Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

Se presenta la síntesis de un hidrogel de proteína dividida intein mediada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. La mezcla de los dos copolímeros de proteínas desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido que se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es altamente pH y temperatura estable, compatible con disolventes orgánicos, y fácilmente incorpora proteínas globulares funcionales.

Se presenta la síntesis de un hidrogel altamente estable de proteínas mediada por una reacción de trans-empalme proteína dividida inteína catalizada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. Una bobina al azar altamente hidrófilo se inserta en uno de los copolímeros de bloque para la retención de agua. La mezcla de los dos copolímeros de bloques de proteína desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido con agentes de reticulación en cada extremo que rápidamente se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es muy estable bajo condiciones ácidas y básicas, a temperaturas de hasta 50 ° C, y en disolventes orgánicos. El hidrogel rápidamente las reformas después de la ruptura inducida por cizalla. La incorporación de una "estación de acoplamiento peptídico" en el bloque de construcción de hidrogel permite la incorporación conveniente de "proteína de acoplamiento"-etiquetados proteínas diana.El hidrogel es compatible con el medio de crecimiento de cultivo de tejidos, apoya la difusión de moléculas de 20 kDa, y permite la inmovilización de proteínas globulares bioactivos. La aplicación del hidrogel de proteína mediada por inteína-como un biocatalizador compatible con disolventes orgánicos se demostró mediante la encapsulación de la enzima peroxidasa de rábano picante y corroborar su actividad.

Los hidrogeles hechos enteramente de las proteínas tienen el potencial para avanzar significativamente campos tan diversos como la ingeniería de tejidos, la administración de fármacos y biofabricación ^1. Ofrecen ventajas sobre hidrogeles poliméricos sintéticos tradicionales, incluyendo la biocompatibilidad y el potencial para apoyar de forma no invasiva la incorporación de proteínas globulares bioactivos.

En este trabajo se describe el desarrollo de una novela de hidrogel de proteína formada por una reacción de trans-empalme proteína dividida intein mediada y su aplicación como un andamio inmovilización de proteínas (Figura 1). Los bloques de construcción para este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína que comprenden cada uno el fragmento N-o C-terminal de una fracción de intein (EN e IC) y una subunidad de una proteína multimérica reticulante. La inteína DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) se utilizó como la división inteína ^2,3 y una pequeña proteína trimérica (12 kDa) CUTA de Pyrococcus horikoshii </ Em> se utilizó como ^4,5 proteína reticulante. Diferentes agentes de reticulación se unen a través de reacción de trans-empalme inteína catalizada, lo que lleva a la formación de una red de proteínas altamente reticulado (hidrogel). Inteína Npu fue elegido debido a su cinética de reacción rápida (t _1/2 = 63 seg) y alto rendimiento trans-empalme (cerca del 80%) ^2,3. La proteína CUTA fue elegido como el agente de reticulación debido a su alta estabilidad. Trímeros CUTA tienen una temperatura de desnaturalización de cerca de 150 ° C y conservan la estructura cuaternaria trimérica en soluciones que contienen tanto como 5 M hidrocloruro de guanidina ^4,6. Desde intercambio de subunidades entre diferentes agentes de reticulación es un contribuyente importante de la erosión de la superficie de hidrogel física ^7, la fuerte interacción entre la subunidad de Cuta debería desalentar este tipo de intercambios de subunidades, lo que lleva a un hidrogel más estable. Uno de estos bloques de construcción también contiene un péptido S-fragmento altamente hidrofílico como la mitad de la cuadra para facilitar aguaretención ^8.

La mezcla de los dos bloques de construcción de hidrogel inicia una reacción de trans-empalme entre el EN y IC inteína fragmentos, la generación de una cadena de polipéptido más largo con agentes de reticulación en ambos terminales. Los reticulantes de múltiples tales unidades moleculares interactúan entre sí, formando una red de hidrogel altamente reticulado (Figura 1A). Una "estación de acoplamiento de péptidos" específica (DSP) se incorpora en uno de los bloques de construcción de hidrogel para facilitar la inmovilización estable de una "proteína de acoplamiento" (DP)-etiquetados proteína diana en el hidrogel. El uso de una fracción de inteína para mediar el ensamblaje de hidrogel no sólo proporciona una flexibilidad adicional para la síntesis de hidrogel de proteína, sino que también permite alta densidad, una carga uniforme de la proteína diana a través de todo el hidrogel, como las proteínas diana se cargan antes de la formación de hidrogel.

