Dieses Protokoll ist wichtig, da es die Untersuchung des glymphatischen Systems bei einem großen Säugetier ermöglicht und uns dadurch dem Verständnis des glymphatischen Systems beim Menschen näher bringt. Diese Technik hat zwei Vorteile. Die Einführung von Spuren in die Cisterna magna vermeidet eine direkte Schädigung des Gehirns, was im Gegensatz zu intraventrikulären Injektionen der Fall ist.
Zweitens ist dies ein direkter Ansatz, der es ermöglicht, die Kanülierung sofort zu visualisieren und zu wissen, ob sie erfolgreich war oder nicht. Beginnen Sie damit, das Schwein in eine Bauchlage zu bringen. Tasten Sie den Hinterkopf und den Nacken ab, um den Hinterhauptkamm, die Wirbelsäule der ersten Brustwirbel und die Basis jedes Ohres zu lokalisieren und zu markieren.
Zeichnen Sie eine gerade Linie zwischen dem Kamm und den Wirbeln entlang der Längsachse. Dann folgen Sie der Basis des Schädels und zeichnen Sie zwei Linien vom Kamm bis zur Basis jedes Ohrs. Klemmen Sie vorsichtig den Schwanz des Tieres und achten Sie auf einen Reflex, um zu sehen, ob es sich in einem tiefen Schlaf befindet.
Beginnen Sie mit einem Hautschnitt entlang der Längslinie bis zum Muskel mit einem Skalpell mit einer Klinge der Nummer 21 und strecken Sie dann zwei senkrechte Schnitte weiter entlang der Schultern aus, die jeweils 10 bis 15 Zentimeter lang sind. Ausgehend vom Okzipitalkamm, machen Sie dermale Einschnitte entlang der Linie bis zur Basis jedes Ohres. Verwenden Sie eine anatomische Pinzette, um die am Hinterhauptkamm gebildeten Hautecken zu greifen, und führen Sie dann die Skalpellklinge leicht über die Faszie, um die Haut vom darunter liegenden Muskel zu trennen.
Resezieren Sie die Haut entlang jedes der fünf Schnitte, um Teile des Trapezmuskels zu visualisieren. Verwenden Sie das Skalpell, um einen etwa einen Zentimeter tiefen Längsschnitt zu machen, bei dem der Trapezius an der Mittellinie zusammenkommt, und führen Sie dann eine stumpfe Dissektion entlang des Längsschnitts in den Muskeln mit einer Kombination aus gerader und gekrümmter chirurgischer Pinzette durch, die die Bäuche des Trapezius und den darunter liegenden Musculus semispinalis capitis biventer trennt. Trennen Sie alle verbleibenden Muskelfasern mit einem Skalpell und führen Sie die stumpfe Dissektion durch, bis die Semispinalis capitis complexus sichtbar wird.
Bewegen Sie sich entlang des hinteren Aspekts des Schädels und trennen Sie die Ursprünge der Musculi trapezius und semispinalis capitis biventer. Um die beiden Muskeln längs zu trennen, verwenden Sie die chirurgische Pinzette, um eine stumpfe Dissektion durchzuführen, bis der Semispinalis capitis complexus vollständig sichtbar ist. Verwenden Sie dann die selbsthaltenden Retraktoren, um die Musculi trapezius und semispinalis capitis biventer zurückzuziehen.
Verwenden Sie das Skalpell, um einen Zentimeter tiefen Längsschnitt zu machen, bei dem die Bäuche der Semispinalis capitis complexus an der Mittellinie zusammenkommen. Führen Sie eine stumpfe Dissektion mit einer chirurgischen Pinzette durch, die entlang des Längsschnitts zwischen den Muskelbäuchen arbeitet, bis sowohl der Atlas als auch die Achse tastbar sind. Bewegen Sie sich entlang des hinteren Aspekts des Schädels und trennen Sie die Ursprünge der Semispinalis capitis complexus Muskeln.
