La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

En este protocolo se describe la producción, purificación y valoración de lentiviral vectores. Se presenta un ejemplo de entrega gen vector lentiviral mediada por neuronas cultivadas en la enseñanza primaria y astrocitos. Nuestros métodos pueden aplicarse también a otros tipos de células In vitro Y En vivo.

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity ^1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro ^4-6 and in animals ^7-10.

Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression ¹¹. The packaging signal (Ψ) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells ¹². In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation ¹³. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (http://www.addgene.org/). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time ^{14, 15}. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection ¹⁶, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.

In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

1. Embalaje de vectores lentiviral

Lentiviral vectores son producidos por cotransfección de un vector de transferencia lentiviral y otros plásmidos necesarios para el envasado en células 293T por el método de transfección con fosfato de calcio. Usamos 10 de 100 mm placas de cultivo de tejidos en este protocolo. Se puede escalar hacia arriba o hacia abajo dependiendo de las aplicaciones. La línea celular 293T se mantiene en modificado de Dulbecco medio Eagles (DMEM) con glucosa alta (4500 mg / l), suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS), 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina a 37 ° C incubadora con 5% de CO _2.

1. Semillas 293T células de la confluencia del 30-40% a 10 de 100 mm placas de cultivo de tejidos (3 x 10 ⁶ células / placa) en medio de cultivo. Volver a las células a la incubadora.
2. Después de 20-24 h de cultivo, comprobar la densidad de las células. Las células debe ser aproximadamente 80% de confluencia en el momento de la transfección.
3. Preparar un tubo de 50 ml. Añadir 4,4 ml TE79/10 (1 mM Tris HCl, 0,1 mMEDTA, pH 7,9) menos el volumen total del ADN plásmido siguiente. Añadir 100 g de transferencia lentiviral plásmido (Figura 1), 58 g pMDLg / pRRE, 31 ug pCMV-T, 25 mg pRSV-Ap, 600 l 2M CaCl _2. Mezclar con cuidado.
4. Preparar otro tubo de 50 ml. Añadir 5 ml de 2x HBS (0,05 M, HEPES 0,28 M NaCl, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,12).
5. Tomar la ADN-CaCl ₂ por mezcla de 10 ml pipeta y añadir al tubo que contenía 2 x HBS, gota a gota mientras que el tubo vortex.
6. Mantener la reacción de precipitación a temperatura ambiente (TA) durante 30 min.
7. Retire las placas de cultivo de la incubadora. Mezclar la reacción de precipitación adecuadamente por agitación. Añadir 1 ml de suspensión a cada uno de las células del plato de 100 mm que contienen. La suspensión se debe añadir lentamente, gota a gota mientras agita suavemente el medio en el plato. Volver estas placas en la estufa y se deja durante 5 horas.
8. Retire el medio de la cultura. Añadir 6 ml de medio de cultivo fresco que contiene 6 mM de sodio butyrate a cada plato. Volver a los cultivos a la incubadora. Después de cultivo durante la noche, si hay un reportero fluorescente en el constructo, comprobar la expresión del gen bajo microscopio de fluorescencia. Por lo general, más del 80% de las células expresan el gen reportero si es impulsado por un promotor ubicuo (por ejemplo, promotor CMV).
9. Dos días (40-44 h) después de la transfección, recoger el líquido sobrenadante de 10 platos en 2 50-ml tubos (aproximadamente 30 ml cada tubo). Congelar el sobrenadante en el congelador de -80 º C o ir al siguiente paso.

2. La concentración y purificación de los Vectores

1. Centrifugar el recién recogida o descongelado sobrenadante a 900 g (aproximadamente 2000 rpm) durante 10 minutos para eliminar cualquier residuo de células en el sobrenadante.
2. Coloque una jeringa de 60 ml a un filtro de 0,2-m SFCA jeringa. Transferir el sobrenadante de 50-ml tubo de la jeringa. Se filtra el sobrenadante en un tubo de centrífuga de polialómero.
3. Tomar 5 ml de sacarosa 20% (preparado en PBS) en una pipeta de 5 ml. Insertarla pipeta a la parte inferior del tubo de centrífuga que contiene sobrenadante. Añadir lentamente la solución de sacarosa en el sobrenadante del vector. Repita estos pasos con sobrenadante de otro tubo.
4. Centrifugar el sobrenadante a 11000 rpm y 4 ° C durante 4 h con rotor Beckman SW28 oscilación.
5. Eliminar el sobrenadante. Añadir 150 l de lactosa 4% (preparado en PBS) a cada tubo de centrífuga. Resuspender las pastillas.
6. Transferir el vector de concentrado de todos los tubos de centrífuga a un tubo de 1,5 ml. Dejar el tubo en hielo durante 15 min.
7. Mezclar la suspensión de vectores con la pipeta. Gira con la microcentrífuga a máxima velocidad (alrededor de 16.000 g) durante 1 min.
8. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. Divida la muestra final en 20 ml de alícuotas y se almacenan en -80 ° C congelador.

