Die Studie untersucht die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen im Aortenbogen und an der Wurzel von LDLR-Knockout-Mäusen und bietet ein Protokoll für die Isolierung, Färbung und Analyse zur Beurteilung der Plaquezusammensetzung des Schweregrads der Atherosklerose. Zu den praktischen Techniken zur Beurteilung der Atherosklerose gehören neben der histologischen Untersuchung, die in dieser Studie verwendet wird, auch biochemische Marker, molekularbiologische Tests und Gefäßultraschall. Die Präzision des Dissektionsverfahrens stellt die größte technische Hürde bei der Durchführung des in vivo Aortenstrippings im Mausmodell der Atherosklerose dar.
Legen Sie die eingeschläferten Mäuse zunächst in Rückenlage auf eine Schaumstoffplatte, die mit ein bis zwei Lagen saugfähigem Papier bedeckt ist. Fixiere die Gliedmaßen mit Stiften, um den Körper zu stabilisieren. Sprühen Sie 75%Ethanol über den Bauch der Mäuse, um das Fell zu reinigen und zu befeuchten.
Fassen Sie mit einer Pinzette die Bauchhaut der Maus an. Schneiden Sie dann mit einer feinen Schere die Haut von der Basis des Bauches bis zum oberen Hals ab. Öffnen Sie die Bauchdecke und heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette an.
Schneiden Sie sowohl das Zwerchfell als auch die Rippen durch, um die Brusthöhle freizulegen. Entfernen Sie die Speiseröhre und die Luftröhre, um die Reinigung der Halsschlagadern zu erleichtern. Entfernen Sie vorsichtig Organe wie Leber, Lunge, Milz, Magen-Darm-Trakt und Bauchspeicheldrüse, während Sie die Nieren und die Bauchschlagader schonen.
Wenn Sie die Mesenterialarterien präparieren, heben Sie den Darm an und machen Sie Schnitte von der Aorta weg, um Schäden zu vermeiden. Positionieren Sie nun die Maus unter einem Stereomikroskop, um ein klares Beobachtungsfeld zu erhalten, und richten Sie eine kalte Lichtquelle auf den Präparierbereich aus. Injizieren Sie mit einer mit PBS gefüllten 10-Milliliter-Spritze langsam mit einer Nadel in die linksventrikuläre Spitze und beobachten Sie die Erweiterung der Aorta.
Wischen Sie Blut und Flüssigkeit im Sezierbereich vorsichtig mit Seidenpapier ab, um das Sichtfeld vollständig freizulegen. Fassen Sie anschließend mit einer Pinzette das Zwerchfellsegment der thorakalen Aorta und durchtrennen Sie mit einer Federschere das Bindegewebe zwischen der Aorta und der Brustmuskelwand. Ziehen Sie vorsichtig mit einer Pinzette am Herzen und heben Sie die thorakale Aorta an.
Beobachten Sie die Äste des Aortenbogens und präparieren Sie das Adventitialfett und Bindegewebe um den Aortenbogen und seine Äste nach oben entlang der thorakalen Aorta. Präparieren Sie die Bauchschlagader und die Arteria iliaca communis entlang der thorakalen Aorta nach unten. Schneiden Sie das Herzgewebe ab und schneiden Sie die untere Hälfte des Herzens entlang einer Ebene parallel zu den Vorhöfen und legen Sie das getrimmte Herz in ein geeignetes Speichermedium.
Bevor du den Aortenbogen zerlegst, lege eine kleine dunkle Dichtung darunter, um einen Kontrast zu schaffen. Machen Sie ein Foto vom Bereich des Aortenbogens. Schneiden Sie die Arteria iliaca communis ein bis zwei Millimeter unterhalb ihrer Bifurkation ab und schneiden Sie die kleinen Äste der Aorta entlang der Wirbelsäule ab, um sie zu befreien.
