Die Autoren bedanken sich bei Amanda Struckhoff für die erste Hilfe mit dem Experiment zu danken. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus NIH 5RO1CA115706 unterstützt.

1. Vorbereitung der Platte mit Kollagen beschichtet <ol><li> Verdünnte Kollagen zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml in Opti-MEM Medium. </li><li> Coat 6 Well-Platten mit Kollagen, durch Zugabe von 1,5 ml aus Schritt 1 in jede Vertiefung. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C </li><li> Am folgenden Tag, waschen Sie die Platte 2-mal mit 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) und speichern sie in PBS. </li></ol> 2. Zellpräparation und Seeding auf einer 6-Well-Platte Hinweis: Verwenden Sie warmes Medien und PBS, um optimale Bedingungen für die Bewegung der Zellen zu gewährleisten <ol><li> Wachsen MDA-MB-231 (ein invasiver Brustkrebs-Zelllinie) dünn in Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). In diesem Beispiel verwenden wir den MDA-MB-231, jedoch kann diese Methode auf alle Anhänger Krebs und nicht-bösartige Zelllinien eingesetzt werden. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit warmem 1x PBS und sammeln durch Trypsinierung. Überprüfen Zellen unter einem Mikroskop zu machen suerneut, dass die Zellen richtig durch Trypsin-Behandlung abgelöst. </li><li> Sammeln der Zellen durch Zugabe von DMEM-Medium mit 10% FBS, sanft drehen sich die Zellen bei 1000 g für 5 Minuten. Das Zellpellet vorsichtig in DMEM-Medium mit 10% FBS. </li><li> Brechen Sie das Zellpellet durch Auf-und Abpipettieren sanft. Es ist wichtig zu brechen Zellcluster in einzelne Zellen so weit wie möglich. </li><li> Zählen der Zellen und mit Wasser auf eine Endkonzentration von 50.000 Zellen / ml in DMEM-Medium mit 10% FBS. Dispense 2 ml in jede Vertiefung. </li><li> Anschließend wird die Platte bei 37 ° C in einem Gewebekultur-Inkubator über Nacht bis zum Start der Zeitraffer-Mikroskopie. </li><li> Um ausreichend Platz für die Migration zu gewährleisten, erstellen Sie eine Wunde mit Hilfe einer Pipettenspitze, waschen Sie die Platte mit 1X PBS, um Ablagerungen (gebildet als Folge der Wunde) entfernen und hinzufügen DMEM mit 10% FBS. Prüfen Sie unter dem Mikroskop für schwimmende Zellen. Wenn eine große Anzahl von Zellen schwimmenden sind, wiederholen Sie den Waschvorgang. Nun ist die Platte fertig zu sein, das Setup aufMikroskop für die Bildaufnahme. </li></ol> 3. Mikroskop-Setup und Automated Image Acquisition Es gibt mehrere Imaging-Software-Pakete, die das Mikroskop für die automatisierte Bildaufnahme. Hier verwenden wir Slidebook 5,0 Imaging-Software und automatische Übernahmen sind auf einem Olympus-Mikroskop (Olympus IX81), gekoppelt an ein EM-Hamamatsu C9100-Kamera, das ist ausgezeichnet für Live-Cell-Anwendungen, bei denen Schnelligkeit des Erwerbs und der minimale Phototoxizität ist von größter Bedeutung durchgeführt. Das System beinhaltet eine Bühne oben Umweltkontrolle Kammer (Neue Live Cell) und eine automatische XY-Steuerung (Vor Proscan). Die Bilder werden mit einem 10X UPLANFL Ph1/0.30 Ziel, in Hellfeld-Modus, mit einem definierten Zeitintervall erworben. Das folgende Protokoll beschreibt die Bildaufnahme. <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, Kamera und Live Cell Imaging Apparatur. Positionieren Sie die Platte über die mikroskopische Bühne. Die Platte von der Neuen Live Cell ENVIronmental Steuerkammer, die mit einem CO 2-Versorgung und Temperatursensoren angeschlossen