Nichts davon wäre ohne die Unterstützung von Nasser Rusan möglich gewesen. Ich möchte H. Doug Morris, Danielle Donahue und Brenda Klaunberg von der NIH Mouse Imaging Facility und Ben Ache von Micro Photonics für das Training und die hilfreiche Diskussion danken. Ich danke auch Mansoureh Norouzi Rad von Zeiss für das Scannen von Bauchproben auf der Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith und Rachel Ng halfen auch beim Scannen. Mike Marsh von Object Research Systems leistete technischen Support bei Dragonfly. Ich bin auch dankbar für die Unterstützung des National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) und der Start Up Funds der University of Wyoming. Ich danke auch den anonymen Rezensenten für ihre hilfreichen Vorschläge und Kommentare.

1. Probenauswahl und Nagelhautvorbereitung
<ol><li>Wählen Sie den geeigneten Entwicklungszeitpunkt (Embryo, Larve, Puppe oder Erwachsener) für die Bildgebung.<ol>
<li>Für Embryonalstadien Käfigweibchen auf Traubensaft-Agarplatten mit Hefepaste beschmiert und Eier alle 30-60 Minuten sammeln. Lassen Sie diese Embryonen bei 25 °C entwickeln, bis das richtige Stadium erreicht ist.</li>
		<li>Für Larvenstadien sammeln Sie erste und zweite Instars aus zeitnahen Embryonentnahmeexperimenten. Wählen Sie direkt wandernde3. Instars von der Seite des Lebensmittelfläschchens unter nicht überlaufenden Bedingungen.</li>
		<li>Sammeln Sie für das Puppen-Timing weiße Präpuppen (invertierte Spiralen) und notieren Sie sich die Zeit, zu der die Nagelhaut zu bräunen beginnt. Die Tiere durchlaufen 15 Stadien der Puppenentwicklung zu definierten Zeitpunkten nach der Bräunung der Kutikula und können entsprechend gesammelt werden42.</li>
		<li>Sammeln Sie Erwachsene nach der Eklosion als Jungfrauen und lassen Sie sie für eine erforderliche Zeit in einer Durchstechflasche altern (z. B. 5 Tage für eine vollständige Darmentwicklung).</li>
	</ol>
</li>
	<li>5-50 Tiere werden in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 0,5% Triton X-100 in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,5% PBST) gegeben. Während Sie das Rohr regelmäßig auf der Tischplatte klopfen, inkubieren Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT), um die Entfernung der hydrophoben Beschichtung zu unterstützen und die Tiere vollständig untertauchen zu lassen.<ol>
<li>Für Embryonal-, Larven- und Puppenstadien die weitere Entwicklung aufhalten, indem Sie das Röhrchen für 20 s in einen hitzeblock auf 100 °C eingestellten Wärmeblock legen, gefolgt von einer Abkühlung bei RT für 5 min. HINWEIS: Tiere können auch in flüssigem Stickstoff eingefroren werden37.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fixierung und Färbung
<ol><li>Entfernen Sie 0,5% PBST und fügen Sie 1 ml Bouin's Solution hinzu. Klopfrohr, um sicherzustellen, dass die Tiere vollständig untergetaucht sind. ACHTUNG: Bouin's Solution enthält Formaldehyd. Es kann akute Toxizität für Haut und Augen verursachen, wenn es verschüttet wird, und kann tödlich sein, wenn es verschluckt wird. Tragen Sie bei der Handhabung Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel. HINWEIS: Zusätzliche Fixierungstechniken können ebenfalls verwendet werden, z. B. die Verwendung von Ethanol. Die Vorzüge anderer Fixiermittel sind in Referenz1,30ausführlich beschrieben.<ol>
<li>Für Embryo- und Erwachsenenproben 16-20 h bei RT auf der Tischplatte inkubieren.</li>
		<li>Für Larven- und Puppenproben die Tiere für 2 h bei RT fixieren. Bouins Lösung verwerfen und dreimal mit 1x PBS 5 min waschen. Auf eine Multi-Well-Sezierschale mit 1x PBS übertragen und mit einem kleinen Minutien-Stift, der an einem Halter befestigt ist, ein Loch in die vordere und hintere Nagelhaut stechen, wobei darauf geachtet wird, dass kein darunter liegendes Weichgewebe gestört wird.</li>
		<li>Geben Sie Larven- und Puppenproben zurück in ein Mikrofugenröhrchen und fügen Sie 1 ml frische Bouin-Lösung hinzu. Inkubieren Sie auf der Tischplatte für 24 Stunden bei RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bouin's Solution entfernen und die Probe 30 min lang mit 1 ml μ-CT Wash Buffer (0,1 M Na2HPO4,1,8% Saccharose) oder 1x PBS dreimal waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml der entsprechenden Färbelösung hinzu und inkubieren Sie sie 2-7 Tage lang auf der Tischplatte. HINWEIS: Die Wahl der Flecken hängt von vielen Faktoren ab, ist aber im Allgemeinen ein Gleichgewicht zwischen Penetration, Inkubationszeit und Auflösung. Im Allgemeinen bietet Phosphowolframatstiksäure (PTA) einen überlegenen Kontrast und eine bessere Auflösung des Weichgewebes, erfordert jedoch eine mechanische Störung der Nagelhaut und längere Inkubationszeiten. Die Vorzüge verschiedener Fleckentypen sind in Referenz1ausführlich beschrieben.<ol>