La proteína de hidrogel intein mediada es altamente Stables en solución acuosa con poca o ninguna erosión detectable después de 3 meses a temperatura ambiente. Estabilidad es retenido en una amplia gama de pH (6-10) y temperaturas (4-50 ° C), y el hidrogel también es compatible con disolventes orgánicos. Este hidrogel se usa para la inmovilización de dos proteínas globulares: la proteína fluorescente verde (GFP) y la peroxidasa de rábano picante (HRP). Hidrogel atrapando la última proteína se utiliza para realizar la biocatálisis en un disolvente orgánico.

1. Construcción de plásmidos

NOTA: Todos los genes fueron amplificados bajo reacciones de PCR utilizando Phusion de alta fidelidad de ADN polimerasa según las especificaciones del fabricante. Los cebadores usados ​​para la clonación se han descrito anteriormente ^9. Todos los constructos se enumeran en la Tabla 1.

1. Para generar Cuta-NpuN (N, Tabla 1):
   1. Amplificar por PCR los genes Cuta y NpuN de plásmidos pET30-cuta-Tip1 ¹⁰ y kanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, respectivamente, utilizando los cebadores apropiados.
   2. Digerir estos fragmentos con las enzimas de restricción apropiadas y secuencialmente insertar estos fragmentos en el vector pET26b entre el promotor T7 y una etiqueta 6xHistidine C-terminal para generar N (Figura 2A).
2. Para generar NPUC-S-cuta (C, Tabla 1):
   1. PCR amplificar NPUC, Cuta y S fragmentaciónt [AG ₃ (PEG)] ₁₀ del plásmido kanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, pET30-cuta-Tip1 ¹⁰ y pQE9 AC ₁₀ ATRP ^12, respectivamente, utilizando los cebadores apropiados.
   2. Digerir estos fragmentos con las enzimas de restricción apropiadas y secuencialmente insertar estos fragmentos en el vector pET26b entre el promotor T7 y un 6xHistidine C-terminal para generar C (Figura 2B).
3. Para generar NPUC-S-SH3 _{lig-cuta (lig} C-SH3, Tabla 1):
   1. Amplificar por PCR utilizando cebadores Cuta contienen un _lig SH3 (PPPALPPKRRR) y un conector flexible (GGGGS) ₂ para generar un fragmento SH3 _lig-cuta.
   2. Vuelva a colocar el gen Cuta de C con el fragmento SH3 _lig-cuta.
4. Para generar SH3-GFP (Tabla 1):
   1. Amplificar el gen SH3 del plásmido pJD757 ¹³ utilizando elcebadores apropiados.
   2. Fusible este fragmento con el gen GFP y la inserta en el vector pET26b entre el promotor T7 (Figura 2 C) y una etiqueta 6xHistidine C-terminal.

2. Expresión de Proteínas

1. Transformar 50 l de químicamente competente de Escherichia coli BL21 (DE3) con el plásmido de expresión apropiado.
2. Después de la transformación, en serie diluir estas células, y la placa de ellos en medio Luria-Bertani (LB) / placas de agar que contienen 50 mg / ml de kanamicina.
3. Incubar las placas que contienen células transformadas a 37 ° C durante ~ 15 horas.
4. Después de la incubación, recoger una placa que contiene 50 a 100 colonias y volver a suspender todas las colonias en 5 ml de caldo LB.
5. Suspensión de transferencia a 1 L de caldo LB que contenía kanamicina (50 mg / ml) y crecer las células a 37 ° C con agitación a 250 rpm. Supervisar la absorbancia a 600 nm (OD _600). Cultive hasta OD ₆₀₀ ~ 0,8.
   1. Para C y C-SH3 _LIG, inducir la expresión de la proteína mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) al cultivo (1 mM de concentración final) y se incuba el cultivo a 37 ° C durante 4 horas mientras se agitaba a 250 rpm.
   2. Para N y SH3-GFP, enfriar la cultura a ~ 18 ° C por inmersión del matraz de cultivo en un baño de agua con hielo durante ~ 5 min. Inducir la expresión de proteínas mediante la adición de IPTG al cultivo (concentración final 1 mM) y se incuba el cultivo a 18 ° C durante 14-18 horas con agitación a 250 rpm.
6. Después de la expresión de proteínas, centrifugar el cultivo a 6000 xg durante 20 min a 4 ° C para recoger el sedimento. Sedimento celular Almacenar a -80 ° C hasta su uso.