ist. Stellen Sie den Thermostat auf 37 ° C und CO 2 bei 5%. </li><li> SlideBook Software ermöglicht vollautomatische objektive Auswahl, Auswahl der Wellenlänge und einfaches Umschalten zwischen Fluoreszenz-und Hellfeld-Techniken. Um die Einrichtung verschiedener Parameter der Fokus-Steuerung, offene SlideBook Software&gt; in der Menüleiste&gt; select Fokus Kontrolle zu gehen, indem Sie auf&gt; <img alt="Abbildung 0 Taste 1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn1.jpg" /> und wählen Sie folgende Parameter: <ol><li> In der &quot;Ziel-Feld&quot; definieren das Ziel durch Auswahl aus Drop-Down-Fenster. Beachten Sie, dass wir mit einer Phase objektiv und haben manuell die entsprechende Phase-Ring im Kondensator ausgewählt. Wenn Sie ein System mit einem automatisierten Kondensator, wird dies automatisch durch die Software eingestellt werden. Alternativ, wenn weder Objektivrevolver noch Kondensator geregelt werden, sollten diese jeweils manuell ausgewählt werdenly. </li><li> In der &quot;Filter-Set&quot;-Box: <ol><li> Wählen Sie Einstellungen, um den Lichtweg entweder das Okular oder die Kamera aus dem Dropdown-Feld zu lenken, um verfügbare Filter (&quot;Live&quot; für Okular, &quot;Weitfeld&quot; für Kamera in unserem System) zu sehen. </li><li> Wählen Sie den passenden Filter für Hellfeldbeleuchtung (in unserer Einrichtung, ist diese Option mit der Bezeichnung &quot;DIC&quot;, die eine offene Position für das Hellfeld Lichtweg darstellt). </li><li> Wählen Sie die Lichtquelle durch einen Klick auf &quot;Open Hell&quot;, um die Hellfeld-Verschluss zu öffnen. </li></ol></li></ol></li><li> Wenn Sie das Beispiel unter dem Okular anzuzeigen, wählen Sie die Hellfeld-Filter (Position &quot;6&quot; in unserem System) auf dem Turm. Nach anfänglich Betrachten der Probe durch das Okular zu entsprechenden Felder zu finden und bringen die Probe in den Fokus (Schritte 3.2.1 bis 3.2.2.3). Bewegen Sie den Filter Revolver, um den Lichtweg an der Kamera ändern für die Bilderfassung (Position &quot;1&quot; in unserem System). </li><li> Die automatisierte Bühne ermöglicht die Auswahl von verschiedenen XY-Koordinates, um mehrere Felder von Interesse während der Bildaufnahme zu erfassen. In SlideBook Software, um den Fokus Kontrolle gehen, wählen Sie &quot;XY&quot;, wählen Sie verschiedene Positionen obwohl das Okular, klicken Sie dann auf &quot;set point&quot; Schloss an jedem Standort für die Bilderfassung (Abbildung 1). </li><li> Feinabstimmung der Fokus der Kamera Bild auf dem Bildschirm angezeigt wird. Dies kann entweder unter Verwendung der manuellen Kontrollen auf dem Mikroskop oder den Computer steuert, die den Fokus in viel kleineren Schritten anpassen können erreicht werden. </li><li> Verwenden Sie die Steuerelemente im &quot;Focus Controls&quot;-Fenster, stellen Sie die z-Position der Bühne. Für beste Ergebnisse, auf flachen zellulären Protrusionen in der Nähe der Kontakt mit der Platte zu konzentrieren. </li><li> Um mit der Fokussierung verwenden Sie den Schieberegler, um die Belichtungszeiten einstellen, um in einem geeigneten Bereich für die Fokussierung sein zu helfen. Wenn mehrere XY-Positionen ausgewählt wurden, stellen Sie den Fokus für jede einzelne Position: Unter Fokussteuerung&gt; XY&gt; Besuch Punkt. Hinweis: Dies geschieht, um sicherzustellen, th machenauf Felder sind korrekt für eine optimale Momentaufnahme konzentriert. </li><li> Verwenden Sie die Software zum Einrichten des Capture-Fenster Parameter. In