<li>Zur Jodfärbung verwenden Sie 1 ml 0,1 N I2KI (Lugol Solution). 2 Tage inkubieren. Eine weitere Störung der erwachsenen Nagelhaut ist nicht notwendig.</li>
		<li>Für die Phosphowolframatstiksäure (PTA)-Färbung verwenden Sie 1 ml einer 0,5% igen (w/v) Lösung, die in Wasser verdünnt ist. Stören Sie die erwachsene Nagelhaut, indem Sie entweder die Mundstücke entfernen oder Löcher in den Thorax oder die Bauchkutikula mit einem kleinen Minutienstift stoßen, der an einem Halter befestigt ist. Inkubieren Sie für 5-7 Tage oder länger, wenn die Gewebefärbung nicht homogen erscheint.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit 1 ml Reinstwasser oder 1x PBS 30 min waschen. Wiederholen Sie den Waschschritt. Lagern Sie Tiere bei RT in Reinstwasser oder 1x PBS für bis zu einem Monat.</li>
	<li>Wenn Tiere gescannt werden sollen, während sie hydratisiert sind, fahren Sie direkt mit Abschnitt 4 fort. Wenn eine längere Konservierung der Probe erforderlich ist, fahren Sie mit Abschnitt 3 des Protokolls fort.</li>
</ol>3. Trocknung kritischer Punkte (optional)
<ol><li>Führen Sie eine Ethanol-Dehydratisierungsreihe (EtOH) an der Probe durch: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Fügen Sie 1 ml der EtOH-Lösung hinzu und inkubieren Sie auf der Tischplatte für 1 h für jede Konzentration in der angegebenen Reihenfolge.</li>
	<li>Nach dem letzten 100% EtOH Einweichen durch frisches 100% EtOH ersetzen und die Probe über Nacht auf dem Tisch inkubieren lassen.</li>
	<li>Führen Sie die Trocknung von Proben an kritischen Stellen gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. HINWEIS: Elektronenmikroskopische Einrichtungen verfügen in der Regel über eine Trocknungsmaschine für kritische Punkte (siehe Materialtabelle),die die Trocknung der Probe nach etOH-Dehydratisierung durchführt.</li>
</ol>4. Probenmontage
<ol><li>Für kritisch punktgetrocknete Proben Heißleimproben auf einen Insektenstift oder einen anderen Halter, der so konzipiert ist, dass er in das Futter der rotierenden Stufe passt, oder legen Sie ihn in ein Kapillarrohr aus Kunststoff oder Glas (~ 1,0-1,25 mm Innendurchmesser).</li>
	<li>Für hydratisierte Proben füllen Sie eine P10-Pipettenspitze mit Wasser und sichern Sie das schmale Ende entweder durch Heißsiegelung oder Paraffinfilm, um ein Auslaufen zu verhindern. ACHTUNG: Achten Sie darauf, alle Verbindungen fest einzuwickeln, damit kein Wasser in den Scanner austritt und Schäden verursacht.<ol>
<li>Übertragen Sie eine einzelne Probe mit einer Zette auf die Pipettenspitze. Drücken Sie die Probe vorsichtig mit einem langen, schlanken Gegenstand, z. B. einer abgestumpften 20-G-Nadel oder einer anderen Pipettenspitze, die Spitze hinunter, bis sie nur noch die Wand der Pipettenspitze kontaktiert, um sie an Ort und Stelle zu halten.</li>
		<li>Decken Sie die Öffnung der Pipettenspitze mit Paraffinfilm ab, um die Verdunstung von Wasser bei langen Scans zu verhindern.</li>
		<li>Montieren Sie die P10-Pipette mit einer Halterung, die in das Futter der Drehstufe passt (Abbildung 1A-C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Scannen
<ol><li>Führen Sie alle erforderlichen Kalibrierungen der Maschine durch, bevor Sie für den Tag abbilden. HINWEIS: Diese variieren je nach Hersteller und es wird empfohlen, sich mit einem Anwendungsspezialisten in Verbindung zu setzt, um die richtigen Schritte zu bestimmen. Spezifische Informationen zum Setup und zur Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle. Im Allgemeinen bieten Kalibrierungen wie eine Ausrichtung der Bühnenachse, um jegliches "Wackeln" zu entfernen, das mit dem Spannfutter verbunden ist, das relativ zur rotierenden Stufe außerhalb der Achse liegt, und die Durchführung von Flachfeldkorrekturen, um einheitliche Hintergrundpixeldicken auf der Kamera sicherzustellen, optimale Bildbedingungen für die beste Auflösung und Datensätze, die über mehrere Scans hinweg vergleichbar sind.</li>
	<li>Öffnen Sie die Scannertür, um Zugang zum rotierenden Bühnenfutter zu erhalten, indem Sie auf das Symbol "Tür öffnen" in der oberen linken Ecke der Software klicken. Befestigen Sie die Probe, indem Sie den Kragen um die Basis des Probenhalters festziehen. HINWEIS: Verwenden Sie sanften Druck, wenn Sie die Probe am rotierenden Futter befestigen, um die Ausrichtung des Scanners aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Stellen Sie die Scanparameter in der Software ein, die den Scanner steuert, um eine optimale Auflösung und einen optimalen Kontrast zu erreichen. HINWEIS: Diese müssen empirisch bestimmt werden, da die Röntgenquelle, die Kamera/der Detektor und die Geometrie jedes Scanners je nach Hersteller variieren. Weitere Informationen zur Auswahl der besten Parameter finden Sie auch hier43, sowie beim Anwendungsspezialisten des Herstellers.<ol>
