a las salidas y mezcladoras (85 mM), y (4) un mezclador de espiga advección (125 micras) para mezclar el PEG y agente de reticulación en una solución homogénea (Figuras 4A y 4B). Una tabla de parámetros de diseño y las restricciones de diseño sugeridos utilizado en la construcción de estede diseño se incluye en la Tabla 1. Los archivos de diseño y transferir archivos de máscara están incluidos en la Tabla de Materiales.

Este protocolo demuestra redondeo válvulas de flujo y la construcción de múltiples alturas en la misma oblea de flujo a través de pasos tándem fotolitográficas sin desarrollo entre cada paso (Tabla 2). Una válvula de post-reflujo típico perfil de redondeo de un perfilómetro e imágenes estereoscopio de nuestras válvulas post-reflujo se muestra en las figuras 5A y 5B. Alturas de fabricación de medición resultantes de nuestro fotolitografía multi-altura se enumeran en la Tabla 3. Heights se midieron en 10 lugares por cada capa en todos los dispositivos en una única oblea de flujo, evaluar tanto la variación de la oblea de dispositivo a dispositivo y a través. Todas las características observadas <2% CV a través de la oblea. hojas de datos del fabricante de fotoprotección sugieren altura típicavariaciones de ± 5% en la construcción de características de múltiples capas, por lo que esta tolerancia se deben tomar en cuenta si este protocolo se ajusta para un diseño diferente.

Como con cualquier proceso de fabricación, los errores pueden dar como resultado en cada etapa si los parámetros de fabricación tales como la velocidad de centrifugado o la exposición no están optimizados para la altura patrón deseado y la geometría. Hay muchos recursos disponibles para la solución de problemas de los tiempos de exposición y desarrollo adecuados, incluyendo un sitio web mantiene nuestra instalación ^27. Las desviaciones de los tiempos sugeridos blandos y duros de pasteles, temperaturas y velocidades de rampa pueden generar grietas, burbujas o características incompletas. Además, la rehidratación de la fotoprotección AZ50 XT positivo antes de la exposición es crítica. Obleas sin rehidratación adecuada pueden aparecer grietas o contener burbujas dentro del área de la válvula. Si esto ocurre, el uso de una "caja húmeda" (una caja cerrada con un recipiente lleno de agua desionizada) para albergar wafers para la rehidratación durante la noche pueden ayudar. tiempos de rehidratación más cortos (~ 5-6 hr) se pueden utilizar para las características XT AZ50 bajo 50 micras con resultados similares, pero las características más altas requieren rehidratación durante la noche para reducir la posibilidad de pérdida de función durante la exposición y el desarrollo. Más reciente positivo resisten alternativas (por ejemplo, AZ40XT) puede eliminar la necesidad de rehidratación durante la noche; Sin embargo, no hemos probado estas formulaciones.

Como prueba de concepto-, gotitas de hidrogel de PEG-diacrilato se produjeron a partir del dispositivo de talón sintetizador (Figura 6A). Figuras 5C y 5D muestran imágenes representativas de funcionamiento de la válvula y el cierre en el dispositivo cuando la presurización y despresurización de válvulas. modos de error comunes para la presurización de la válvula incluyen: el uso de una presión insuficiente (válvulas no cierra completamente, que pueden ser controlados por los que fluye el colorante alimenticio), inserción de tubos de entrada (flujo se inhibirá situbos de metal o pasadores se empujan hacia abajo demasiado lejos y delaminación del dispositivo puede generar), y la incorporación de polvo o fibras durante el proceso de fabricación (canales pueden estar ocluidos o el dispositivo pueden deslaminarse). Para solucionar estos modos de error, los usuarios deben mantener condiciones de sala limpia durante la fabricación y prueba de manera sistemática cada válvula antes de proceder a una carrera dispositivo. Si delaminación dispositivo presenta como un problema común en los experimentos, esto se puede remediar por cualquiera de los dispositivos que funcionan a presiones más bajas (<15 psi) o reduciendo los tiempos de silanización.

La figura 6A muestra el dispositivo sintetizador de talón en funcionamiento la producción de gotitas de hidrogel en una emulsión de aceite en el generador de gotas T de unión y la Figura 6B muestra perlas atrapados por la válvula de tamiz en el chip. Si la polimerización no tiene éxito, los granos se pasan a través de una válvula de tamiz. Si esto ocurre, intensidad de la fuente UV y la altura desde el dispositivo se pueden MOD ified para mejorar la polimerización. Perlas de hidrogel fueron producidos a velocidades de flujo de 10 psi (aceite) y 9 psi (mezcla de reactivos) utilizando ~ 100 mW / cm ² de energía sobre un área de polimerización 5 mm de diámetro (Figuras 6C y 6D). perlas resultantes miden 52,6 ± 1,6 mm (media ± std). Tamaños fueron analizados para 2.992 perlas usando una transformada de Hough (MATLAB) en imágenes de campo claro (Figuras 6C y 6D) con un filtro de tamaño de impuesto de ± 3 std (28 valores atípicos, 0,94% de perlas). Nuestra configuración entera hardware para la producción de gotas se muestra en la Figura 7.