3. Protein Purification

1. Purificación de N (condiciones de desnaturalización)
   1. Resuspender los sedimentos celulares en tampón A (Tabla 2) en 10 ml / g de sedimento húmedo.
   2. Immerse la suspensión de pellets en un baño de hielo-agua y romper las células por sonicación (Amp 10, con 1 pulso segundos y 6 segundos de pausa durante 1 min).
   3. Centrifugar el lisado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
   4. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en Tampón de DA (que contiene 8 M de urea) y se centrifuga la suspensión a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
   5. Pasar el sobrenadante a través de un 5 ácido Ni-nitrilotriacético ml (NTA) columna previamente equilibrada con tampón DA.
   6. Lavar la columna con 30 ml de Tampón DA suplementado con imidazol 45 mM. Eluir la proteína purificada utilizando 20 ml de Tampón DA suplementado con imidazol 150 mM.
   7. Reducir la concentración de urea en la muestra de proteína a <1 mM ya sea por uno de los siguientes métodos dados en 3.1.7.1 o 3.1.7.2:
      1. Se dializa la proteína en tampón DPBS (Tabla 2) a 4 ° C durante la noche utilizando tubos con <20 kDa de corte.
      2. Centrífuga purificado proteínas en un 30 & #160; columna de centrifugación de ultra-filtración kDa a 2800 xg, 4 ° C hasta que el volumen es menos de 1 ml. Añadir tampón de 14 ml de DPBS a la columna para diluir la muestra de proteína. Repetir la centrifugación / dilución pasos tres veces más.
   8. Después de intercambio de tampón, añadir ditiotreitol (DTT) a la proteína purificada (final de 2 mM) y concentrado de proteína de ~ 100 mg / ml mediante centrifugación a través de una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa a 2800 xg, 4 ° C.
   9. Alícuota de la proteína concentrada y se almacenan a -80 ° C hasta su uso.
2. Purificación de C y C-SH3 _lig (condición nativa)
   1. Resuspender los sedimentos celulares en tampón B (pH 6,0) (Tabla 2) suplementado con 1x cóctel inhibidor de proteasa a 10 ml / g de sedimento húmedo. Utilizar una solución tampón ácida para minimizar la degradación proteolítica de la proteína diana.
   2. Disrupt suspensión celular por sonicación como se describe en 3.1.2. Centrifugar las Lyscomió a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C y mantener el sobrenadante.
   3. Pasar el lisado soluble a través de una columna de 5 ml de Ni-NTA equilibrada previamente con tampón B.
   4. Lavar la columna con Tampón B suplementado con imidazol 45 mM, y eluir la proteína diana en 20 ml de tampón B complementado con imidazol 150 mM.
   5. Para C, vaya al paso 3.2.6. Para C-SH3 _lig, llevar a cabo un paso adicional de purificación de intercambio iónico para eliminar la proteína parcialmente degradado como se indica en los pasos 3.2.5.1 a 3.2.5.3
      1. Reducir la concentración de NaCl en C-SH3 _LIG a <1 mM siguiendo el procedimiento descrito en 3.1.7.
      2. Carga de la proteína diana en una columna de matriz de 5 ml de aniones de cuentas intercambiador de agarosa previamente equilibrada con tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,0).
      3. Proteína diana eluyen de la columna mediante la ejecución de un gradiente de una solución que contenía Tris-HCl 10 pH 8,0 Buffer para una solución que contiene el mismo tampón suplementado con 1 M de NaCl. Tomar muestras durante la elución de proteínas y las muestras de la piscina con la más alta pureza basado en sodio dodecil sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
   6. Intercambio de tampón de la proteína purificada en tampón DPBS, como se describe en 3.1.7.
   7. Añadir DTT a la proteína purificada (concentración final 2 mM) y concentrar la proteína a ~ 100 mg / ml utilizando una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa como se describe en 3.1.8. Alícuota y almacenar concentrados de proteínas a -80 ° C hasta su uso.
3. La purificación de SH3-GFP
   1. Resuspender los sedimentos celulares usando tampón A a 10 ml / g de sedimento húmedo.
   2. Interrumpir la suspensión de pellets por sonicación como se describe en 3.1.2.
   3. Centrifugar el lisado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante.
   4. Pasar el sobrenadante (lisado soluble) a través de una columna de 5 ml de Ni-NTA equilibrada previamente conTampón A.
   5. Lavar la columna con 30 ml de tampón A suplementado con imidazol 45 mM. Eluir la proteína purificada utilizando 20 ml de tampón A suplementado con imidazol 150 mM.
   6. Intercambio de tampón de la proteína purificada en tampón DPBS usando un enfoque similar al que se describe en 3.1.7 y concentrar la proteína a ~ 150 mg / ml usando una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa como se describe en 3.1.8.
   7. Alícuota y almacenar la proteína purificada a -80 ° C hasta su uso.
4. El análisis de SDS-PAGE de muestras purificadas que contienen CUTA
   1. Diluir cada proteína purificada en agua doblemente destilada para reducir la concentración de NaCl a ~ 1 mM. A esta concentración de NaCl, la mayor parte de las proteínas trímeros CUTA ejecutar como monómeros en los geles de SDS-PAGE.
   2. Mezclar muestras con 2x tampón de muestra SDS (0,5 M de Tris-HCl, pH 6,8, 20% de glicerol, 10% w / v de SDS, 0,1% w / v-bromo fenol azul, 2% β-mercaptoetanol), se incubaron a 95 ° C durante 5 min.
   3. Cargue el sammuestras en un gel de SDS-PAGE al 12%. Llevar a cabo la electroforesis a un voltaje constante de 200 V durante ~ 50 min.
   4. Observar la proteína en los geles mediante tinción con azul brillante de Coomassie R250 siguiendo los protocolos estándar (Figura 1C).

