Endolysosomale Kompartimente sind die kleinsten Organellen in Zellen. Herkömmliche elektrophysiologische Verfahren sind nicht in der Lage, ihre Spannungs- und Stromänderungen direkt zu messen. Die Endolysosomen-Patch-Clamp-Technik ermöglicht direkte Aufnahmen, die es uns ermöglichen, zuvor in den Ionenkanälen zu untersuchen.
Die größte experimentelle Herausforderung besteht darin, dass nicht alle Verbindungen die Lysosomen effektiv vergrößern. Die Identifizierung geeigneter Zellen ist schwierig, und selbst mit idealen Lysosomen ist eine erfolgreiche Ionenkanalaufzeichnung nicht garantiert. Wir haben die Endolysosomen-Patch-Clamp-Technik entwickelt, um direkte elektrophysiologische Ableitungen von endolysosomalen Membranen zu ermöglichen.
Dieser Durchbruch ermöglichte es uns, Ionenkanäle wie TRPMLs und TPCs zu charakterisieren und ihre Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern, der Degeneration von Neuronen und Stoffwechselstörungen aufzuzeigen. Unsere Methode ermöglicht die direkte Aufzeichnung von lysosomalen Ionenkanälen, die Überwindung von Größenbeschränkungen für Ganzzell-Patch-Clamps und die Verbesserung der Vesikelauswahl bei gleichzeitiger Integration fluoreszenzbasierter Techniken. Setzen Sie zunächst das Kapillarrohr in die Polare ein.
Drücken Sie die grüne Zugtaste auf der Tastatur. Lösen Sie den Klemmknopf und entfernen Sie die gezogenen Pipetten aus der Polung. Legen Sie anschließend die gezogenen Patch-Pipetten in den Microforge-Halter.
Prüfen Sie die Pipettenspitzen mit einer 35-fach-Objektivlinse in Kombination mit einem 15-fach-Okular für eine Gesamtvergrößerung von 525x. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Patch-Pipetten nahe an das Filament zu bringen. Stellen Sie den Temperaturregler auf 80.
Sobald die Heizung eingeschaltet ist, halten Sie den Fußschalter ein bis zwei Sekunden lang gedrückt, um einen kurzen Wärmeimpuls auszulösen. Legen Sie die polierten Pipetten nach dem Polieren in eine versiegelte Schachtel, um eine Staubkontamination zu vermeiden. Geben Sie einen Milliliter der Badlösung in die Kammer.
Entfernen Sie ein Deckglas mit behandelten HEK 293-Zellen von der 24-Well-Platte. Übertragen Sie den Deckglas in die Mikroskopkammer. Verwenden Sie eine selbstgemachte Kunststoff-Füllnadel, um die Isolationspipette mit Pipettenlösung zu füllen.
Setzen Sie die gefüllte Pipette am vorderen Ende der Patch-Klemme ein. Bewegen Sie die Isolationspipette unter einem Mikroskop mit einem 40-fach-Objektiv und einem 10-fach-Okular in die Nähe von ausreichend vergrößerten Endosomen oder Lysosomen. Senken Sie die Isolationspipette mit dem Mikromanipulator ab, bis sie den Rand der Plasmamembran berührt.
Bewegen Sie die Pipette schnell, um ein kleines Stück der Membran abzureißen. Drücken Sie mit derselben Pipette von der gegenüberliegenden Seite auf die Zelle, um Endosomen/Lysosomen etwa zwei Mikrometer von der Zelle entfernt herauszudrücken. Füllen Sie eine frisch polierte Patch-Pipette mit der entsprechenden Pipettenlösung.
Montieren Sie die Pipette am vorderen Ende des Verstärkers. Üben Sie einen Überdruck von 20 bis 50 Millibar auf die Pipette aus und halten Sie ihn aufrecht, indem Sie das Ventil verriegeln. Schieben Sie anschließend die Pipettenspitze in die Badlösung und positionieren Sie sie in der Mitte des Sichtfeldes.
Wenden Sie wiederholte Stromimpulse an, um den Pipettenwiderstand, den Dichtungswiderstand und den Serienwiderstand zu bestimmen. Überwachen Sie die Größe der Pipettenspitze, die Dichtungsbildung und die Etablierung der gesamten endolysosomalen Konfiguration. Bewegen Sie die Pipette schnell nahe an die Oberseite des Zielvesikels.
Beobachten Sie, wie sich das Vesikel aufgrund des Flüssigkeitsflusses aus der Pipette bewegt oder rollt. Stellen Sie die Offset-Spannung der Pipette auf null Millivolt ein. Lassen Sie sofort den Überdruck ab, um das Vesikel in Richtung der Pipette zu ziehen und innerhalb einer Sekunde einen Gigaseal zu bilden.
Verwenden Sie für die Aufzeichnung des gesamten Vesikels einen kurzen Hochspannungsimpuls von zwei bis fünf Millisekunden, um die Membran an der Kontaktstelle zwischen der Pipette und der Organelle zu unterbrechen. Stellen Sie die Spannung von 500 bis 1000 Millivolt ein. Um den Strom aufzuzeichnen, führen Sie endolysosomale Spannungsklemmenexperimente mit einem breiten Bereich von Eingangsspannungen durch, um die Membraneigenschaften zu beurteilen.
Während der Gigasealbildung nahm die aktuelle Reaktion rapide ab, was auf die erfolgreiche Etablierung des Lysosomen-Bindungsmodus hinweist. Durch wiederholtes Anlegen einer kontinuierlichen Eingangsspannung wurden Ströme über die endolysosomale Membran aufgezeichnet, die Basal-, Agonisten- und Leckströme zeigten.
