Die Erzeugung von menschlichen Lebersphäroiden unter Verwendung autologer Quellen kann zu verschiedenen Forschungsbereichen wie Toxikologie, Krebs und Arzneimittelforschung beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, BDPC-abgeleitete menschliche Hepatozyten zu verwenden, um menschliche Lebersphäroide zu entwickeln, wodurch der Mangel an primären menschlichen Hepatozyten oder PHH umgangen wird. Autologe humane Sphäroide können auf die regenerative Medizin und Therapie ausgeweitet werden, insbesondere bei Patienten mit akutem Leberversagen.
Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Anne-Katherin Schott, Projektleiterin in meinem Labor. Beginnen Sie mit der Herstellung von 500 Millilitern Hepatoblast KnockOut-Serumersatz-Dimethylsulfoxid oder KSR-DMSO-Medium und Hepatozyten-Reifungsmedium. Aliquotieren Sie das Medium aus dem Stamm und fügen Sie frischen Hepatozytenwachstumsfaktor oder HGF und Oncostatin M oder OCM in Endkonzentrationen von 10 oder 20 Nanogramm pro Milliliter für jeden Mediumwechsel hinzu.
Übertragen Sie dreimal 10 auf die fünfte aus Blut gewonnene pluripotente Stammzellen oder BD-PSC-Zellen in eine mit Biolaminin beschichtete Vier-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte fünf Tage lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Um die endodermale Differenzierung zu unterstützen, kultivieren Sie die Zellen fünf Tage lang in KSR DMSO-Hepatoblastmedium und wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden. Fügen Sie am fünften Tag Hepatozyten-Reifungsmedium hinzu und kultivieren Sie die Zellen für weitere sieben bis 10 Tage im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, wobei sicherzustellen ist, dass das Medium alle 48 Stunden gewechselt wird.
Die Zellen werden mit einer Zählkammer gezählt und die dedifferenzierte BD-Zellsuspension bei 300 G 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstandes resuspendieren BD-dedifferenzierte Zellen in KSR-DMSO-Medium bei zwei mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter-Konzentration. Nachdem Sie die Einzelzellsuspension sichergestellt haben, entfernen Sie alle zusätzlichen Rückstände, indem Sie die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb führen.
Zählen Sie die Zellen erneut mit einer Zählkammer und bereiten Sie ein ausreichendes Volumen jeder Zellaussaatdichte vor, um das erforderliche Volumen pro Vertiefung abzugeben. Bereiten Sie einen Gradienten mit einer Top-Aussaat von einer Million Zellen bis zu einer niedrigen Aussaatdichte von 4.000 Zellen vor. Als nächstes geben Sie 100 Mikroliter KSR DMSO-Medium in 96-Well-Platten mit niedriger Befestigung ab und fügen 100 Mikroliter Zellaussaatverdünnung hinzu.
Inkubieren Sie die niedrige Befestigungsplatte fünf Tage lang. Wechseln Sie 50% des Mediums am dritten oder vierten Tag nach der Aussaat, wenn die Sphäroide ausreichend kompakt sind. Wechseln Sie am fünften Tag das Medium in ein Hepatozyten-Reifungsmedium und kultivieren Sie die darin enthaltenen Zellen für weitere sieben bis 10 Tage, wobei Sie das Medium alle 48 Stunden wechseln.
Nachdem Sie die Zellen 4, 8, 15 und 24 Tage lang mit der zuvor beschriebenen Differenzierungsmethode kultiviert haben, entfernen Sie das Medium. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit vorgewärmten Fixiermitteln, die 4% Paraformaldehyd in PBS enthalten. Als nächstes entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen zweimal für jeweils fünf Minuten mit PBS.
Fügen Sie sofort 0,1% Triton X-100-Lösung hinzu und permeabilisieren Sie die Zellen fünf Minuten lang, bevor Sie zweimal PBS waschen. Fügen Sie eine Blockierlösung aus PBS und 5% Rinderserumalbumin oder BSA hinzu, bevor Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf eine Wippplatte legen. Verdünnen Sie die Primärantikörper in einem Verdünnungspuffer von 1 % BSA PBS und fügen Sie 50 Mikroliter der Antikörperverdünnung pro Vertiefung hinzu.
Verwerfen Sie die Antikörperlösung nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur und geben Sie drei Wäschen à fünf Minuten mit PBS. Fügen Sie 50 Mikroliter sekundäre Antikörper hinzu, die in Verdünnungspuffer in jeder Vertiefung verdünnt sind, und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen dreimal fünf Minuten lang mit PBS gewaschen haben, montieren Sie die Deckgläser mit Eindeckmedien, die DAPI enthalten, für die mikroskopische Analyse.
Entsorgen Sie die Nährmedien vorsichtig, ohne die Sphäroide zu berühren, und fügen Sie frisch zubereitetes PBS mit 0,1% Triton X-100-Lösung hinzu und inkubieren Sie es fünf Minuten lang, um die Zellen zu permeabilisieren. Waschen Sie die Sphäroide zweimal mit dem Medium, indem Sie das Medium langsam pipettieren. Anschließend inkubieren Sie die Sphäroide eine Stunde lang mit 50 Mikrolitern der Primärantikörper.
Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Antikörperlösung und geben Sie drei Wäschen mit Medium. Bereiten Sie die entsprechenden sekundären Antikörper wie Ziegen-Anti-Maus-IgG Cy3, Ziegen-Anti-Maus-IgG 488 und Kaninchen-Anti-Huhn-IgG Texas Red in PBS mit 1% BSA vor und fügen Sie 50 Mikroliter Antikörperverdünnung pro Vertiefung vor 20 Minuten Inkubation im Kohlendioxid-Inkubator hinzu. Waschen Sie es erneut dreimal mit dem Medium vor 30 Minuten Inkubation im Inkubator.
Schalten Sie die Fluoreszenzlichtquelle 10 Minuten vor Gebrauch ein. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Bildbearbeitungssoftware. Verwenden Sie das 4-fache Vergrößerungsobjektiv, indem Sie auf die 4-fache Schaltfläche in der Symbolleiste klicken, um die richtige Maßstabsleiste auszuwählen.
Legen Sie dann die 96-Well-Platte auf die Bühnenmittelplatte. Schalten Sie die LED-Lichtquelle ein, verwenden Sie den Hellfeldfilter und positionieren Sie die Platte mit dem Einstellknopf für die XY-Achse an der gewünschten Vertiefung. Wechseln Sie zum Lichtweg der Kamera und klicken Sie in der Bildgebungssoftware auf die Live-Schaltfläche, um das Bild auf dem Bildschirm zu visualisieren.
Stellen Sie sicher, dass das Sphäroid mit den Knöpfen der XY-Achse zentriert ist, und fokussieren Sie mit dem Grob- oder Feinfokusknopf. Wählen Sie als Nächstes die Hellfeld-Beobachtungsmethode in der Symbolleiste aus, stellen Sie die Belichtungseinstellungen auf "Automatisch" und klicken Sie auf die Schaltfläche "Schnappschuss" in der Kamerasteuerung, um ein Bild aufzunehmen. Speichern Sie dann das Bild als VSI-Datei mit dem entsprechenden Namen im gewünschten Ordner.
Platzieren Sie eine Abschirmplatte für das Umgebungslicht, um das LED-Licht auszuschalten und den Filter für die B-Anregung zu wechseln. Wählen Sie dann die Beobachtungsmethode 488. Öffnen Sie den Verschluss, machen Sie ein Bild, indem Sie auf die Schaltfläche "Schnappschuss" klicken, schließen Sie den Verschluss und speichern Sie die Datei als VSI.
Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Filter für die G-Anregung, um den Vorgang für jede interessierende Vertiefung zu wiederholen. Morphologische Veränderungen während des hepatischen Differenzierungsprozesses zeigten, dass sich die BD-PSCs in drei Stadien zu Hepatozyten differenzierten. Die erste Stufe stellte die Differenzierung in endodermale Zellen dar.
Die zweite Differenzierung erfolgt in hepatische Vorläuferzellen, die eine typische polygonale Morphologie aufweisen. Und der dritte, die Reifung zu Hepatozyten. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte die starke Expression von Endoderm-Vorläufermarkern der menschlichen Leber wie dem Alpha-Fetoprotein oder APF und Transthyretin oder TTR in den Zellen in der ersten Phase des hepatischen Differenzierungsprozesses am Tag L4 bis L8.
Ihre Expression nahm jedoch am Tag L15 ab. Die Expression von Albumin oder ALB und Hepatozyten-Kernfaktor vier alpha oder HNF4 alpha erschien zuerst an L4, nahm während der Differenzierungszeit L4 bis L15 zu und erreichte eine starke und stabile Expression während der Reifezeit L15 bis L24. Eine spontane Aggregation von Zellen wurde in Platten mit niedriger Bindung beobachtet, die die Induktion von Hepatozyten oder die durch das Reifungsmedium initiierte Sphäroidbildung enthielten.
Es wurde eine konsistente Korrelation zwischen dem Steroidsphäroid und der variablen Anzahl von Zellen beobachtet. Die an L14 gebildeten und differenzierten und mit Antikörpern lebend gefärbten Sphäroide zeigten die potentielle hepatische funktionelle Aktivität von BD-PSCs-abgeleiteten Sphäroide. Die Vorbereitung mononukleärer Zellen für die Reprogrammierung ist der wichtigste Schritt in diesem Verfahren.
Die Erzeugung menschlicher Lebersphäroide ist der erste Schritt zur Herstellung von Organoiden in vitro, einer vereinfachten Version des Organs in 3D mit einer Mikroanatomie, die der in vivo ähnelt. Im Labor hergestellte Organoide werden verwendet, um Organogenese, Krankheitsentwicklung und Nährstoffe zu untersuchen.