Tabla 2: Parámetros de varios pasos fotolitografía. Un formato de tabla de todos los pasos de la fotolitografía con los parámetros aplicables, incluyendo la velocidad de centrifugado, tiempos de cocción suaves, las energías de exposición y tiempos de cocción duros. 2.xlsx "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver esta tabla. (Haga clic aquí para descargar.)

Tabla 3: Perfilómetro Heights posterior a la fabricación. Altura total característica posterior a la fabricación de cada una de las capas fabricadas a través de múltiples pasos fotolitografía.

Figura 2: Visión general de los procesos de fabricación. Un esquema que indica los pasos que intervienen en la fabricación de dispositivos de múltiples capas desde el diseño hasta las pruebas del dispositivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Representación esquemática de multi-paso de fotolitografía. Descripción general de redondeo de la válvula y variable de fabricación función de altura en la fotolitografía para la creación de un dispositivo para microfluidos de capas múltiples. Aquí se incluyen los pasos para la fabricación del dispositivo de talón sintetizador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Sintetizador del grano de dispositivos Diseño e imágenes. Diseño (A) CAD del dispositivo del grano Sintetizador con capas indicadas por diferentes colores. (B) La imagen del dispositivo de PDMS de múltiples capas del grano del sintetizador. Las líneas de control aparecen en naranja, canales de flujo aparecen en azul y verde.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Perfiles de válvulas e imágenes. (A) de la válvula perfil representativo altura según la evaluación de un perfilómetro. (B) Imágenes representativas de las válvulas y los canales circundantes en el moldeo de la oblea de silicio flujo principal. (C, D) Imágenes de operación de válvula de escape en el dispositivo de múltiples capas PDMS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Producción de gotitas de hidrogel de PEG-diacrilato. (A) Imagen de hidrogel prod gotitaucción en el generador de gotas cruce. (B) Imagen de los granos después de la polimerización atrapado en la válvula de tamiz cuando se presuriza la válvula. Imagen (C) Brightfield de perlas de hidrogel producidos en el sintetizador de talón (4X). (D) La distribución del tamaño de las perlas de hidrogel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Operación de configuración de dispositivos. Imagen con la anotación de todo el hardware necesario para el funcionamiento del dispositivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este trabajo demuestra un protocolo de fotolitografía completa de múltiples pasos para un dispositivo de microfluidos de capas múltiples con válvulas y la geometría de altura variable que puede ser ajustado para cualquier aplicación con simples modificaciones a los parámetros de fabricación en base a nuestra herramienta en línea ²⁶ y ²⁵ del fabricante instrucciones. Este protocolo está destinado a desmitificar la fotolitografía de múltiples capas para los investigadores que deseen construir dispositivos de microfluidos más allá de los moldes de una sola capa simple, pasiva.

Dispositivos de microfluidos de capas múltiples permiten la búsqueda de la funcionalidad avanzada dentro de un solo dispositivo de polímero blando para "laboratorio en un chip 'aplicaciones que van desde el análisis de una sola célula de ensayos bioquímicos de alto rendimiento ^1. El dispositivo de talón sintetizador construido aquí demuestra múltiples alturas con una sola capa de flujo y ambas geometrías completamente herméticos y de la válvula de tamiz para producir gotitas de hidrogel que Cun polimerizar a perlas de polímero. La presencia de las válvulas permite un control automatizado, programable sobre la función de chip que puede ser implementado fácilmente con cualquier lenguaje de programación (es decir, MATLAB, LabVIEW, o Python) que se interconecta con los módulos de un laboratorio control de flujo (es decir, las bombas de jeringa y / o reguladores de presión ). En esta demostración, el software MATLAB personalizado (código proporcionado en la referencia ²⁸⁾ se comunica con Modbus-controlados conjuntos de válvulas de solenoide en una configuración personalizada neumática ²⁸ y un sistema de control de flujo MFCS para presurizar fluidos en el dispositivo, pero muchas otras opciones para el control de flujo son comercialmente disponible. Los diseños y las sugerencias adicionales se incluyen para ayudar a maximizar el éxito de los ingenieros de microfluidos por primera vez.