SlideBook, öffnen Sie die Gefangennahme durch die Auswahl <img alt="Abbildung 0 Taste 2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn2.jpg" /> aus der Menüleiste. Siehe Abbildung 2. Dann überprüfen wir die folgenden Parameter. <ol><li> Überprüfen Sie erfassen Typ&gt; als Zeitraffer. </li><li> Prüfen Sie Filter-Set: Breites Feld: DIC (für Hellfeld-Bild). </li><li> &quot;Zeitraffer-Capture&quot; ist die Anzahl von Zeitpunkten, die erfasst (kann variieren, abhängig vom Zelltyp) werden. Die Dauer ist die Gesamtzeit für das Experiment. Einheiten der Zeit [in Millisekunden (ms), Sekunden (s), Minuten (m) oder Stunden (h)] können aus dem Dropdown-Menü ausgewählt werden. </li><li> &quot;Intervall&quot; ist die Verzögerung zwischen dem Beginn eines Zeitpunkt und dem Beginn der nächsten Zeitpunkt. Wie Sie in zwei dieser Werte eingeben, wird die dritte Feld automatisch berechnet. </li><li> Mehrere XY-Capture: Wählen Sie &quot;MultiPunkte-Liste &quot;für mehr als 1 XY-Position. </li><li> Benennen Sie die Datei. In dem gegebenen Beispiel, haben wir es mit dem Namen &#39;231 &#39;. </li></ol></li><li> Zur Vermeidung von unerwarteten Ausfallzeiten des Computers durch mehrere Bilder geschlossen, verwenden Sie den &quot;Spool-Option&quot;, um die Datei zu speichern. Es ist optional, es wird jedoch dringend empfohlen. Zu diesem Zweck unter Capture-contro l&gt; Wählen Sie Erweitert&gt; Spool&gt; Fotografieren, um Speicher zu sparen und Spool-Datei nach jedem Zeitpunkt Punkten. Durchsuchen Sie den Speicherort, um die Folie Buchdatei (Abbildung 3) zu retten. Der erzeugte Film kann später aus der dafür vorgesehenen Stelle importiert werden. Die Schritte der Mikroskop-Setup wurde in zusammengefasst <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3585/Figure_3.1_merged.pdf" target="_blank">Datei 3,1</a> . </li></ol> 4. Bildverarbeitung und-analyse von Migration: Berechnung der Geschwindigkeit und Verschiebung In diesem Beispiel wird eine Bildverarbeitung durchgeführt, indem SlideBook 5, 6 5.0 Software. Es gibt verschiedene andere Programme, wie ImageJ 7 für die Bildverarbeitung und Analyse. <ol><li> Importieren der SlideBook Dateien von Bildern von verschiedenen Bereichen zu verschiedenen Zeitpunkten erzeugt. Gehen Sie ins Menü bar&gt; unter Bild&gt; Importieren&gt; Slide Buch Spool&gt; wählen Sie die gewünschte Datei (Abbildung 4a). </li><li> Hier ist unser Ziel, die Bewegung der einzelnen Zellen zu verfolgen. Es kann über automatisierte Tracking oder individuelle Tracking werden. Im Beispiel haben wir manuelle Tracking verwendet, da diese Entscheidung erleichtert aus Artefakten leicht, das ist viel schwieriger mit automatisierten Tracking-Systems. </li><li> Öffnen Sie die Datei SlideBook, in denen wir uns Tracking durchzuführen. Unter Menü: auswählen Maske&gt; Particle Tracking Protocol&gt; Manuelle Particle Tracking Protocol (Abb. 4b). Ein Fenster wird mit Start-und Endzeit Punkte (Abbildung 4c) erscheinen. </li><li> Begin, um die Bewegung von einzelnen Zellen durch das Anklicken der Mitte jeder Zelle (Kern) zu verfolgen. N etwa 10 Zellen aus jeder Film und mindestens drei verschiedene Filme sollten von verschiedenen Orten gewählt werden, dass etwa 30 Zellen aus einem Experiment analysiert werden. Jedes Experiment sollte dreimal wiederholt werden. Um eine unvoreingenommene Herangehensweise zuzulassen, wählen Sie Zellen, die aus unterschiedlichen Standorten wie z. B. einige Zellen aus Front-, Middle, Ecken