4. Formación de hidrogel

NOTA: los hidrogeles de muestras hechas en este estudio contienen 1,6 mM de cada bloque de construcción de hidrogel a menos que se indique lo contrario. Esta concentración de proteína se obtiene un hidrogel suave y estable. PRECAUCIÓN: La azida de sodio _(NaN3) se añade al hidrogel hasta una concentración final de 0,5% w / v para evitar la contaminación bacteriana. NaN ₃ es altamente tóxica y debe manejarse con sumo cuidado, como se indica en la Hoja de Datos de Seguridad.

1. Calcular el volumen de cada una de las proteínas concentradas necesarios para alcanzar una concentración final de 1,6 mM en un hidrogel 100 l de muestra. Por ejemplo:
   Concentración de N:100 mg / ml
   Peso molecular de N: 26,3 kDa (consulte la Tabla 1)
   Concentración 100 l deseado:: Volumen deseado 1,6 mM
   
2. Para hacer un hidrogel 100 l (1,6 mM), mezclar C (x l, volumen calculado de acuerdo a 4,1) con 5% de NaN ₃ (10 l), 100 mM de DTT (5 l) y N (Y l, volumen calculado según 4.1) dentro de un vial de vidrio de 2 ml.
3. Añadir tampón DPBS ((85 - x - y) l) al vial para alcanzar un volumen final de 100 l, y mezclar manualmente todos los componentes a través de un movimiento de torbellino usando una punta de pipeta. Nota: La solución se vuelve muy viscoso tras la mezcla.
4. Centrifugar la mezcla durante 2 min a 8000 xg para eliminar las burbujas de aire.
5. Incubar la mezcla a la habitacióntemperatura durante la noche para permitir que la reacción inteína trans-empalme para llegar a la terminación. Confirme la formación del hidrogel por sonda girando al revés. Las proteínas no fluirá si se forma un hidrogel.
6. Estimar el rendimiento inteína trans-empalme mediante la comprobación de muestras (0,5 mu l cada uno) recogidos antes del paso 4.2 y después de la etapa 4.5 en un gel de SDS-PAGE, como se describe en 3.4 (Figura 1C).

5. La inmovilización de las buenas prácticas agrarias a través de proteínas Docking (DP) y la estación de acoplamiento de péptidos (DSP) Interacción

1. Para hacer una 50 l de hidrogel de GFP-funcionalizado (1,2 mM), se combinan C-SH3 _LIG (x l, calculado de acuerdo con 4.1) y SH3-GFP (l Y, calculado de acuerdo con 4,1) en una relación molar 1:1 en un 1,7 tubo de microcentrífuga ml y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min.
2. Añadir 5% NaN ₃ (5 l), DTT 100 mM (2,5 l), (42,5 - x - y) mu l DPBS al mismo tubo. Añadir N (Y l, calculado de acuerdo a 4,1) para alcanzar una relación molar 1:1 de N y C-SH3 _LIG. Mezclar la muestra mediante el uso de una punta de pipeta por un movimiento giratorio.
3. Centrifugar la mezcla a 8000 xg durante 2 min y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante la noche en la oscuridad. Un hidrogel encapsular formas SH3-GFP durante la incubación.

