Automatisierte Datenerfassungssoftware ist äußerst notwendig, um große Mengen an Kryodaten für die strukturelle Charakterisierung biologischer Makromoleküle zu sammeln. Automatisierte DatenerfassungSsoftware wurde hier verwendet, um die Struktur verschiedener biologischer Makromoleküle zu charakterisieren, die direkt mit der Pathogenbiologie in Verbindung stehen. Zum Beispiel Mykobakterien, HIV und SASCO 2.
Starten Sie zunächst die Latitude-S Automated Data Acquisition Software, indem Sie im Startmenü auf DigitalMicrograph klicken. Wählen Sie als Nächstes den Technique Manager und dann das Latitude-S-Symbol für Single-Particle Automated Data Collection aus. Um eine Sitzung basierend auf den vorherigen Sitzungseinstellungen zu erstellen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Basierend auf vorheriger Sitzung in der Palette und wählen Sie dann die neue Schaltfläche aus, oder um eine vorhandene Sitzung fortzusetzen, drücken Sie die Schaltfläche Weiter.
Um eine völlig neue Sitzung zu starten, klicken Sie auf die neue Registerkarte in der Palette. Wählen Sie den Ordner aus, der die Fortsetzung der Sitzung enthält, und wählen Sie den Ordner aus, in dem die Daten gespeichert werden sollen. Klicken Sie anschließend auf das Einstellungssymbol und fügen Sie im angezeigten Feld zum Erkunden des verwalteten Status den Status hinzu, legen Sie die TEM-Bedingung, die Kamerabedingung und die Bild- oder Stock-Option fest.
Benennen Sie dann den Status, oder öffnen Sie die Status-Setup-Zusammenfassung, um die Speichereinstellungen zu öffnen. Konfigurieren Sie als Nächstes den Atlas-Status, indem Sie auf die Atlas-Statuspalette klicken und die Parameter für Vergrößerung, Beleuchtungsbedingungen und Kamerabelichtungszeit einstellen und auf weiter klicken, um zum nächsten Status zu wechseln. Konfigurieren Sie dann den Rasterzustand, indem Sie auf die Rasterzustandspalette klicken, die Parameter für die Optik der Mikroskopbildgebung, die Beleuchtungsbedingungen und die Belichtungszeit der Kamera festlegen und auf Weiter klicken.
Konfigurieren Sie den Bohrungszustand, indem Sie auf die Bohrungspalette klicken und die Parameter bildgebende Optik, Beleuchtungsbedingungen, Binning und Kamerabelichtungszeit einstellen. Nachdem Sie auf Weiter geklickt haben, konfigurieren Sie den nächsten Fokuszustand, indem Sie auf die Fokuspalette klicken und die Mikroskopeinstellungen für bildgebende Optik, Beleuchtungsbedingungen, Binning und Kamerabelichtungszeit einstellen. Konzentriere dich dann auf den amorphen Kohlenstoffbereich in der Nähe des Lochs und klicke auf weiter, um zum nächsten Zustand zu gelangen.
Konfigurieren Sie den Datenzustand, indem Sie auf die Datenpalette klicken und die Parameter für die Mikroskopeinstellungen festlegen und dann auf Weiter klicken. Klicken Sie auf die Fokuskonfigurationspalette, die den Bereich der Defokuswerte und die Schrittgröße in der angegebenen Registerkarte angibt, und drücken Sie die Schaltfläche Weiter, um zum nächsten Schritt überzugehen. Konzentrieren Sie sich auf die erforderlichen Funktionen im Raster und klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche.
Positionieren Sie dann die rote Kreuzmarkierung auf demselben Merkmal auf jedem Bild verschiedener Zustände. Beginnen Sie mit den Zuständen "Fokus", "Daten" und "Loch", da das Sichtfeld größer ist als die Zustände "Atlas" und "Raster". Zoomen Sie als Nächstes auf atlas- und grid-Status, um die rote Kreuzmarkierung auf demselben Feature zu positionieren.
Um die Positionen und den Offset zwischen jedem der fünf verschiedenen Zustände zu berechnen und die Positionen und Offsets im Ausgabefenster widerzuspiegeln, klicken Sie auf die Schaltfläche Berechnen. Klicken Sie auf Erfassungspalette und wählen Sie die Größe des Atlas aus, um das gesamte Raster oder einen Teil des Rasters basierend auf der Anforderung abzudecken. Um den Atlas zu erfassen, navigieren Sie auf dem Atlas und wählen Sie das Gitterquadrat basierend auf der Eisdicke aus.
Sobald die gewünschten Rasterquadrate ausgewählt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitplan und beobachten Sie, wie sich die Kacheln im Rasterquadrat füllen, während jedes Rasterquadrat erfasst wird. Nachdem Sie auf die Schaltfläche Zeitplan geklickt haben, wählen Sie eine repräsentative Bohrung im Rasterquadrat aus, indem Sie die Position der Bohrung hinzufügen. Sobald das Lochbild erfasst ist, definieren Sie die Daten und Fokuspositionen und speichern Sie das Layout als Vorlage.
Klicken Sie auf Automatische Suche, geben Sie die Lochgröße ein und klicken Sie im Programm auf die Schaltfläche "Suchen", um die Löcher basierend auf dem Durchmesser automatisch zu finden. Richten Sie die Intensität ein, um die Löcher aus dem Gitterquadrat und die Eiskontamination zu entfernen. Und nachdem Sie die ausgewählten und gelben Markierungswerkzeuge über die automatische Suche hinzugefügt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitplan in Latitude-Aufgaben.
Gemäß dem anfänglichen manuellen Screening von bewegungskorrigierten Mikroaufnahmen mit der cisTEM-Software wurde festgestellt, dass die meisten Daten innerhalb des gewünschten Signalbereichs lagen. Darüber hinaus wurden Bilder, die in Defokusbereichen gesammelt wurden, auch manuell von cisTEM überprüft. Die Spike-Partikel wurden manuell ausgewählt, um die 2D-Klassendurchschnitte für die Strukturvisualisierung zu berechnen, was stark darauf hindeutete, aber eine hochauflösende Strukturcharakterisierung war mit dem entsprechenden Datensatz möglich.
Die 3D-Klassifizierung zeigte, dass Spike Protein 1RBD in der offenen Bestätigung und alle anderen RBD in der Down-Close-Bestätigung hat. Die offenen 1RBD-Bestätigungen des Spike-Proteins wurden unter Verwendung der C1-Symmetrie rekonstruiert. Die Spike Protein-Karte wird in der seitlichen oberen und unteren Ansicht dargestellt.
Und die EM-Karte ist mit einer atomaren Struktur ausgestattet, um die Seitenketten besser zu visualisieren. Die RBD-Down-Close-Bestätigungen wurden mit C3-Symmetrie verfeinert und das Spike-3D-Verfeinerungsmodell und die EM-Karte, die wie gezeigt mit atomarer Struktur ausgestattet waren. Und die Zwischenbestätigung des Spike-Proteins, das als S2-Subdomäne identifiziert wurde, zeigte die Seitenketten einzelner Aminosäurereste an.
Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Latitude-S hochauflösende Kryo-EM-Daten von biologischen Makromolekülen sammeln kann. Diese automatisierte Datenerfassungssoftware kann mit jedem anderen Elektronenmikroskopiesystem verwendet werden, um Daten automatisch zu sammeln.