<li>Öffnen Sie die Stromsteuerung der Röntgenquelle (Optionen | Röntgenquelle). Verwenden Sie die Schieberegler, um die Röntgenspannung auf 30-40 kV und den Strom auf 100-110 μA einzustellen, um einen Röntgenstrahl mit 3-4W Leistung und einer kleinen Spotgröße für eine verbesserte Auflösung zu erzeugen.</li>
		<li>Verwenden Sie das Dialogfeld "Erfassungsmodi" (Optionen | Aufnahmemodi), um die Belichtungszeit der Kamera auf 500-800 ms einzustellen.</li>
		<li>Verwenden Sie den Schieberegler neben dem Lupensymbol am unteren Rand der Software, um die gewünschte Bildpixelgröße (~ 700 nm bis 4 μm) abhängig von den Kameraeinstellungen und der Position einzustellen. Dies bestimmt die Anzahl der Projektionsbilder, die während des Scans aufgenommen werden, wobei mehr Projektionen zu einer verbesserten Auflösung, aber längeren Scanzeiten führen (siehe Repräsentative Ergebnisse).</li>
		<li>Klicken und ziehen Sie den Schieberegler neben dem drehbaren Pfeil am unteren Rand der Software, um die Probe entlang ihres 360°-Drehpfads zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass die Probe innerhalb des Sichtfelds bleibt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie oben in der Software auf das Symbol "Erfassung starten" (blaues Kreispfeilsymbol). Ein Dialogfeld wird angezeigt, in dem zusätzliche Scanparameter festgelegt werden können, und die Datei und der Ausgabeordner, in dem der Scan gespeichert wird, werden benannt.<ol>
<li>Stellen Sie die zufällige Bewegung auf 10 und durchschnittlich 4-6 Frames ein. Der Drehschritt wird in Abhängigkeit von den verwendeten Kameraeinstellungen automatisch berechnet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beginnen Sie den Scan, indem Sie im Dialogfeld Erfassung auf 'OK' klicken. Ein zweites Fortschrittsbalkendialogfeld wird angezeigt, das die Scanzeit anzeigt. Der Scanner erfasst nun eine Reihe von Projektionsbildern (Abbildung 1D) der Probe entlang des Rotationspfades und muss nicht überwacht werden.</li>
</ol>6. Wiederaufbau
<ol><li>Um die Tomogramme zu generieren, führen Sie eine Bildrekonstruktion mit den Projektionsbildern durch. HINWEIS: Während fast alle Rekonstruktionen von Bildern von Kegelstrahlgeometriescannern auf dem Feldkamp-Algorithmus16basieren, variieren die einzelnen Parameter je nach Softwareimplementierung und sollten empirisch bestimmt werden. Die folgenden Einstellungen, die für eine handelsübliche Software spezifisch sind (siehe Materialtabelle),können als Leitfaden verwendet werden. Parameter wie Fehlausrichtungskompensation, Ringartefaktreduktion und Strahlhärtungskorrektur (0% für die meisten Fliegenproben) werden iterativ durchgeführt, um die besten Werte für die endgültige Rekonstruktion auszuwählen. Für fortgeschrittene Benutzer, die mehr Kontrolle über den Rekonstruktionsprozess wünschen, siehe die MATLAB-Schnittstelle hier44.</li>
	<li>Führen Sie eine anfängliche Bildausrichtung durch, indem Sie einen Shift-Korrektur-Algorithmus basierend auf Referenzscansverwenden 45 (Actions | X/Y-Ausrichtung mit einem Referenzscan).
</li>
	<li>Feinabstimmung der einzelnen Rekonstruktionsparameter (Start | Feinabstimmung). Dadurch wird ein Dialogfeld "Parameterfeinabstimmung" aktiviert.<ol>
<li>Passen Sie die Ausrichtung an, indem Sie auf 'Weiter' bis 'Nachausrichtung' klicken. Legen Sie die Anzahl der Iterationen auf fünf und den Parameterschritt auf 1.0 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um eine Reihe von Vorschauen zu generieren. Wählen Sie das Bild aus, das richtig ausgerichtet ist. HINWEIS: Ein richtig ausgerichtetes Bild ist nicht verschwommen oder zeigt "scherende" Artefakte an, bei denen eine ansonsten kontinuierliche Struktur (z. B. die Nagelhaut) geteilt erscheint.</li>
		<li>Passen Sie die Reduzierung des Ringartefakts an, indem Sie daneben klicken. Legen Sie die Anzahl der Iterationen auf fünf und den Parameterschritt auf 1.0 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um eine Reihe von Vorschauen zu generieren. Wählen Sie das Bild aus, das die geringste Anzahl von Ringen enthält.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald die oben genannten Parameter optimiert wurden, um das beste Bild zu erhalten, stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Werte auf der Registerkarte Einstellungen ( Einstellungen ) richtig dargestelltwerden.