3. Valoración de los Vectores

1. Semillas de 5 x 10 ⁴ / pocillo de células HT1080 en 12-pocillos en 1 ml de medio DMEM suplementado con FBS al 10%.
2. Después de Overnigla cultura ht, contar las células de un bien y anotar el número de células.
3. Hacer 5-pliegue dilución en serie (1:5, 1: 25; 1:125, y 1:625) del vector de concentrado con medio de cultivo. Añadir I l de cada vector diluido a los pocillos separados. Las muestras pueden ser duplicados para aumentar la precisión.
4. Añadir 1 l de 4 mg / ml de polibreno (Hexadimetrina Bromuro) en cada vector que contiene bien y en un pozo sin vectorial. Mezcle agitando suavemente la placa. Volver a la incubadora durante 48 h.
5. Quitar medio de los pocillos de cultivo de células. Lavar cada pocillo con PBS. Añadir 250 l 1x tripsina-EDTA solución a las células. Cuando las células se separan (3-5 minutos), añadir 1 ml de medio de cultivo. Resuspender las células mediante pipeteo. Transferir la suspensión de células a tubos de 1,5 ml de centrífuga.
6. Centrifugar a 900 g durante 6 minutos. Para los vectores con un gen indicador fluorescente (GFP, por ejemplo), vaya al paso 3.7 para el análisis de FACS. Para los vectores sin un periodista, vaya al paso 3.8 para qPCR en tiempo real.
7. Para los vectores que contienen un fluogen reportero fluorescentes, separar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 300 l de 3,7% de formaldehído en PBS. Determinar el porcentaje de las células informadoras positivos por análisis FACS. El título se representa como unidades de transducción por mililitro concentrado vector (TU / ml).

Por ejemplo, si 1 x 10 ⁵ células transducidas con l fue 1/25 (0,04 l) vector y las células 30% son reportero positivo, el título será:

Sólo utilizar las diluciones caer en una relación lineal entre el porcentaje de células positivas y la cantidad de vector añadido para calcular título. El título final debe ser un promedio de los títulos obtenidos a partir de transducciones de al menos 2 diferentes cantidades del vector.

8. Para los vectores sin ungen reportero fluorescente, extraer el ADN genómico de las células HT1080 con QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), según el protocolo del fabricante. Amplificar la secuencia del vector en el ADN genómico utilizando ABI Prism 7000 secuencia sistema de detección (Applied Biosystems) con los cebadores (VIH-1 en PBS / psi región ¹⁷⁾ 5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 'y 5'-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3', y sonda TaqMan 5 '-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3'. Gen de la albúmina que es un gen de copia única en el genoma (2 copias / célula) también fue amplificado con los primers 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 'y 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3', y la sonda de 5'-FAM-TAMRA TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-3- "como un control interno. Determinar el número de copias del vector y la albúmina por PCR en placa de 96 pocillos de acuerdo con la fabricación de instrucción con el siguiente programa: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, y 35 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 2 min. Diez veces diluciones seriadas de los plásmidos de concentración conocida y representada como una copianúmero) que contiene las secuencias modelo también debe ser amplificada para crear una curva estándar para la cuantificación de muestras desconocidas. El título se representa como unidades de integración por mililitro concentrado vector (UI / ml).

4. Transducción de las Culturas neocorticales

Culturas neocorticales que contienen tanto las neuronas y glía se preparó a partir de cortezas de ratón utilizando un procedimiento de chapado de dos pasos como se ha descrito previamente ^18. Neocorteza obtenidos de ratones fetales en 14-16 días de gestación se sembraron en una monocapa previamente establecido gliales en MEM suplementado con FBS al 10%, 20 mM de glucosa y glutamina 2 mM en 24-así placa de cultivo de tejido.

1. Después de 5 días in vitro, añadir 10 mM citosina arabinósido (Ara-C) en NEOCcultura ortical para inhibir no neuronal división celular. Continuar cultivar las células durante 2 días.
2. Medio de cultivo en caliente 37 ° C baño de agua durante 5-10 minutos. Sustituir Ara-C que contiene el medio con medio de cultivo fresco (500 l / pocillo).
3. Añadir vector con deseado MOI (multiplicidad de infección; la relación del número de partículas de vectores para el número de células diana) para el cultivo. Continuar la cultura durante 24 horas. Usamos MOI de 1-10 (generalmente 5) en cultivos primarios corticales.
4. Sustituir el medio de cultivo con medio fresco. Continuar la cultura. Si hay un gen reportero en la construcción de vectores, visita células bajo microscopio fluorescente 2 días después de la transducción. La expresión del gen será visible en las neuronas 2-7 después de la transducción, dependiendo del diseño del vector y la dosis utilizada.

