Dieses Protokoll bietet eine neue Methode für eine alte Technik und wird einen neuen Ansatz für eine große Anzahl von Grundlagenforschern bieten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind ihre kosteneffektive Natur sowie ihre Anpassungsfähigkeit, die von einem breiteren wissenschaftlichen Publikum genutzt werden kann. Um eine Migrationsplatte vorzubereiten, verwenden Sie einen hell farbigen permanenten Marker, um eine Linie in der Mitte der Rückseite jedes Brunnens einer 48-Well-Platte zu zeichnen und drei Hash-Markierungen zu zeichnen, um jeden Brunnen in drei separate Interessenbereiche zu teilen.
Dann Platte 1,5 bis zweimal 10 bis zum vierten Einzelnen Durchgang Herzfibroblasten in jeden Brunnen und Kultur die Zellen unter normalen Kulturbedingungen für 24 bis 48 Stunden, bis sie 90 bis 95% Konfluenz erreichen. Wenn die Zellen bereit sind, entfernen Sie den Überstand aus jedem Brunnen und verwenden Sie eine sterile P200 Pipettenspitze, um einen One-Pass-Scratch entlang der gezeichneten Linien zu machen. Spülen Sie die Brunnen mit niedrigem Serummedium, um alle nicht angeschlossenen Herz-Fibroblasten zu entfernen und fügen Sie 500 Mikroliter niedriges Serummedium zu jedem Brunnen hinzu.
Wenn pharmakologische Mittel verwendet werden, fügen Sie die Mittel in die entsprechenden Brunnen. Verwenden Sie als Nächstes ein invertiertes Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv, um zwei Null-Stunden-Bilder pro Brunnen mit den Markierungen zu erfassen, um jeden Brunnen zu positionieren, um die Abbildung der oberen Hälfte der zerkratzten Linie zu ermöglichen. Bewegen Sie dann die Platte, um die untere Hälfte der zerkratzten Linie in die Ansicht zu positionieren, um das zweite Bild zu sammeln, und legen Sie die Platte 24 Stunden lang im Zellkultur-Inkubator.
Am Ende der Inkubation jeden Brunnen mit nicht-sterilen PVS waschen und 500 Mikroliter 4%Paraformaldehyd in einer Dunstabzugshaube hinzufügen. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur jeden Brunnen dreimal in frischem PBS für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche die Zellen mit 300 Mikrolitern permeabilisierender Lösung pro Brunnen und sanftem Schaukeln 30 Minuten bei Raumtemperatur durchdringen.
Am Ende der Inkubation, ersetzen Sie die permeabilizing Lösung mit 1%Kumasi brillanten blauen Fleck für eine 10-minütige Inkubation mit sanftem Schaukeln bei Raumtemperatur. Gefolgt von drei, fünf minütigen Wärten in PBS mit Schaukeln. Nach der letzten Wäsche 300 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte vorsichtig in der gleichen Position wie für das Null-Stunden-Bild positionieren, bevor Sie zwei 24-Stunden-Bilder pro Brunnen aufnehmen.
Öffnen Sie am Ende des Experiments die Bilder und ein entsprechendes Imaging-Analyse-Softwareprogramm, und erstellen Sie eine neue Ebene auf dem Null-Stunden-Bild. Doppelklicken Sie, um den Namen des neuen Layer-Layers zu ändern, und wählen Sie das Pinselwerkzeug aus. Ändern Sie die Pixelgröße auf 10 und die Farbe auf Rot, und zeichnen Sie zwei separate Linien, um den Scratch zu umreißen.
Die Linien sollten keine Zellen berühren. Öffnen Sie das 24-Stunden-Bild in der Bildverarbeitungssoftware, und wählen Sie das Werkzeug verschieben aus. Halten Sie die Steuerelementschaltfläche gedrückt, klicken Sie sowohl auf die Linien als auch auf die Hintergrundebenen, klicken Sie in die Mitte des Null-Stunden-Bildes und ziehen Sie beide Ebenen in die Mitte des 24-Stunden-Bildes.