6. El uso de 1,6 mM de hidrogel como un andamio para la inmovilización reacción enzimática en Disolvente orgánico

1. Utilice el HRP como enzima modelo. Preparar una solución madre de HRP (28 mg / ml o 0,63 mM) en DPBS.
2. Para hacer una 30 l de hidrogel (1,6 mM) atrapando HRP, combinan C (x l, calculado de acuerdo con 4.1) con HRP (2 l), 5% de NaN ₃ (3 l) y DTT (1,5 l de 100 mM) dentro de un tubo de centrífuga de 1,7 ml.
3. Añadir N (y </ Em> l, calculado de acuerdo con 4.1) y DPBS (23,5 - x - y) l. Mezclar con una punta de pipeta con un movimiento giratorio.
4. Centrifugar la mezcla a 8000 xg durante 2 min y se incuba a temperatura ambiente durante la noche.
   PRECAUCIÓN: los regentes utilizados para el siguiente ensayo de actividad son altamente tóxicos. Utilice las recomendaciones de seguridad específicas de las correspondientes fichas de datos de seguridad de materiales.
5. Para la reacción enzimática, sumergir el hidrogel en 1 ml de cóctel de reacción que contiene N, diamina N-dimetil-p-fenileno (5,8 mM), fenol (5,8 mM) e hidroperóxido de terc-butilo (2,9 mM) en n-heptano ^14. Interrumpir manualmente el gel usando una punta de pipeta para aumentar el área de superficie de contacto del hidrogel y el disolvente.
6. Detectar producto HRP, un tinte de tipo indofenol, mediante la medición de la absorbancia óptica de las muestras tomadas en diferentes momentos a 546 nm en un lector de placas (Figura 5).

Un esquema para la formación de hidrogel de proteína intein mediada se presenta en la Figura 1A. Los bloques de construcción de hidrogel son la proteína copolímeros Cuta-NpuN (N) y NPUC-S-cuta (C) (Figura 1A, Tabla 1). NpuN / C son las N-/C-fragments del DnaE dividir naturalmente inteína de Nostoc punctiforme (Npu). Cuta es una proteína trimérica estable de Pyrococcus horikoshii ^4,5. La mezcla de purificado N y C en la presencia del agente reductor TDT induce la formación de una tercera proteína - el producto ligado (J: CUTA-S-CUTA) (Figuras 1A y 1C). Individualmente, los bloques de construcción de hidrogel N y C existen fluidos viscosos (fig. 1B). La mezcla de N y C se obtiene un material semi-sólido transparente que es retenido en la parte inferior de un vial de vidrio después de la inversión, indicativo de la formación de un hidrogel ^15,16 (Figura 1B) ¹8,19.

Este hidrogel de proteína mediada por inteína-(1,6 mM) presenta una alta estabilidad de la solución. Hay poca o ninguna pérdida de andamio hidrogel reticulado después de 21 días a 22 ° C en tampón DPBS, como la cantidad total de proteína liberada en el tampón DPBS supera sólo ligeramente la cuantía teórica de la intein empalmada del hidrogel (suponiendo 100 % inteína eficiencia trans-empalme) (Figura 3A). Densitometría reveló que, durante la formación de hidrogel, las reacciones de trans-splicing fueron ~ 80% de eficiencia (Figura 1C). Análisis en gel de SDS-PAGE mostró que sólo trazas del producto trans-empalmados estuvieron presentes en tampón circundante del hidrogel (Figura 3B, banda J), lo que confirma que la pérdida del andamio hidrogel reticulado a la erosión es mínima. La principal proteína presente en el tampón circundante del hidrogel se la empalmó fuera intein. No se observaron signos visibles de la erosión enun hidrogel no perturbado sumergido en solución acuosa a temperatura ambiente durante más de 3 meses (Figura 3A) de entrada. El hidrogel también es altamente estable a 37 ° C (Figura 3C) y en ambos tampones ácidos y básicos (Figura 3D).