Nachdem Sie die Nierenarterien in der Nähe der Nieren gelöst haben, schneiden Sie die drei Astgefäße im Hals von ihren distalen Enden ab. Zum Schluss schneidest du die aufsteigende Aorta in der Nähe des Herzens ab. Bereiten Sie im Voraus einen Milliliter 4%ige Paraformaldehydlösung in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vor.
Legen Sie die Aorta in den vorbereiteten Schlauch und fixieren Sie ihn mindestens 24 Stunden lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie dann die Aorta in eine Petrischale, die PBS enthält, um ein Austrocknen zu verhindern. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop vorsichtig das verbleibende Adventitalfett mit einer Pinzette und einer Federschere, um Störungen bei der Plaquequantifizierung zu reduzieren.
Schneiden Sie die Aorta mit einer Federschere vorsichtig entlang der inneren Längsachse auf. Schneiden Sie nacheinander die drei Äste des Aortenbogens entlang der lateralen Seite bis zur Höhe der Krümmung des Aortenbogens auf, damit er sich vollständig ausbreiten kann. Fahren Sie in diesem Stadium entweder mit der Ölrot-O-Färbung fort oder lagern Sie die Aorta in 4 % Paraformaldehyd für zukünftige Analysen.
Legen Sie die aufgeschnittene Aorta in eine Platte mit sechs Vertiefungen. Geben Sie einen Milliliter steriles doppelt destilliertes Wasser in jede Vertiefung und waschen Sie es fünf Minuten lang auf einem Shaker. Legen Sie die Sechs-Well-Platte in einen Abzug und trocknen Sie sie 20 Minuten lang an der Luft, bis keine sichtbaren Wasserflecken mehr vorhanden sind.
Geben Sie einen Milliliter frisch zubereitete Oil Red O-Arbeitslösung in jede Vertiefung. Nachdem Sie die Platte 20 Minuten lang geschüttelt haben, entfernen Sie die Oil Red O-Lösung aus den Vertiefungen. Geben Sie zwei Milliliter steriles, doppelt destilliertes Wasser in jede Vertiefung und waschen Sie es fünf Minuten lang.
Bewahren Sie die Aorta nach drei Wäschen in doppelt destilliertem Wasser auf. Übertragen Sie die Aorta auf einen Objektträger und legen Sie ein schwarzes Gummipolster unter den Objektträger, um den Kontrast zu erhöhen. Spreizen Sie die Aorta, während Sie unter dem Stereomikroskop betrachten.
Legen Sie nun die Folie auf ein weißes Papier, um den Kontrast weiter zu verbessern. Positionieren Sie ein Lineal neben der Folie und nehmen Sie ein Foto mit einer Kamera auf. Lagern Sie die behandelte Aorta in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das einen Milliliter PBS enthält, um sie feucht zu halten.
Das Körpergewicht von LDLR-Knockout-Mäusen, die mit einer westlichen Diät gefüttert wurden, stieg signifikant an im Vergleich zu denen, die mit der Chow-Diät gefüttert wurden. Die Plasma-Triglycerid- und Gesamtcholesterinspiegel waren in der westlichen Diätgruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Die Aortenöl-Rot-O-Färbung zeigte eine starke Lipidakkumulation in den Arterien von LDLR-Knockout-Mäusen, die mit der westlichen Diät gefüttert wurden, im Vergleich zu denen, die eine Chow-Diät erhielten.
Erhöhte Lipidablagerungen korrelierten mit schwereren atherosklerotischen Läsionen. Die Läsionsfläche der Aortenwurzel und der nekrotische Kern waren bei Mäusen, die mit westlicher Nahrung gefüttert wurden, signifikant größer als bei Mäusen, die mit Futter gefüttert wurden. Die Quantifizierung des läsionalen Bereichs der Aortenwurzel und des nekrotischen Bereichs bestätigte, dass die westliche Ernährung die atherosklerotische Plaquebildung bei LDLR-Knockout-Mäusen verschlimmerte.