usw. &quot;OK&quot; klicken, nachdem Tracking ist getan. </li><li> Zufällige Migration kann durch die Messung von Veränderungen in der Geschwindigkeit, Geschwindigkeit, Weg usw. Um die Daten, unter Menü&gt; select Maske&gt; Particle Tracking&gt; Particle Tracking-Protokoll analysieren analysiert werden. Wählen Sie Tracking-Parameter wie unten beschrieben: (Abbildung 5a): <ol><li> Verfolgen Sie mit - Wählen Sie den Parameter, den Sie aus der Dropdown-Liste verfolgen wollen. In diesem Beispiel haben wir genutzt, Center of Area (die Koordinaten des Mittelpunktes des ObProjekt). </li><li> Klicken Sie auf &quot;zu verfolgen und weiter&quot;. Sobald Tracking abgeschlossen ist, wird dies automatisch mit dem nächsten Schritt voranzubringen. </li></ol></li><li> Wählen Sie den gewünschten Statistiken für jeden Pfad, wie Verschiebung und die durchschnittliche Geschwindigkeit (siehe Abbildung 5b): <ol><li> Durchschnittliche Geschwindigkeit - der gesamte Weg, den die Zeit benötigt, um die Strecke zurückzulegen unterteilt. </li><li> Hubraum - die Gesamtstrecke von dem Objekt gereist. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Berechnen und Fortfahren&quot;, wenn Sie mit dem nächsten Schritt voranschreiten wollen, oder wählen Sie einfach &quot;Berechnen&quot;, wenn Sie Ihre Statistiken, ohne dabei mit dem nächsten Schritt ansehen möchten. Eine Datei wird erzeugt, kann als Textdatei gespeichert werden und können später nach Excel exportiert werden. </li></ol></li><li> Um Objekte mit automatisierten Tracking-Protokoll zu verfolgen, hat zunächst eine Maske erstellt werden soll. <ol><li> Wählen Maske&gt; Segment Image&gt; ein Segment Fenster erscheint&gt; wählen, bis Schwelle erreicht wird, so dass Septemberarating ein Objekt von anderen&gt; klicken Sie auf Übernehmen&gt; OK (siehe Abbildung 5c). Schritt 4.5.1 die gleiche ist. </li><li> Entfernen Sie Objekte, die kleiner als - Markieren Sie dieses Kästchen, um selektiv zu entfernen, Objekte, die kleiner als eine gegebene Größe. Geben Sie die Größe in das Eingabefeld ein und wählen Sie entweder um oder Pixel als Einheit. Diese wird verwendet, um Artefakte häufig durch Ablagerungen zu beseitigen. </li><li> Minimale Bewegung - geben Sie die minimale Anzahl von Zeitpunkten, die verfolgt, um einen Pfad zu ermitteln muss. </li><li> Maximale Bewegung - Geben Sie die maximale Bewegung, die Sie von jedem beliebigen Objekt von einem Zeitpunkt zum nächsten erwarten. </li><li> Schritte, um die Daten zu analysieren sind die gleichen wie manuelle Tracking (siehe die Schritte 4.5.2 bis 4.6.2). </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine ungerichtete Migration Analyse in Bezug auf Geschwindigkeit und Weg (6) quantifiziert. Nach dem Exportieren Sie die Datei to Excel werden Daten aufgezeichnet mit einer Box und Whisker Plot. Die statistische Analyse vergleicht insgesamt Verschiebung und die durchschnittliche Geschwindigkeit zwischen Versuchs-und Kontrollgruppe erfolgt mit Mann-Whitney-Test. Die Testprobe zeigt eine Zunahme der durchschnittlichen Geschwindigkeit im Vergleich zur Kontrolle. Die Probe zeigt einen Anstieg der gesamten Verschiebung als im Vergleich zur Kontrolle. Film von Kontroll-und Test: Control MDA-MB-231 Test-und MDA-MB-231 Zellen wurden auf Kollagen ausgesät über Nacht. Zeitraffer-Video-Mikroskopie wurde von Olympus-Mikroskop durchgeführt, der mit einem EM-Hamamatsu Kamera. Die Bilder werden in einem Intervall von 1 Stunde für insgesamt 18 Stunden während der ungerichtete Migration übernommen. Bitte sehen Sie Film 1 und Film 2 von zufälligen Migration für Steuerungs-und Testproben. Mikroskop-Setup: <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig1.jpg" /> Abbildung 1. Einrichten mehrerer Punkte für Bild<html> zu erfassen. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schritte darstellen Capture-Steuertabellen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3585/3585fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig3.jpg" /> Abbildung 3. So speichern Sie mehrere Bilder. dflinebreak &quot;&gt; Bildverarbeitung und-analyse der Migration. <img alt="Abbildung 4a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4a.jpg" /> Abbildung 4a. Schritte zum Bild für die Datenanalyse zu importieren. <img alt="Abbildung 4b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4b.jpg" /> Abbildung 4b. Schritte zum Daten mit Partikel-Tracking-Protokoll zu analysieren. <img alt = &quot;Abbildung 4c&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3585/3585fig4c.jpg&quot; /&gt; Abbildung 4c. Fenster darstellen Weglänge von Kettenfahrzeugen Partikel. Die Schritte der Datenanalyse. <img alt="Abbildung 5a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5a.jpg" /> Abbildung 5a. Schritte darstellen Parameter der Partikel-Tracking-Protokoll. <img alt="Abbildung 5b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5b.jpg" /> 5b. Auswahl der Pfad Statistiken zu analysieren. <img alt="Abbildung 5c" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5c.jpg" /> 5c. Schritte zur Maske für die automatisierte Tracking-Protokoll zu erstellen. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig6.jpg" /> Abbildung 6. Durchschnittliche Geschwindigkeit (Abbildung6a) und Verschiebung (6b) in einer Whiskers-Plot aufgetragen. Die Probe zeigt eine Zunahme der Geschwindigkeit und der Verschiebung als zu vergleichen, um zu kontrollieren. Kino Movie 1. Migration von Kontrollzellen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3585/3585movie1.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um das Video anzusehen</a> . Movie 2. Migration von Testzellen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3585/3585movie2.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um das Video anzusehen</a> . Control-MDA-MB-231 Test-und MDA-MB-231 Zellen wurden dünn auf Kollagen für Nacht ausgesät. Zeitraffer-Video-Mikroskopie wurde von Olympus-Mikroskop durchgeführt, der mit einem EM-Hamamatsu Kamera. Die Bilder werden in einem Intervall von 1 Stunde für 18 Stunden während der ungerichtete Migration übernommen. Bitte beachten Sie die Filme von zufälligen Migration zur Steuerung und Test.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Echtzeit ungerichtete Migration Assay ermöglicht die präzise, ​​sensibel, Analyse der Zellmigration Parameter wie Geschwindigkeit und Auslenkung. Diese Methode beschränkt sich nicht Punkt Messwert zu beenden, daher ist es mehr quantitativ. Da die Zellen in DMEM-Medium mit normalem Serum überwacht, senkt die schädliche Wirkung von längerer Inkubation in serumfreiem Medium. Es hat sich gezeigt, dass die Migration von Zellen auf die Formatierung und Brechungszelle Kontakte mit dem Substrat 8, so kann diese Methode verwendet werden, um Wirkung verschiedener Substrate über die Migration zu untersuchen abhängt. Einer der kritischen Schritte beinhaltet ordnungsgemäße Kontrolle der Temperatur auf 37 ° C und CO 2 bei 5%, um eine optimale Migration sicherzustellen. Der