Para facilitar la inmovilización de proteínas, se utilizó un par de proteínas y su ligando péptido para acoplar proteínas de interés en el armazón de hidrogel. Elegimos la proteína SH3, un dominio de homología Src 3 de la CRK adaptador de proteínas, como la proteína de acoplamiento (DP) para la fusión a una proteína de interés, y su ligando _(LIG SH3) como el péptido estación de acoplamiento (DSP) para la incorporación en el andamio de hidrogel. Este par interacción fue elegido debido al tamaño molecular relativamente pequeño (56 bis de SH3 y 11 bis de SH3 _lig) y alta afinidad _(Kd = 0,1 M) ^17,18. Se insertó SH3 _lig entre NPUC y Cuta para formar C-SH3 _lig(Tabla 1). La proteína SH3 fue fusionado al extremo N-terminal de una proteína globular diana modelo, proteína fluorescente verde (GFP) para formar SH3-GFP. El proceso se describe en el protocolo (Sección 5, la figura 4A) se obtiene un hidrogel que contiene 1,2 bloques de construcción de red troncal de hidrogel mM trans-empalmados y 1,2 mM GFP. El hidrogel que contiene GFP-exhibió una estabilidad similar al hidrogel que carecen GFP (Figura 4 B) con ~ 35% de pérdida total de la proteína después de 21 días en tampón DPBS. La mayoría de las proteínas presentes en la memoria intermedia de la erosión eran los inteins escindidos. La tasa de lixiviación de SH3-GFP a partir de un hidrogel que contiene la _LIG SH3 es ~ 30% después de 3 semanas, significativamente menor que el de un hidrogel que carecen de la _LIG SH3 (> 70% de pérdida de proteína en el mismo período de tiempo, la Figura 4C). El SH3-GFP inmovilizada en el hidrogel brilla bajo la luz ultravioleta. Como se ve en la Figura 4D, de hidrogel que contiene la estación de acoplamiento Peptide SH3 _lig conserva la mayor parte de la fluorescencia de GFP después de 3 semanas, mientras que el hidrogel carente _lig SH3 se convierte esencialmente no fluorescente. Se espera que el uso de una afinidad DP / par DSP superior puede reducir aún más la tasa de lixiviación de la proteína inmovilizada.

En este experimento, GFP se utiliza como la proteína diana, sin embargo, cualquier proteína marcada-DP puede ser convenientemente inmovilizado en este hidrogel. Por lo tanto, el hidrogel de proteína mediada por inteína-debe proporcionar un andamio general para la inmovilización de proteínas. La densidad de GFP inmovilizada demostrar en este trabajo es de ~ 33% en moles del hidrogel. Una densidad de inmovilización superior potencialmente se puede lograr cuando múltiple DSP se incorporan en el bloque de construcción de hidrogel.

A continuación, la enzima HRP se incorpora en el hidrogel de proteínas para demostrar su capacidad para apoyar la biocatálisis en disolventes orgánicos. La actividad enzimática se midió mediante el control de el acoplamiento oxidativo de N, diamina N-dimetil-p-fenileno y fenol con hidroperóxido de terc-butilo en el tiempo ^14. La hipótesis era que el medio ambiente hidratado del hidrogel protegerá la enzima unida por el efecto de desnaturalización del disolvente orgánico. Hidrogel que contiene 0,042 mM de HRP se sumerge en n-heptano que contiene los sustratos. Después de la inmersión en el disolvente orgánico, el hidrogel que contiene HRP fue interrumpido manualmente en pequeños grupos para aumentar el área de interfase hidrófilo-hidrófobo (Figura 5B). Incorporado-Hidrogel HRP catalizada eficazmente la reacción de oxidación rápida, dando lugar a un producto colorimétrico (Figura 5C, triángulos). La acumulación de producto sigue una pendiente lineal, lo que indica poca o ninguna inactivación de la enzima durante el experimento. La reacción de control con HRP disuelto directamente en el cóctel de reacción orgánico exhibió actividad catalítica insignificante debido a la desnaturalización de la enzima (datos no se muestra). HRP disolvió en DPBS primero seguido de la adición al disolvente orgánico fue capaz de catalizar la conversión, pero a una velocidad de reacción mucho más reducido (Figura 5C, círculos). La tasa de conversión baja de enzimas disueltas en DPBS es probable debido a la pequeña área interfacial entre el DPBS y el disolvente orgánico, lo que limita la velocidad de difusión de sustrato / producto. Incorporación del fragmento S altamente hidrófila en la columna vertebral de hidrogel, que efectivamente 'encierra' el agua dentro del hidrogel y evita que el disolvente orgánico para acceder a la hidrogel interior, permite que el hidrogel para resistir el efecto de desnaturalización de disolvente orgánico. Estos resultados indican que el hidrogel de proteína mediada por inteína-puede ser un andamio eficaz para reacciones enzimáticas en disolvente orgánico.