5. Los resultados representativos

Los títulos de los vectores lentivirales producidos con este rango de protocolo de 10 ⁸ -10 ¹⁰ UI / ml, which son adecuados para la transducción de una variedad de tipos de células a partir del SNC, tanto in vitro como in vivo. Tabla 1 y Figura 2 muestran un resultado representativo utilizando los vectores producidos por este protocolo. Nos transducidas murinos culturas neocorticales con vectores lentivirales que expresan la proteína verde fluorescente (GFP), controlada por sinapsina (SYN) promotor o promotor de la proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Siete días después de la transducción, se realizó inmunotinción a las neuronas y astrocitos de la etiqueta con anticuerpos anti-NeuN y anti-GFAP, respectivamente. Como se muestra en la tabla 1 y fig. 2A, después de la transducción con el vector que lleva el promotor sinapsina, más del 90% de las neuronas (células NeuN ⁺⁾ expresa las buenas prácticas agrarias y los astrocitos no (GFAP ^{+ en las} células) expresan este gen reportero. Cuando promotor GFAP se utiliza en la construcción de vectores (Fig. 2B), alrededor del 80% de los astrocitos (GFAP ⁺ células) expresións las buenas prácticas agrarias; todos GFP ⁺ células son los astrocitos según lo confirmado por colocalización con Bosnia y Herzegovina y la ausencia de expresión de GFP en las células NeuN marcadas. Estos resultados demuestran que los vectores lentiviral son muy eficientes para entregar los transgenes de las células de SNC y células específicas de la expresión génica puede lograrse cuando se utilizan promotores apropiados.

Figura 1. Representación esquemática de VIH-vectores basados ​​en lentivirus y los plásmidos de embalaje. El VIH-1 provirus se muestra en la parte superior. Los elementos para la producción de vectores están separados en cuatro diferentes plásmidos. La transferencia del plásmido lentiviral contiene un híbrido LTR 5 'en la que se sustituye la región U3 con el citomegalovirus (CMV), la señal de empaquetamiento (ψ), la secuencia RRE, el tracto polipurina central (cPPT), un gen de interés (por ejemplo un reportero fluorescente), junto con un promotor de la elección, y LTR 3 'en la que elsecuencias reguladoras cis se elimina completamente de la región U3. pMDLg / pRRE contiene los genes gag y pol y secuencia RRE de VIH-1 bajo el control del promotor CMV. pRSV-Ap contiene la secuencia codificante de Rev impulsado por el promotor RSV. pCMV-G contiene el gen de la proteína VSV-G bajo el control del promotor CMV. PA indica la señal de poliadenilación de β-globina humana gen.

Figura 2. Expresión de genes reporteros en el ratón cultivo mixto neocortical transducidas con vectores lentivirales que llevan el tipo de células específicas de los promotores. Los cultivos fueron transducidas con el LV-SYN-GFP (A) o LV-GFAP-GFP vectores (B) a una MOI de 5. Siete días después de la transducción, las células se immunostained con anticuerpo anti-NeuN o anti-GFAP. Los paneles superiores muestran la fluorescencia de GFP, los paneles centrales muestran inmunotinción y los paneles inferiores se fusionan imágenes (GFP: verde; NeuN y GFAP: rojo).

Tabla 1. Comparación de la expresión de GFP en murinos culturas neocorticales transducidas con vectores lentivirales que llevan ^a diferentes promotores.
^unas culturas murinos neocorticales (5 x 10 ⁵ / bien en placa de 24 pocillos) fueron transducidas con el LV-SYN-GFP o LV-GFAP-GFP en una MOI de 5. Siete días después de la transducción, las culturas se fijaron y se immunostained para NeuN y GFAP. El número de células GFP y NeuN / GFAP que expresan fueron contadas en imágenes de 10 campos por condición experimental. Los valores representan el porcentaje de las neuronas (células NeuN ⁺⁾ oastrocitos (GFAP ^{+ en las} células), que también expresa el gen reportero GFP. Los valores mostrados son medias ± SD de tres experimentos independientes.