Assay erlaubt Flexibilität, um wandernde Antworten auf gewünschten Zeitpunkten zu überwachen, doch, so kann sie eine Optimierung der Anzahl von Zeitpunkten. Zum Beispiel können einige Zellen mit niedrigeren Migrationsraten müssen für eine lo überwacht werdennger als Zeit, um Zellen mit höheren Preisen im Vergleich Migration. Die Mikroumgebung des Tumors ist einer der entscheidenden Faktoren bei der Krebsentstehung. Cancer Ergebnisse aus der Wechselwirkung von Tumorzellen mit den umgebenden Zellen wie Endothelzellen, Stromazellen und Entzündungszellen 9. Dieser Assay kann modifiziert werden, um zu untersuchen, wie die Migration von Tumorzellen durch die Mikroumgebung beeinflusst werden. Einer der Wege, auf denen dies erreicht werden kann, ist das Studium der Migration von fluoreszierend markierten Tumorzellen in einer gemischten Population von verschiedenen Zellen, wie Stoma und Endothelzellen wachsen. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um die Wundheilung in Echtzeit zu untersuchen. Zeitraffer-Mikroskopie konnten modifiziert, um Zell-Invasion, die Zellteilung, Apoptose und lamellipodialen Dynamik und Dynamik fokaler Adhäsionen mit Linsen mit höherer Auflösung überwachen. Eine der Einschränkungen dieses Verfahrens ist, dass es nicht erlaubt die Überwachung von Migrationtion in vivo. Da es keine Einrichtung steht, die Echtzeit-Migration im Körper messen kann, ist diese Art von Assay nicht geeignet zur in vivo-Migration. Darüber hinaus erlaubt uns nicht, um die biochemische Maschinerie und Signalisierungs-Komponenten, die wichtig sind in der Zellmigration aufzuklären. Um die Signalwege adressieren, ist es unerlässlich, biochemische Experimente durchführen. Siehe Referenzen für Gruppen, die diese Methode verwendet haben für ungerichtete Migration 6, 10-14.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gemini-Bio-Produkte </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Collagen </td><td> BD </td><td> 354231 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop mit Live Cell Kammer &amp; Automated XY-Controller </td><td> Olymp </td><td> Olympus 1X81 </td><td></td></tr><tr><td> Umwelt-Steuerkammer </td><td> Neue </td><td> Neue Live Cell Kammer </td><td> Ours hat einen speziell angefertigten rechteckige Glasplatte oben für eine angemessene Optik durch den oberen Teil der Kammer. Die rechteckige Form aufnimmt Multi-Well-Platten in vielen unserer experimentellen verwendetts. </td></tr><tr><td> Automatisierte XY-Tisch </td><td> Vor </td><td> Vor Proscan </td><td> Dies ermöglicht eine präzise Rückkehr zum ausgewählten XY-Positionen während der Zeitraffer-Mikroskopie zu multiplizieren. </td></tr><tr><td> Kamera </td><td></td><td> Hamamatsu EM-Kamera C9100 </td><td></td></tr><tr><td> Software </td><td> Typischerweise durch Mikroskop Anbieter wie Olympus gekauft </td><td> Slide Buch 5 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of random migration of cells using time-lapse video microscopy