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Figura 1. Intein mediada por la proteína de hidrogel. (A) Esquema de reacción intein trans-empalme que desencadena la formación de una cadena de proteína extendida (J) con las proteínas reticulantes en ambos extremos. Proteínas Crosslinker de múltiples cadenas J proteínas no covalentemente asociado y, sobre intein mediada por la proteína de ligadura, inducen la formación de una red de proteínas altamente reticulado con propiedades de hidrogel. NpuN / A: inteína N-/C-fragment. (B) mezclar de purificado N y C (8,3% W / V) conduce a la formación de una red de hidrogel altamente reticulado (1,6 mM J). (C) Análisis de SDS-PAGE de bloques de construcción purificados N y C antes y después de la mezcla. "N + C" corresponde a una muestra tomada directamente de un hidrogel de 1,6 mM. "*" Denota una escisión si C-terminal inteínaproducto de reacción de. La intensidad de cada banda se cuantificó usando el 'módulo de rastreo en el "Quantity One" de software. Intensidad de banda se divide por el peso molecular de la proteína para obtener el equivalente molar. Eficiencia de trans-splicing (~ 80%) se calculó a partir de la cantidad del producto de J y el sin reaccionar N / C en el mismo carril. Reproducido con permiso del Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. Mapas de los plásmidos de construcciones de proteína. (A) Cuta-NpuN, (B) NPUC-S-cuta y (C) SH3-GFP ( Tabla 1) fueron clonados en pET26b vector bajo el control del promotor T7. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Estabilidad de hidrogeles de proteínas mediadas por inteína en DPBS. (A) perfil de erosión de un hidrogel de 1,6 mM a 22 º C. La línea punteada representa la masa teórica de los inteinas escindidos. La entrada muestra un hidrogel no perturbado en DPBS después de 3 meses a temperatura ambiente. (B) Análisis de SDS-PAGE de tampón circundante de hidrogel. Se agruparon todas las muestras de la memoria intermedia en la que el hidrogel se sumergió en (A) (total 7,5 ml) y se concentraron 75 veces mediante ultrafiltración a través de una 10 kDuna membrana antes de la carga de gel J:. inteína producto trans-empalmados N:.. reaccionado Cuta-NpuN NpuN: empalmados fragmento N-intein. Que no ha reaccionado C y empalmados a cabo NPUC no son visibles en el gel debido a la pequeña cantidad y tamaño pequeño (4 kDa), respectivamente. El asterisco indica bandas no identificadas. (C) perfil de erosión de hidrogel se incuba a diferentes temperaturas. (D) el perfil de la erosión de los hidrogeles se incubaron a dos pH diferentes. Reproducido con permiso del Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. Intein-hidrogel mediada apoya la inmovilización de proteínas globulares funcionales. (A) Esquema de la inmovilización de proteínas utilizando GFP como una proteína globular modelo. El bloque de construcción de hidrogel que contiene DSP-se mezcla primero con fundido-DP proteína diana para la carga proteína diana en el bloque de construcción. El complementaria inteína bloque de construcción de hidrogel que contiene el fragmento-se añade a la mezcla dando un hidrogel con GFP inmovilizado. (B) perfil de erosión de proteína total de hidrogel que contiene una relación molar 1:1 de SH3-GFP. La línea punteada representa la masa teórica de los inteinas empalmados a cabo. Las barras de error representan la desviación estándar de 2 experimentos independientes. (C) La lixiviación perfil de SH3-GFP de hidrogel con y sin el DSP. (D) Las imágenes de las buenas prácticas agrarias que contiene hidrogeles bajo exposición a rayos UV inmediatamente después de la formación del hidrogel y después de 21 días. Reproducido con permiso del Journal of American Chemical Society (doi:. 10.1021/ja401075s) Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 5. Peroxidasa de rábano picante (HRP) atrapado-hidrogel proteína intein-desencadenó facilita la reacción catalizada con HRP en disolvente orgánico de n-heptano. (A) Modelo reacción catalizada por HRP en disolventes orgánicos. (B) Fotografía de hidrogeles que contienen HRP encapsulado después de haber sido perturbado en pequeños fragmentos y se incubaron en un cóctel de reacción durante 10 min y 30 min (a la izquierda) y experimento de control con la misma cantidad de HRP no inmovilizado en tampón DPBS (a la derecha). (C) La formación de producto se controló mediante la absorbancia a 546 nm. Adaptado con el permiso del Journal of Ameripuede Chemical Society. (doi: 10.1021/ja401075s) Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Tabla 1. Construcciones de proteína utilizados en este estudio.

Reproducido con permiso del Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).

Tabla 2. Composiciones búfer.

Reproducido con permiso del Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).

En este trabajo, hemos demostrado la síntesis de una gran estabilidad de hidrogel de proteína intein mediada. El uso de una fracción de inteína permite el hidrogel que se forme condicionalmente en respuesta a la mezcla de dos componentes en fase líquida. En concreto, la división inteína covalente une dos bloques de construcción en fase líquida a través de una reacción de trans-empalme, produciendo una unidad polipéptido flanqueada por unidades de reticulación que a su vez auto se ensambla en un hidrogel. La formación inducida de mezcla de hidrogel no pasa por dificultades técnicas para la síntesis de hidrogeles de proteínas de un solo componente que puede producirse obstrucción gel mediada de columnas de purificación cromatográfica. Además, las formas de hidrogel bajo condiciones fisiológicas sin la necesidad de ningún inductores químicos extraños y / o desencadenantes físicos.

