用于肝病研究的外周血人肝球

使用自体来源生成人肝球体可以为毒理学、癌症和药物发现等各种研究领域做出贡献。该技术的主要优点是使用BDPC衍生的人肝细胞来设计人肝球，从而规避了原代人肝细胞或PHH的短缺。自体人球体可以扩展到再生医学和治疗，特别是在急性肝衰竭患者中。

演示该程序的将是我实验室的项目负责人Anne-Katherin Schott博士。首先准备500毫升成肝细胞敲除血清替代二甲基亚砜或KSR DMSO培养基和肝细胞成熟培养基。从原液中分装培养基，并加入新鲜的肝细胞生长因子或HGF和oncostatin M或OCM，每次培养基变化的终浓度为每毫升10或20纳克。

将三次10转移到第五个血源性多能干细胞或BD-PSCs细胞中，放入生物层粘连蛋白包被的四孔板中，并将板在37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中孵育五天。为了支持内胚层分化，在KSR DMSO成肝细胞培养基中培养细胞5天，每48小时更换一次培养基。在第五天，加入肝细胞成熟培养基，并在37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中再培养细胞7至10天，确保每48小时更换一次培养基。

使用计数室计数细胞，并在室温下以300 G离心BD去分化细胞悬液10分钟。除去上清液后，将BD去分化细胞重悬于KSR DMSO培养基中，浓度为6个细胞的10的两倍/毫升浓度。确保单细胞悬液后，通过将细胞通过 40 微米细胞过滤器来去除任何额外的碎片。

同样，使用计数室对细胞进行计数，并准备足够体积的每个细胞接种密度以分配每个孔所需的体积。准备一个梯度，顶部接种100万个细胞至4， 000个细胞的低接种密度。接下来，在 96 孔低附着板中分配 100 微升 KSR DMSO 培养基，并加入 100 微升细胞接种稀释液。

将低附着板孵育五天。在接种后的第三天或第四天，当球体足够致密时，更换50%的培养基。在第五天，将培养基更换为肝细胞成熟培养基，并在其中再培养7至10天，每48小时更换一次培养基。

使用前面描述的分化方法将细胞培养4、8、15和24天后，除去培养基。在PBS中用含有4%多聚甲醛的预热固定剂孵育细胞10分钟。接下来，丢弃固定剂并用PBS洗涤细胞两次，每次五分钟。

立即加入0.1%Triton X-100溶液，并在两次PBS洗涤前使细胞透化五分钟。加入由PBS和5%牛血清白蛋白或BSA制成的封闭溶液，然后将细胞在室温下放在摇板上一小时。在稀释缓冲液1%BSA PBS中稀释一抗，每孔加入50微升抗体稀释液。

在室温下孵育一小时后丢弃抗体溶液，并使用PBS进行三次洗涤，每次五分钟。在每个孔中加入50微升稀释在稀释缓冲液中的二抗，并将细胞在室温下孵育30分钟。用PBS洗涤细胞三次五分钟后，用含有DAPI的封片剂安装盖玻片进行显微镜分析。

小心丢弃培养基而不接触球状体，并加入含有0.1%Triton X-100溶液的新鲜制备的PBS，孵育五分钟以透化细胞。通过缓慢移液培养基，用培养基洗涤球体两次。接下来，将球状体与 50 微升一抗孵育一小时。

完成后，小心地去除多余的抗体溶液并洗涤培养基三次。在含有1%BSA的PBS中制备相应的二抗，如山羊抗小鼠IgG Cy3，山羊抗小鼠IgG 488和兔抗鸡IgG Texas Red，并在二氧化碳培养箱中孵育20分钟之前每孔加入50微升抗体稀释液。再次，在培养箱中孵育30分钟之前用培养基洗涤三次。

使用前 10 分钟打开荧光光源。打开计算机并打开成像软件。使用4X放大镜，方法是单击工具栏中的4X按钮选择正确的比例尺。

然后将96孔板放在载物台中心板上。打开LED光源，使用明场滤光片，并使用XY轴载物台调节旋钮将板定位到感兴趣的孔中。切换到相机光路并单击成像软件中的实时按钮以在屏幕上可视化图像。

确保使用 XY 轴旋钮将球体居中，并使用粗调或细调控旋钮进行聚焦。接下来，在工具栏中选择明场观察方法，将曝光设置设置为自动，然后单击相机控制面板中的快照按钮拍照。然后使用感兴趣的文件夹中的相应名称将图片另存为 vsi 文件。

放置环境光屏蔽板以关闭LED灯并更换滤光片以进行B激发。然后选择488观察方法。打开快门，单击快照按钮拍照，然后关闭快门并将文件另存为 vsi。

用G激发过滤器重复该过程，以重复每个感兴趣的井的过程。肝脏分化过程中的形态变化表明，BD-PSCs分化为肝细胞经历了3个阶段。第一阶段代表分化为内胚层细胞。

第二次分化为表现出典型多边形形态的肝祖细胞。第三，肝细胞的成熟。免疫荧光分析显示，在L4至L8天肝分化过程的第一阶段，内胚层人肝祖标志物如甲胎蛋白或APF和转甲状腺素蛋白或TTR在细胞中强烈表达。

然而，它们的表达在L15天下降。白蛋白或ALB和肝细胞核因子4α或HNF4α的表达首先出现在L4处，在整个分化时间L4至L15期间升高，在成熟时间L15至L24期间达到强而稳定的表达。在含有肝细胞诱导或成熟培养基启动的球状体形成的低附着板中观察到细胞的自发聚集。

在类固醇球体和可变数量的细胞之间观察到一致的相关性。球状体在L14处形成和分化，并用抗体活染色，揭示了BD-PSCs衍生球状体的潜在肝功能活性。制备用于重编程的单核细胞是该过程中最重要的步骤。

生成人肝球体是在体外创建器官的第一步 3D 简化版器官，其微观解剖结构与体内相似。在实验室中创建的类器官用于研究器官发生、疾病发展和营养物质。