</li>
	<li>Passen Sie alle endgültigen Helligkeits- und Kontrastwerte mithilfe des Histogramms an, dateien Sie Parameter wie Bittiefe und -typ und verwenden Sie einen Bereich von Interesse (ROI), der nur die strukturen von Interesse umfasst (z. B. nur ganze Fliege oder Kopf), um die Rechenzeit zu reduzieren(Ausgabe).</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Rekonstruktion (Start | Start). Wenn mehrere Rekonstruktionen erforderlich sind, fügen Sie das aktuelle Image dem Batch-Manager hinzu (Start | Zum Stapel hinzufügen) und wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.5 für die verbleibenden Bilder.</li>
</ol>7. Bildanalyse
<ol><li>Visualisieren Sie Tomogramme in zwei und drei Dimensionen und führen Sie weitere morphometrische Analysen mit Freeware oder kommerzieller Software durch. HINWEIS: Details zur in diesem Protokoll verwendeten Software finden Sie in der Materialtabelle. Andere Softwarepakete, die in der Lage sind, μ-CT-Datensätze auszuwerten, umfassen Freeware-Optionen wie FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47und ITK-SNAP48sowie kommerzielle Software (z. B. AMIRA). Andere Anwendungen, die auf maschinellem Lernen basierende Algorithmen zur Halbautomatisierung des Segmentierungsprozesses verwenden, können dazu beitragen, Arbeitsabläufe zu beschleunigen und menschliche Vorurteile zu reduzieren (z. B. Biomedisa49).</li>
	<li>Importieren Sie die Tomogrammdatei in die Software (Datei | Bilddateien importieren). Die mit der Datei verknüpften Metadaten sollten automatisch in das Fenster geladen werden, können aber auch manuell so eingestellt werden, dass sie den Bildeigenschaften entsprechen.</li>
	<li>Um eine interessante Struktur zu segmentieren, klicken Sie auf die Registerkarte Segment auf der linken Seite des Bildschirms. Erstellen einer neuen Region of Interest (ROI) (Basic | Neu),geben Sie ihm einen Namen und wählen Sie eine geeignete Farbe aus.</li>
	<li>Definieren Sie den Schwellenwertbereich, der die Struktur von Interesse umfasst (Bereich | Bereich definieren) mit dem Schieberegler.</li>
	<li>Wählen Sie einen geeigneten 2D- oder 3D-ROI-Painter-Tool-Modus(ROI Painter | Pinseloption).
</li>
	<li>Um einen bereich zu malen, der durch den Schwellenwert definiert ist; Halten Sie die Strg-Taste gedrückt, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten. Um einen Bereich zu entfernen, halten Sie die Umschalttaste gedrückt, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten. HINWEIS: Um die Größe des kreisförmigen oder quadratischen Pinsels zu ändern, scrollen Sie einfach mit dem Mausrad, während Sie entweder die Strg- oder die Umschalttaste gedrückt halten.</li>
	<li>Malen Sie weiterhin die Struktur von Interesse über das gesamte Z-Volumen.</li>
	<li>Konvertieren Sie den ROI in ein Netz (Export | Zu einem Netz | Normal).
</li>
	<li>Markieren Sie die Netzüberlagerung, indem Sie im Bedienfeld "Dateneigenschaften und -einstellungen" in der oberen rechten Ecke darauf klicken.</li>
	<li>Glätten des Netzes mit einer geeigneten Anzahl von Iterationen(Smooth Mesh | Iterationen). HINWEIS: Verwenden Sie für alle Zu vergleichenden Bilder denselben Iterationswert für die Netzglättung.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Messungen des Netz-ROI (Oberfläche, Volumen und Feretdurchmesser) im Informationsfenster auf der rechten Seite des Bildschirms für grundlegende morphometrische Analysen angezeigt werden. Zusätzliche Analysen können mit dem Modul Objektanalysedurchgeführt werden.</li>
	<li>Rendern Sie das Netzobjekt und das gesamte Tomogrammbild und visualisieren Sie es in 3D. Verwenden Sie den integrierten Movie Maker, um ein Video des Objekts zu generieren(rechter Mausklick | Movie Maker anzeigen) mit einzelnen Frames aus dem Viewer(Add Key). HINWEIS: Mehrere visuelle Verbesserungen können auch auf den Film angewendet werden, indem Sie die Registerkarte "Visuelle Effekte" im rechten Bereich verwenden, um bestimmte Funktionen usw. hervorzuheben.</li>
	<li>Exportieren Sie das Video zur Anzeige mit der Schaltfläche Animation exportieren im Movie Maker.</li>
</ol>

Der Autor erklärt keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen.

Die Visualisierung intakter Drosophila melanogaster in allen Entwicklungsstadien ist eine Herausforderung geblieben, vor allem aufgrund der Inkompatibilität der Lichtmikroskopie mit der dicken, pigmentierten Nagelhaut dieses Tieres. Während andere Bildgebungsverfahren für ganze Tiere, wie Magnetresonanztomographie (MRT), Optische Kohärenztomographie (OCT) und Ultraschall in Verbindung mit Gewebereinigung, erfolgreich bei Fliegen50,51,52,53,54, μ-CT eine Reihe von Vorteilen bietet, die es ideal für die Bildgebung von ganzen Tieren dieses Organismus machen13,15,30 . Röntgenstrahlen dringen leicht in die pigmentierte Nagelhaut ein und ihre kleine Wellenlänge ermöglicht eine Submikranz-Bildgebung. Die Etikettierung erfordert minimale Investitionen in weit verbreitete Chemikalien und keine speziellen Bankkenntnisse13. μ-CT-Scanner sind ebenfalls im Handel erhältlich, und die Kosten sind vergleichbar mit Lichtmikroskopie-Plattformen, sind aber auch für ein breiteres Spektrum von Disziplinen (Geologie, Paläontologie, Ingenieurwesen usw.) attraktiver, die auch von ihrer Verfügbarkeit an einer Institution profitieren können. Synchrotron-Röntgenquellen können auch für hochauflösende μ-CT-Bildgebung von festen und lebenden Insekten31,55,56verwendet werden, sind jedoch weniger zugänglich als kommerzielle Tischscanner.
Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, μ-CT-Bilder von Erwachsenen, Puppen, Larven und zellularisierten Embryonen zu erhalten. Beachten Sie, dass für viele der oben beschriebenen Schritte auch alternative Methoden angewendet werden können, um Proben für die Bildgebung vorzubereiten. Andere Studien haben einen detaillierten Vergleich der verschiedenen Fixierungs-, Markierungs- und Trocknungsschritte für die Verwendung bei Insekten geliefert, und diejenigen, die an der Anwendung dieser Technik interessiert sind, werden ermutigt, die Vorzüge jedes Ansatzes1,4,13,29,30,57zu bewerten . Während dieses Protokoll relativ einfach ist, werden einige hilfreiche Vorschläge vorgestellt.
Erstens sollte bei der Störung der Nagelhaut intakter Proben darauf geachtet werden, dass darunter liegende Weichteile nicht signifikant gestört werden. Es ist wichtig, Larven- und frühe Puppenstadien für 2 Stunden in Bouins Lösung fixieren zu lassen, bevor Sie stochern. Dies versteift das Gewebe und begrenzt die Menge an Hämolymphe, die aus den Nagelhautlöchern austritt, was die Organarchitektur verändern kann. Einzelne Körpersegmente (Kopf, Thorax und Bauch) des Erwachsenen können getrennt werden, wenn sich die interessierenden Strukturen dort befinden. Es wird empfohlen, diese Segmente mit einem Skalpell sauber zu durchschneiden, anstatt sie mit einer Zinnen auseinanderzuziehen, was beispielsweise die 3D-Architektur des Darms oder des zentralen Nervensystems stören könnte. Was das Timing betrifft, benötigen Erwachsene in der Regel nur 16 Stunden. für eine vollständige Fixierung, während Larven- und Puppenstadien 24 Stunden benötigen. Wenn die Jod- oder PTA-Färbung ungleichmäßig erscheint, kann die Probe wieder in Lösung gelegt werden, um länger zu inkubieren, bis eine gleichmäßige Färbung erreicht ist. Schließlich sollten hydratisierte Proben nicht bei 4 °C platziert werden, da dies nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur die Bildung von Luftblasen in der Körperhöhle zu induzieren scheint.
Zweitens variiert die Probenmontage je nach Instrument, Bühnentyp und ob die Probe hydratisiert bleiben muss oder an kritischen Stellen getrocknet wurde. Wenn Sie hydratisiert sind, stellen Sie sicher, dass die Probe nicht ausläuft und möglicherweise den Scanner zerstört. Wenn Sie die Probe in einer Pipettenspitze montieren, achten Sie darauf, vorsichtig mit einem abgestumpften Gegenstand zu drücken, bis die Proben auf leichten Widerstand stoßen und sich nicht bewegen können. Zu hartes Drücken kann zu Nagelhautverformungen und zugrunde liegenden strukturellen Defekten führen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Probe im Halter so nah wie möglich an der Drehachse ausgerichtet ist. Jedes Wackeln erhöht die Scanzeiten aufgrund des größeren Sichtfelds und reduziert die Auflösung des endgültigen Tomogramms nach der Rekonstruktion.
Drittens variieren die Scannereinstellungen für die Aufnahme von Projektionsbildern ebenfalls je nach Instrument. Um die Auflösungsfähigkeit des Scanners zu maximieren, sollte die Größe des Röntgenstrahlflecks so klein wie möglich sein (5-10 μm). Dies kann erreicht werden, indem Röntgenspannungs- und Stromeinstellungen so ausgeglichen werden, dass die Gesamtleistung 3-4 W beträgt. Mit diesen Einstellungen und der entsprechenden Belichtungszeit an der Kamera kann eine korrekte Röntgenstrahldämpfung durch die Probe und ein optimaler Bildkontrast erreicht werden. Die Verwendung von Aluminium- oder Kupferfiltern zwischen dem Objekt und der Röntgenquelle kann verwendet werden, um die optimalen Röntgenenergieeinstellungen für den besten Bildkontrast zu verfeinern oder den Strahl ausreichend zu dämpfen, damit Quellen mit höherer Leistung verwendet werden können. Was die Bildauflösung betrifft, hängt dies von vielen verschiedenen Variablen ab, einschließlich Fleckentyp, Anzahl der Projektionsbilder, Bildpixelgröße, Kameraposition, Probenbewegung, Scannervibrationen und Rekonstruktionsparametern. Ein Balkenmusterphantom (QRM GmbH) mit bekannten Größenmarkierungen kann helfen, die räumliche Auflösung für eine bestimmte Scanner- und Kameraeinstellung zu bewerten.