Las etapas de fabricación que se muestran aquí deben demostrar en general adaptable a una amplia gama de patrones fotolitográfico para dispositivos microfluídicos. En uno de los pasos (flujo alto), 30características micras se han añadido a la capa de resina fotosensible inferior (Low Flow, 55 micras) para crear una altura compuesta de 85 micras. Este paso se puede utilizar para hacer que las características de grosor sin necesidad de resinas fotosensibles más viscosas (que son más difíciles de trabajar). En otro paso (espiga), las características se han fabricado en la parte superior de un canal previamente reticulado, creando ranuras estampadas en la parte inferior de un microcanal cuando réplica moldeada en PDMS. Este paso se puede adaptar por los usuarios para crear geometrías complejas, incluyendo arquitecturas bien dentro de pocillos, si se desea.

El éxito de este proceso de fabricación se demuestra por el uso del dispositivo de talón sintetizador para producir perlas de polímero de las gotitas de PEG-diacrilato. Exploración de diferentes presiones de flujo puede modular el régimen de gotas para producir gotas de diferentes tamaños. Además, los aditivos se pueden incluir fácilmente dentro de la mezcla de polímeros. Estas perlas de hidrogel se pueden utilizar para una variedad de propósitos, incluyendocodificación espectral a través de la incorporación de fósforos fluorescentes o luminiscentes, administración de fármacos, o ensayos celulares a través de funcionalización de la superficie.

Si este protocolo se adopta para construir un dispositivo de microfluidos diferente que el sintetizador de grano que se presenta aquí, hay que señalar ciertos pasos son críticos para lograr una alta probabilidad de éxito en el primer intento de fabricación. Nosotros y otros han observado que la optimización de la temperatura de horneado suave, duración y velocidad de rampa es crítica para evitar la retención de disolvente residual en la película de resistir a través de la formación de la corteza (que puede conducir a burbujeo de gas nitrógeno atrapado durante la exposición) ^29. Además, una etapa de rehidratación durante la noche mejora la reproducibilidad de los tiempos de exposición necesarios para capas gruesas AZ50 XT y reduce la variabilidad espacial en las tasas de desarrollo a través de la oblea. Por último, una larga (14-15 h) publicar hornear la exposición con una rampa lenta redondea características fotorresistentes rectangulares para formar VALves sin deformar geometrías de válvula para una amplia variedad de espesores fotorresistentes probadas.

Varios de los procedimientos que aquí se presentan para la fabricación de capas de resina fotosensible negativa incluyen pequeñas diferencias con respecto a las instrucciones del fabricante. Sugerimos un proceso de horneado suave de tres pasos que se mueve barquillos en los platos calientes regulado a 65 ° C, 95 ° C y 65 ° C. Hemos encontrado que el calentamiento gradual de las obleas reduce la aparición de defectos durante la exposición resultante de la ruptura de las burbujas de gas atrapadas dentro de fotorresistente a través de la formación de una "corteza" durante el horneado suave. A la inversa, el enfriamiento gradual de las obleas después de la cocción suave puede reducir el agrietamiento fotorresistente. Finalmente, hemos encontrado que el aumento de los tiempos de relajación para fotorresistente ~ 20 min reduce pequeñas variaciones en resistir altura a través de la oblea.

Debido a la flexibilidad de este protocolo de fabricación, esperamos que tendrá una amplia utilidad para los diferentes dispositivos a través de disciplinES. Mientras que las alternativas tales como la impresión 3D, vidrio grabado y repujado también pueden lograr la fabricación de microfluidos, patrón litográfica puede lograr una funcionalidad más compleja, tales como válvulas, que otros métodos no han alcanzado aún a escala. La principal limitación de este protocolo es el momento del diseño a la prueba, que toma ~ 3 días (debido principalmente a los pasos requeridos para fabricar válvulas redondeadas).

Esperamos que la difusión abierta de protocolos en la microfluídica, especialmente en lo relativo a los pasos complicados de fotolitografía, fomentarán la innovación en el campo y que esta demostración de prueba de concepto ayudará en ayudar a los usuarios a resolver problemas de fabricación.

The authors declare that they have no competing financial interests.

The authors thank Scott Longwell for helpful comments and edits to the manuscript and Robert Puccinelli for device photography. The authors acknowledge generous support from a Beckman Institute Technology Development Grant. K.B. is supported by a NSF GFRP fellowship and the TLI component of the Stanford Clinical and Translational Science Award to Spectrum (NIH TL1 TR 001084); P.F. acknowledges a McCormick and Gabilan Faculty Fellowship.