Die Zellmigration ist ein dynamischer Prozess, das ist wichtig für die Embryonalentwicklung, die Reparatur von Gewebe, die Funktion des Immunsystems und Tumorinvasion 1, 2. Während gerichtete Migration, zu bewegen Zellen schnell in Reaktion auf eine extrazelluläre chemotaktischen Signal oder in Reaktion auf intrinsische Signale 3 durch die grundlegende Motilität Maschine bereitgestellt. Zufällige Migration tritt auf, wenn eine Zelle besitzt niedrige intrinsische Richtwirkung, so dass die Zellen, um ihre lokale Umgebung zu erkunden. Die Zellmigration ist ein komplexer Prozess, in der ursprünglichen Antwort Zelle erfährt Polarisation und erstreckt sich Vorsprünge in der Richtung der Wanderung 2. Traditionelle Methoden zur Migration, wie der Boyden-Kammer Assay die Migration zu messen, ist eine einfache Methode, Chemotaxis in vitro, die Messung der Migration als Endpunkt Ergebnis erlaubt zu messen. Doch dieser Ansatz weder erlaubt die Messung der einzelnen Parameter Migration, noch erlauben zu visuasierung von morphologischen Veränderungen erfährt, dass die Zelle während der Migration. Hier präsentieren wir eine Methode, die uns zu wandernden Zellen in Echtzeit per Video überwachen können - Zeitraffer-Mikroskopie. Da Zellmigration und Invasion Kennzeichen von Krebs sind, wird diese Methode anwendbar sein bei der Untersuchung von Krebszellen Migration und Invasion in vitro. Zufällige Migration von Plättchen nach einem der Parameter der Thrombozytenfunktion 4 wurde erlaubt, damit dieses Verfahren könnte auch nützlich sein bei der Untersuchung Plättchenfunktionen. Dieser Assay hat den Vorteil, dass die schnelle, zuverlässige und reproduzierbare, und erfordert keine Optimierung der Zellzahlen. Um physiologisch geeigneten Bedingungen für die Zellen zu erhalten, wird das Mikroskop mit CO 2-Versorgung und Thermostat ausgestattet. Zellbewegung wird durch das Fotografieren mit einer Kamera ausgestattet, um dem Mikroskop in regelmäßigen Abständen überwacht. Die Zellmigration durch Messung der mittleren Geschwindigkeit und einer berechneten werdenurchschnittliche Verschiebung, die durch Slidebook Software berechnet wird.

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Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Diese Methode ermöglicht das Monitoring von Zellen in Echtzeit und quantitative Messungen verschiedener Zell-Migration Parameter wie Geschwindigkeit, Weg und Geschwindigkeit. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Methoden ist diese Echtzeit-Ansatz nicht auf Endpunkt quantitativen Migration der Grundlage von Messungen, sondern es ermöglicht die Überwachung und Berechnung verschiedener Parameter kontinuierlich.

Quantitative Analyse der ungerichtete Migration von Zellen unter Verwendung Zeitraffer-Video-Mikroskopie

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

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16.7K Aufrufe.  LSU School of Medicine. Diese Methode ermöglicht das Monitoring von Zellen in Echtzeit und quantitative Messungen verschiedener Zell-Migration Parameter wie Geschwindigkeit, Weg und Geschwindigkeit. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Methoden ist diese Echtzeit-Ansatz nicht auf Endpunkt quantitativen Migration der Grundlage von Messungen, sondern es ermöglicht die Überwachung und Berechnung verschiedener Parameter kontinuierlich.

Serie: Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

Forschung

Biologie

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Zeitraffer-Video-Mikroskopie für die Beurteilung der EYFP-Parkin Aggregation als Marker für Cellular Mitophagie

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Objektiv-kostenlose Videomikroskopie für die Dynamik und Quantitative Analyse der adhärente Zellkultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Spezifische Kennzeichnung von mitochondrialen Nukleoiden für die Zeitraffer-Struktur-Beleuchtungsmikroskopie

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...