Es lohnt sich auch, die Vorzüge der Bildgebung von getrockneten oder hydratisierten Proben mit kritischem Punkt zu bewerten. Sombke et al. führten eine vergleichende Bewertung der beiden Methoden durch und fanden die Trocknung kritischer Punkte für μ-CT-Anwendungen mit Arthropoden überlegen30. Die Vorteile von hydratisierten Proben bestehen jedoch darin, dass Tiere weniger chemischen und mechanischen Expositionen ausgesetzt sind, die sowohl zu quantitativen als auch zu morphologischen Artefakten führen können. Dies neigt auch dazu, empfindliches Gewebe besser zu erhalten als CPD. Hydratisierte Proben haben jedoch eine viel kürzere Haltbarkeit und sollten spätestens einen Monat nach der Fixierung abgebildet werden, da an dieser Stelle Gewebeabbau und verminderte Bildqualität offensichtlich werden. Außerdem ist die Auflösung von hydratisierten Proben etwas geringer als eine getrocknete Probe an kritischem Punkt, da Röntgenstrahlen auch durch eine Kunststoffpipettenspitze und die umgebende Flüssigkeit (Wasser oder Puffer) eindringen müssen. Critical Point Getrocknete Proben können für viel längere Zeit konserviert werden, insbesondere wenn sie auf Drierite aufbewahrt werden. Sie können auch direkt in den Röntgenstrahlweg gelegt werden, indem die Flügel oder Beine einfach an einen Insektenstift geklebt und in das Bühnenfutter gelegt werden, was den Montagevorgang vereinfacht. Die umfangreiche Ethanoldehydratisierung dieser Proben kann jedoch zu Gewebeschrumpfung und Verlust empfindlicher Gewebearchitektur führen, weshalb es wichtig ist, eine Reihe von steigenden EtOH-Konzentrationen durchzuführen, um diese Effekte zu minimieren. Dennoch ist zu beachten, dass alle Formen der chemischen Behandlung, einschließlich Paraformaldehydfixierung und sogar Jodfärbung, Gewebeschrumpfung verursachen können58,59. Während keine der beiden Methoden Messungen der "tatsächlichen Organgröße" in einer lebenden Fliege liefert, sind morphometrische Messungen beim Vergleich von Mutierten- und Wildtyptieren immer noch gültig, solange die Fixierungs-, Färbe- und Trocknungsschritte für beide Probensätze identisch durchgeführt werden - vorzugsweise parallel.
Zusammenfassend bietet μ-CT ein nützliches Bildbildwerkzeug für Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Viele andere Studien haben die Leistungsfähigkeit dieser Technologie für das Verständnis verschiedener Aspekte der Insektentaxonomie, Ökologie, Physiologie, Entwicklung und Anatomie gezeigt, die dazu beitragen können, zukünftige Studien in Fliegen1,28,30,31,32,55,56,57 zu informieren . In Kombination mit den genetischen und lichtmikroskopisch in diesem Organismus bereits weit verbreiteten Werkzeugen kann sich μ-CT innerhalb einer experimentellen Pipeline positionieren, die ein tieferes Verständnis zwischen Genotyp und Phänotyp ermöglicht.

Bildgebende Verfahren, die eine detaillierte Untersuchung der inneren Strukturen eines Objekts ermöglichen, ohne seine gesamte 3D-Architektur zu zerstören, haben sich für eine Reihe verschiedener Disziplinen als sehr vorteilhaft erwiesen, darunter Physik, Ingenieurwesen, Materialwissenschaften, Archäologie, Paläontologie, Geologie und Biologie1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Unter diesen zerstörungsfreien Bildgebungsmethoden sind röntgenbasierte Plattformen besonders nützlich, da hochenergetische Röntgenstrahlen im Vergleich zu sichtbaren Lichtwellen viele verschiedene Probentypen und Materialien mit minimaler Streuung durchdringen können. Computertomographie (CT), Mikrocomputed Tomography (μ-CT), Nanocomputed Tomography (Nano-CT) und Synchrotron-Mikrotomographie haben sich daher als die primären Technologien für die röntgenbasierte Bildgebung von Proben von Metern bis Mikrometern mit Auflösungsfähigkeiten von Millimetern bis Submikromin10,11,12,13,14herausgestellt.
Während sich diese Plattformen in ihrem Design, ihrer Röntgengeometrie und ihren Komponenten unterscheiden, um Probengröße und Auflösung auszugleichen, basieren sie alle auf dem gleichen Grundprinzip für die Bilderfassung: eine Quelle von Röntgenstrahlen, die durch das Objekt wandern und von einem Detektor erfasst werden. Die differentielle Dämpfung des Röntgenstrahls beim Durchlaufen unterschiedlicher Dichten innerhalb des Objekts erzeugt einen Bildkontrast. 3D-Daten werden erhalten, indem entweder die Probe oder der Detektor gedreht wird, wobei eine Reihe von 2D-Projektionsbildern gesammelt wird, die dann mithilfe von Algorithmen zu Tomogrammen rekonstruiert werden, die 3D-Informationen enthalten, deren Auflösung in x, y, z15isotrop ist. Für viele Benchtop-μ-CT-Scanner, die eine Kegelstrahl-Röntgengeometrie verwenden, um Röntgenstrahlen auf das abgebildete Objekt zu projizieren, wird der Feldkamp-Algorithmus verwendet, um das Objekt mit minimalen Fehlern genau zu rekonstruieren16.
Die Auflösung einer gegebenen Plattform wird in erster Linie durch Systemparameter wie die Größe des Röntgenstrahls (Spotgröße), die Scannergeometrie (Entfernung vom Objekt zur Röntgenquelle), die Größe der Pixel auf dem Detektor und den verwendeten Rekonstruktionsalgorithmus bestimmt. Zusätzliche Faktoren wie Scannerschwingungen, Röntgenstrahlschwankungen, Probenbewegung und Materialtyp oder chemischer Fleck, der zur Visualisierung des Objekts verwendet wird, können die räumliche Auflösung unter realen Bildgebungsbedingungen ebenfalls erheblich beeinflussen15.