En este protocolo, se ha demostrado la producción de vectores lentivirales y la aplicación de estos vectores en cultivos neocorticales. Hemos demostrado eficaz y tipo de células específicas de transducción con los vectores producidos por estos métodos. Cuando el promotor sinapsina se utiliza, la expresión de GFP es estrictamente neurona específica. Cuando el promotor de GFAP se utiliza, la expresión de GFP es exclusivamente en los astrocitos. Si ningún tipo de células específicas de expresión se requiere, un promotor ubicuo puede ser utilizado. Encontramos tanto ubiqutin y fosfoglicerato quinasa (PGK) los promotores pueden controlar la expresión de genes de alto nivel en las culturas neocorticales ^6. La expresión de genes impulsada por vectores lentivirales puede ser personalizado para determinados niveles de tipos de expresión o una célula por la elección de los promotores (por ejemplo, en todas partes, o tipo de células específicas) o mediante el uso de diferentes proteínas del sobre o pseudotipos vectores a los tejidos o aplicaciones específicas. Por ejemplo, pseudotyping con la rabia proteína G o una fusión de VSV-G und proteína apoya la rabia transporte axonal retrógrado ^19,20. El protocolo de transfección transitoria permite embalaje vector con diferentes proteínas de la envoltura.

Lentiviral vectores son comúnmente se concentró por ultracentrifugación sin etapas de purificación. Estos vectores no purificados son adecuados para muchos tipos de células. Sin embargo, cultivos primarios de neuronas son sensibles a los contaminantes a partir de células productoras, dando lugar a variación entre lotes para la citotoxicidad. El cojín 20% de sacarosa etapa de purificación hace que los vectores consistentemente no tóxico en las neuronas primarias. Recomendamos el uso de vectores purificados para la transducción de las neuronas primarias y la inyección en los animales. Si mayor escala o mayor pureza de las preparaciones de vectores se requieren, otras técnicas de purificación, tales como cromatografía de afinidad y ²¹ de intercambio de aniones membrana cromatografía ²² puede ser utilizado. Como a largo plazo de transducción se requiere generalmente en cultivos primarios de neuronas, Se recomienda especial precaución se debe tomar para minimizar la contaminación durante la preparación de los vectores. Pasando el sobrenadante vector con filtro de 0,2 micras y utilizando tubos de centrífuga de polialómero autoclave durante la concentración del vector servirá para este propósito. Tapa de la botella-filtros pueden ser utilizados si un gran volumen de sobrenadante necesita ser filtrada. Butirato de sodio se ha informado que estimulan la actividad de los promotores ^23. La adición de butirato sódico al medio de cultivo después de la transfección de las células productoras puede aumentar el título vector de más de 10 pliegues ^24. Polybrene (Hexadimetrina bromuro) ha sido ampliamente utilizado para los protocolos de transferencia de genes para aumentar la eficiencia de la transferencia de genes retrovirales mediante la neutralización de las cargas negativas, lo que facilita la interacción vector-célula ^25. En nuestras manos, polibreno es tóxico para las neuronas en cultivos neocorticales. Por lo tanto, polibreno se debe evitar en la transducción de cultivos primarios de neuronas. Si hayun reportero fluorescente en el vector, es conveniente para determinar el título vector por análisis FACS. Cuando no está disponible reportero o un gen reportero es impulsado por un promotor específico de tejido qPCR, para la detección de la integración del vector en las células diana debería ser una opción mejor como la integración del vector es independiente de la expresión del transgén. El título de vectores específicos determinados por análisis FACS será menor que la de qPCR porque no todas las copias integradas del vector son funcionales. Los títulos vectoriales también se puede determinar midiendo la proteína p24 de HIV por ELESA o vector de ARN genómico de QRT-PCR en preparaciones de vectores. Sin embargo, estos métodos son menos precisos, debido al gran número de partículas virales defectuosas inevitablemente se generan durante el proceso de envasado y las partículas orgánicas que no éxito transduce las células diana ^26. Los vectores hechas por este protocolo se han utilizado con éxito en tanto in vitro como in vivo en ROdente del cerebro ^27. Los investigadores deben probar en sus sistemas de forma individual, como vector de expresión génica mediada no es necesariamente idéntico en cultivos celulares y en sistemas in vivo, incluso en el mismo tipo de células ^6,28. Lentiviral vectores han sido ampliamente utilizados para la sobreexpresión o derribar genes de interés en una variedad de tipos de células en el SNC. El protocolo debería ser útil para los investigadores de la neurociencia para desarrollar vectores lentivirales en las aplicaciones de sus investigaciones.

No hay conflictos de interés declarado.

Este trabajo fue apoyado por el NIH Blueprint Neurociencia básica de subvención (P30 NS057105, BJS) de la Universidad de Washington, el Programa de Proyecto de Donación NS032636 (BJS) y por el Centro de Esperanza para los Trastornos Neurológicos.