El hidrogel intein mediada conserva una alta estabilidad en los tampones tanto ácidos como básicos, y a temperatura fisiológica. Los hidrogeles pueden formar with tan poco como 0,8 mM de cada bloque de construcción individual (datos no presentados), pero más altas concentraciones de proteínas (~ 1,6 mM) hidrogeles de rendimiento con una mejor estabilidad mecánica. Alta estabilidad del hidrogel se atribuye al uso de 1) una proteína trimérica muy estable, Cuta, como un agente de reticulación, y 2) inteína para unirse covalentemente diferentes agentes de reticulación. El análisis densitométrico de geles SDS-PAGE mostró que ~ 80% de las proteínas de entrada se sometió con éxito la división de reacción trans-empalme inteína catalizada-.

Para la formación de hidrogel, bloques de construcción individuales se concentran primero en ~ 100 mg / ml. Un agente reductor, tal como la TDT, tiene que estar presente durante la etapa de concentración de proteína para evitar la formación de enlaces disulfuro intermoleculares. En ausencia de agente reductor, bloque de construcción de hidrogel individuo concentrada a veces puede formar el material similar a un hidrogel. Sin embargo, este material de tipo gel se disuelve rápidamente cuando se sumerge en un tampón y / o en presenciade agente reductor.

Para obtener un hidrogel con la máxima estabilidad, es importante asegurarse de que la relación molar de los dos bloques de construcción de hidrogel es 01:01. Cualquier bloque de exceso de edificio no será reticulado y puede afectar a las propiedades mecánicas del hidrogel. Proteína concentrada necesita ser alícuotas y almacenado de forma individual para minimizar los ciclos de congelación-descongelación.

Se demostró además el uso de la proteína de hidrogel intein mediada como un biocatalizador compatible con disolventes orgánicos. Específicamente, se observó hidrogeles que incorporan la enzima HRP se sumergieron en n-heptano que contiene el sustrato y la conversión exitosa de sustrato a producto. El hidrogel de proteína sirve como un andamio eficaz para la biocatálisis en disolvente orgánico probablemente debido a la protección de la desnaturalización-disolventes orgánicos mediada ofrecido por el entorno altamente hidratado del hidrogel.

Una de las limitaciones de thes la tecnología de inmovilización de la enzima es la necesidad de fusionar proteína diana con un péptido de acoplamiento (DP). Esta modificación puede afectar a la actividad y la solubilidad de algunos proteína diana y por lo tanto requieren la optimización de caso por caso de los constructos de proteínas etiquetadas-DP. Además, una pequeña cantidad de proteínas etiquetadas lixivia fuera de la estación de acoplamiento péptido (DSP) que contiene hidrogel después de 1 semana. La estabilidad de la proteína inmovilizada se ve afectada por la afinidad de la pareja de DSP / DP. Para lograr una mejor eficiencia de la inmovilización, se necesitará una afinidad par de DSP / DP superior. Por último, este exhibe hidrogel relativamente débiles propiedades mecánicas debido al módulo de almacenamiento meseta baja (100-200 kPa) ^9. El módulo de almacenamiento meseta está influenciada por las estructuras de tanto el agente de reticulación y el bloque central ^19. En el hidrogel de corriente, una proteína trímero fue utilizado como el agente de reticulación. El uso de la proteína reticulante con un estado multimérico superior puede aumentar potencialmente la meseta hidrogel storage módulo y sus propiedades mecánicas.

En resumen, se presenta la síntesis y caracterización de un nuevo hidrogel de proteína que se forma bajo condición de que la mezcla de dos bloques de construcción de proteínas en fase líquida, conteniendo cada uno una mitad de una división intein. Los hidrogeles de proteínas Intein mediadas representan un nuevo material prometedor, con potenciales aplicaciones en reacciones de síntesis enzimática, la síntesis orgánica, la administración de fármacos inyectables, e ingeniería de tejidos.

No existen intereses financieros en competencia.

Los autores desean agradecer al Dr. David Tirrell (Caltech), por su amable donación del plásmido pQE9 AC ₁₀ ATRP ^12, el Dr. Tom Muir (Universidad de Princeton) por su amable donación del plásmido kanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japón) por su amable donación del plásmido pET30-cuta-Tip1 ^10, y el Dr. Jay D. Keasling (UC Berkley) por su amable donación del plásmido pJD757 ¹³ . Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias CARRERA, EE.UU. Fuerza Aérea YIP y Programa de Investigación Avanzada Hackman Norman.