Für biomedizinische Anwendungen haben CT und μ-CT eine Schlüsselrolle bei der Verbesserung unseres Verständnisses von Anatomie, Physiologie, Entwicklung und Krankheitsmechanismen gespielt und dienen sowohl als Werkzeug für die Diagnose menschlicher Patienten als auch als präklinische Bildgebungsplattform für Modellorganismen17,18. Zum Beispiel nutzt das Mouse International Phenotyping Consortium, dessen Ziel es ist, die Funktion jedes Gens im Mausgenom zu identifizieren, μ-CT als Teil ihrer Phänotypisierungspipeline19. Ihre Ergebnisse waren entscheidend für das Verständnis von Genen, die an Entwicklungs- und Krankheitsprozessen beteiligt sind, und dienten gleichzeitig als Atlas für die Anatomie und Entwicklung vonMäusen 20. Andere Modellorganismen, wie Zebrafische und Ratten, haben die Verwendung von μ-CT zur Durchführung der Phänotypisierung ganzer Tiere einer Reihe von Genmutanten17,21,22,23 ebenfallsvollständig angenommen.
Der Vorteil der Kombination von Ganztierbildgebung mit Modellorganismen besteht darin, dass ein mechanistisches Verständnis der Genfunktion für einen bestimmten biologischen Prozess vollständig erforscht werden kann. Dies ist möglich aufgrund der gut charakterisierten Genome und vieler genetischer Werkzeuge, die in Modellorganismen verfügbar sind, die eine präzise Manipulation der Genfunktion zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten, spezifischen Geweben, einzelnen Zellen und sogar subzellulären Organellen ermöglichen. Dazu gehören binäre Expressionssysteme wie das UAS/GAL4-System (und seine vielen Derivate), CRISPR/Cas9 und RNAi24,25,26. Wenn diese genetischen Werkzeuge in Verbindung mit einer leistungsfähigen Bildgebungspipeline verwendet werden, die aus Elektronenmikroskopie, Lichtmikroskopie (fluoreszierend und nicht fluoreszierend) und ganzer Tierbildgebung wie μ-CT besteht, kann eine gründliche Bewertung von Molekülen, Zellen, Geweben, Organen und dem gesamten Organismus erreicht werden, was ein viel tieferes Verständnis der Genfunktion ermöglicht.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von μ-CT im Nicht-Säugetier-Modellorganismus Drosophila melanogaster, dessen unzählige genetische Werkzeuge dazu beigetragen haben, zahlreiche molekulare Mechanismen aufklärtzuhaben 26,27. Es wurde von früheren Protokollen bei Nicht-Modellinsekten1,28,29,30,31,32übernommen und baut auf früheren μ-CT-Studien in Drosophila auf, um ein standardisiertes Protokoll für seine Verwendung bei diesem Tier zu erstellen33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Die Schritte zur erfolgreichen Probenvorbereitung, Bildgebung und Analyse von Fliegen-μ-CT-Datensätzen mit handelsüblichen Scannern werden skizziert. Mit diesem Protokoll können alle Entwicklungsstadien der Fliege in hoher Auflösung sowohl für deskriptive als auch für hypothesentestende Studien visualisiert werden, einschließlich Taxonomie, Anatomie, Entwicklung, Physiologie und Krankheit27. Dieses Protokoll wird auch für die Abbildung praktisch aller Insekten und sogar nicht lebender Materialien nützlich sein, die eine chemische Färbung für den Bildkontrast erfordern, um die Visualisierung durch μ-CT zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>100% Ethanol</td><td></td><td></td><td>For critical point drying</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td>For animal fixation</td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td></td><td></td><td>Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)</td></tr><tr><td>Dragonfly Software</td><td>Object Research Systems</td><td></td><td>For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>For microfuge tubes</td></tr><tr><td>Image Analysis Workstation</td><td></td><td></td><td>Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering</td></tr><tr><td>Iodine Solution (I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;KI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SI86-1</td><td>For staining</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1172</td><td>Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 &amp;micro;m pixel size.</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td>For poking hole in cuticle</td></tr><tr><td>NRecon Image Reconstruction Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry</td></tr><tr><td>P10 pipet tips</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-120</td><td>Sample mounting</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Resarch Products International</td><td>P32060-4000.0</td><td>Dilute to 1X with water before use</td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25g</td><td>For staining</td></tr><tr><td>Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>For Minutien Pins</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Research Products International</td><td>111036</td><td>To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)</td></tr><tr><td>X-Ray Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 Versa</td><td>Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD&amp;trade;)</td></tr></tbody></table>

whole animal imaging of drosophila melanogaster using microcomputed tomography

Biomedizinische Bildgebungswerkzeuge ermöglichen die Untersuchung molekularer Mechanismen über räumliche Skalen hinweg, von Genen bis hin zu Organismen. Drosophila melanogaster, ein gut charakterisierter Modellorganismus, hat von der Verwendung von Licht- und Elektronenmikroskopie profitiert, um die Genfunktion auf der Ebene von Zellen und Geweben zu verstehen. Die Anwendung von Bildgebungsplattformen, die ein Verständnis der Genfunktion auf der Ebene des gesamten intakten Organismus ermöglichen, würde unser Wissen über genetische Mechanismen weiter verbessern. Hier wird eine ganze Tierbildgebungsmethode vorgestellt, die die Schritte beschreibt, die erforderlich sind, um Drosophila in jedem Entwicklungsstadium mittels Mikrocomputed Tomographie (μ-CT) zu visualisieren. Zu den Vorteilen μ-CT gehören kommerziell erhältliche Instrumente und minimale praktische Zeit, um genaue 3D-Informationen mit Einer Auflösung auf Mikrometerebene zu erzeugen, ohne dass Gewebedissektions- oder Clearingmethoden erforderlich sind. In Kombination mit Software, die die Bildanalyse und das 3D-Rendering beschleunigt, kann eine detaillierte morphometrische Analyse jedes Gewebe- oder Organsystems durchgeführt werden, um entwicklungs-, physiologie- und anatomiemechanismen sowohl für beschreibende als auch für Hypothesenteststudien besser zu verstehen. Durch die Verwendung eines bildgebungstechnischen Workflows, der den Einsatz von Elektronenmikroskopie, Lichtmikroskopie und μ-CT umfasst, kann eine gründliche Bewertung der Genfunktion durchgeführt werden, wodurch die Nützlichkeit dieses leistungsstarken Modellorganismus weiter unterstützt wird.