Verwenden Sie das Skalpell und die stumpfe Dissektion, um den Muskel längs von den darunter liegenden Wirbeln zu trennen, und verwenden Sie dann einen weiteren Satz selbsterhaltender Retraktoren, um die Muskeln semispinalis capitis complexus zurückzuziehen. Verwenden Sie ein Skalpell, um vorsichtig das verbleibende Gewebe zu entfernen, das über der Region liegt, in der der Atlas auf die Schädelbasis trifft. Legen Sie einen Arm auf den Hals des Tieres und einen Finger an der Schnittstelle des Atlas und des Schädels, heben Sie dann gleichzeitig den Kopf an und beugen Sie den Hals, während Sie mit dem Finger tasten, um die Cisterna magna zu enthüllen.
Stellen Sie sicher, dass eine Person den Kopf und den Hals des Tieres anhebt und beugt, während die andere Person für die Cisterna magna palpiert und sich ihre anatomische Lage notiert. Führen Sie eine 22-Gauge-Kanüle langsam und vorsichtig durch die Dura in einem Winkel schräg zur Längsachse in die Cisterna magna ein, ziehen Sie dann die Nadel aus der Kanüle zurück und setzen Sie eine Kappe auf das Schloss. Beginnen Sie mit dem Auftragen von Sekundenkleber und einem Beschleuniger, wo die Kanüle in das Gewebe gelangt, und tragen Sie dann den Zahnzement auf.
Warten Sie fünf Minuten, bis der Zement ausgehärtet ist. Entfernen Sie die Kappe vorsichtig von der Kanüle. Befestigen Sie die Kanüle mit einer 10 Zentimeter langen Verlängerung am männlichen Ende des IV-Line-Taps mit dem Tracer.
Injizieren Sie den Tracer langsam mit einer Geschwindigkeit von 100 Mikrolitern pro Minute entweder von Hand oder mit einer Mikroinfusionspumpe. Entfernen Sie den IV-Line-Tap und ersetzen Sie ihn durch die Kappe. Überprüfen Sie, ob der Tracer an der Basis der Kanüle pulsiert.
Legen Sie dann Sandsäcke unter den Hals des Tieres, um eine gewisse Beugung zu erhalten. Lassen Sie den Kopf los und lassen Sie das Tier in einer ruhenden Bauchlage. Lösen Sie die selbsthaltenden Retraktoren und ersetzen Sie die Muskeln.
Verwenden Sie die chirurgischen Handtuchklemmen, um die Haut über die Muskeln zusammenzubringen. Verwenden Sie zuerst Gaze und dann eine Decke, um die Handtuchklemmen und den Schnitt abzudecken, um den Wärmeverlust zu begrenzen. Lassen Sie den Tracer für die gewünschte Zeit zirkulieren.
Zusammengefügte makroskopische Bilder der dorsalen Oberfläche des Gehirns können detaillierte Einblicke in die Verteilungsmuster des Tracers über die Sulci und Fissuren liefern. Ähnliche Bilder von den ventralen und lateralen Oberflächen des Gehirns können Aufschluss über die Tracerverteilung im Temporallappen und in der lateralen Fissur geben. Bilder der Gehirnoberfläche mit höherer Vergrößerung, die mit einem Stereoskop erzeugt werden, können helfen, den Tracer im PVS entlang der Arterien zu visualisieren.
Makroskopische koronale Hirnschnitte geben Einblick in die Tiefe der Tracer-Penetration in der interhemisphärischen Fissur und subkortikalen Tracerverteilung und -struktur, wie dem Hippocampus und dem Striatum. Immunhistochemische Färbung für AQP4, Gliafibrillär saures Protein und Glattmuskel-Aktin zeigten, dass der Tracer im PVS lokalisiert war und sich in das Hirnparenchym bewegte. Astrozytenfußprozesse, die die äußere Oberfläche des PVS bilden, werden mittels AQP4 und Gliafibrillensäureproteinfärbung identifiziert.
Die Endothelzellen, die die innere Oberfläche des PVS bilden, werden mit Lektin und GLUT-1-Färbung gefärbt. Die SMA-Färbung identifiziert Arterien und Arteriolen und kann verwendet werden, um zu zeigen, dass der PVS-Zustrom entlang der Arterien statt der Venen auftritt, was die grundlegende Physiologie der normalen glymphatischen Funktion darstellt. In Zukunft hoffen wir, das glymphatische System mit hoher Auflösung bei großen Säugetieren im Kontext der Neuropathologie wie Schlaganfall und schädel-hirn-traumatische Verletzung zu erforschen.