Klicken Sie im 24-Stunden-Bild auf die Null-Stunden-Hintergrundebene, und ändern Sie die Deckkraft auf 50 %Halten der Steuerelementschaltfläche, klicken Sie auf die Null-Stunden-Hintergrund- und Linien-Layer, und klicken Sie auf Bearbeiten und freie Transformation, um die Ebenen frei zu transformieren. Wenn der Linien-Layer erfolgreich überlagert wurde, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um den Null-Stunden-Hintergrund-Layer zu löschen. Der verbleibende Linien-Layer kann verwendet werden, um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, die über 24 Stunden in den Scratch-Bereich migriert wurden.
Speichern Sie dann das neue Migrationsbild sowohl als Photoshop als auch als TIFF- oder JPEG-Datei. Um die Anzahl der migrierenden Zellen zu quantifizieren, öffnen Sie das Migrationsbild und ein Programm, das TIFF- oder JPEG-Dateien akzeptiert, und zählen Sie manuell die Anzahl der Zellen dazwischen, und berühren Sie die beiden roten Linien für beide Bilder für jeden Brunnen. Notieren Sie dann die Anzahl der migrierenden Zellen pro Bild.
Um den Migrationsbereich zu bestimmen, öffnen Sie das 24-Stunden-Bild, das die Migrationslinien in der Imaging-Software enthält, und speichern Sie das Bild als Migrationsbereichsbild. Klicken Sie nach dem Speichern auf die Hintergrundebene, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um den Layer zu löschen. Verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um den Bereich zwischen den Scratch-Linien mit der gleichen Farbe auszufüllen, die für die Linien verwendet wurde, und klicken Sie auf Bild, Modus und Graustufen, um das Bild in Schwarzweiß zu ändern.
Speichern Sie das Bild und öffnen Sie das Migrationsbereichsbild und ein entsprechendes Bildanalyse-Softwareprogramm. Klicken Sie auf Bearbeiten, und invertieren Sie. Um den Bereich der Migrationslinie zu bestimmen, klicken Sie auf Bild, Anpassen und Schwellenwert.
Der schwarze Migrationsbereich wird rot, und der Prozentbereich wird im Schwellenwertfeld angezeigt. Notieren Sie dann den Prozentbereich für die Migrationslinie, und bestätigen Sie, dass dieser Wert mit der Anzahl der migrierenden Zellen für dasselbe Bild gekoppelt ist. In dieser Analyse wanderten 46 Fibroblasten aus nicht-diabetischen Herzen und 129 Fibroblasten aus diabetischen Herzen während des 24-stündigen experimentellen Zeitraums aus.
Die Messung des Migrationsbereichs ergab, dass die nicht-diabetische Kratzfläche 24,78 % der gesamten gemessenen Fläche ausmachte, während die diabetische Migrations-Kratzfläche 16,77 % der gemessenen Gesamtfläche ausmachte. Die Normalisierung auf den Bereich der Migration ermöglicht eine bessere und strengere Bewertung der Zellmigration und negiert potenzielle menschliche Fehler. Wenn z. B. nur die Anzahl der migrierten Fibroblasten verglichen wird, wird in dieser Analyse angezeigt, dass die Anzahl der Zellen, die in diesem Brunnen migriert wurden, doppelt so hoch war wie die der migrierten Zellen im zweiten Brunnen.
Wenn jedoch der Bereich des Kratzers zur Normalisierung der Daten verwendet wurde, wurde beobachtet, dass das Verhältnis der Fibroblasten zum Migrationsbereich in beiden Brunnen nahezu gleich war. Achten Sie darauf, den Migrationsbereich im 24-Stunden-Bild wieder zu erfassen, wie Sie im Null-Stunden-Bild aufgenommen haben. Nach diesem Verfahren kann die Immunhistochemie durchgeführt werden, um die Proteinexpression in den Zellen zu untersuchen.
Wir glauben, dass dieser neuere Ansatz für den Studienass zur Scratch-Migration es ermöglichen wird, mehr Wege der wissenschaftlichen Forschung zu eröffnen, die bisher nicht verfügbar waren.