Abbildung 2 zeigt Bilder eines Embryos,3. Instar-Larven, Puppen im pharaten Erwachsenenstadium (P7) und einer erwachsenen weiblichen Fliege, die mit Jod gefärbt und mit einem kommerziellen Tischscanner in Wasser hydratisiert abgebildet wurde. Eine hervorragende Konservierung und sogar Färbung von empfindlichem Gewebe ist offensichtlich, so dass alle wichtigen Organe leicht identifiziert und für morphometrische Analysen und 3D-Visualisierung verwendet werden können.
In der Regel bieten Scans, die weniger Projektionsbilder der Probe erfassen, eine niedrigere Auflösung als Scans, die mehr Projektionsbilder erfassen, wobei der Kompromiss die Zeit ist, die für das Scannen aufgewendet wird. Obwohl die Scanzeiten je nach Instrument und anderen Scanparametern variieren, dauern Scans, die einige hundert Projektionen (~ 3 μm Bildpixelgröße) erfassen, etwa 30 Minuten pro Probe, während Scans, die aus Tausenden von Projektionsbildern (700 nm-1,25 μm Bildpixelgröße) bestehen, 8-16 Stunden dauern können. Ein Vergleich desselben erwachsenen Fliegenkopfgehäuses, das sowohl im Scanmodus "langsam" (Tausende von Projektionen) als auch im "schnellen" (Hunderte von Projektionen) Scanmodus aufgenommen wurde, ist in Abbildung 3 dargestellt. Wichtig ist, dass morphometrische Analysen nicht zwischen "langsamen" und "schnellen" Scans unterscheiden (Abbildung 3C)40. Unsere Bildgebungspipeline verwendet daher schnelle Scans, um eine ausreichend große Stichprobengröße für morphometrische Analysen zu generieren, und langsame Scans, um morphologische oder anatomische Defekte mit höherer Auflösung zu visualisieren. Mit der Software (Schritt 7) kann jedes Gewebe- oder Organsystem von Interesse segmentiert und für morphometrische Analysen verwendet und mit dem Movie Maker in 3D visualisiert werden (Film 1).
Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für den mit PTA gefärbten und abgebildeten hydratisierten (Wasser) oder nach critical point drying (CPD) auf einem Röntgenmikroskop (Table of Materials). Die Details, die eine Kombination aus PTA und den Fähigkeiten dieser Plattform bietet, sind in diesen Bildern leicht ersichtlich, so dass einzelne Epithelzellen des Mitteldarms und Spermienbündel innerhalb der Hoden leicht aufgelöst werden können. Während das CPD-Bild im Vergleich zur hydratisierten Probe eine geringfügig erhöhte Auflösung zeigt, wird mit hydratisierten Proben eine bessere Erhaltung der Ultrastruktur empfindlicher Gewebe (wie der Fettzellen in der Nähe der Nagelhaut) erreicht (Film 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über Scannerdesign und Probenmontage für μ-CT. (A) Ein handelsübliches μ-CT-Scanner. (B) Blick ins Innere des Scanners. Die Röntgenquelle (rechts) sendet Röntgenstrahlen aus, die die Probe auf einer rotierenden Stufe (gelber Pfeil) passieren. Die Dämpfung dieser Röntgenstrahlen erzeugt einen Bildkontrast, wenn sie durch die Probe und auf den Detektor gelangen, der aus einem Szintillationsbildschirm, der Röntgenstrahlen in Photonen umwandelt, und einer Standard-CCD-Kamera (links) besteht. (C) Montage einer erwachsenen Fruchtfliege für hydratisierte Bildgebung in Wasser. Die Verbindungspunkte zwischen der Pipettenspitze und dem Messinghalter sind mit Paraffinfolie umwickelt, um Leckagen und mögliche Schäden am Scanner zu vermeiden. Das Bühnenfutter ist ebenfalls hervorgehoben. Beachten Sie, dass die Pipettenspitze leicht außerhalb der Achse positioniert war, was zu einer längeren Scanzeit und einer reduzierten Auflösung bei der endgültigen Rekonstruktion führte. (D) Ein einzelnes 2D-Projektionsbild einer erwachsenen weiblichen Fliege; Hunderte bis Tausende dieser Projektionen werden während eines Scans entlang der Rotationsachse aufgenommen und zur Rekonstruktion verwendet, um Tomogramme mit isotroper Auflösung und genauen 3D-Informationen zu erzeugen. Skalenbalken (C) = 2 mm. P, Posterior; V, Ventral. Diese Zahl wurde von Schoborg et al.40modifiziert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> Abbildung 2: Alle Lebenszyklusphasen von Drosophila melanogaster, abgebildet durch μ-CT. Proben, die mit Jod gefärbt und in Wasser hydratisiert dargestellt wurden. Gezeigt wird ein einzelnes 2D-Segment. (A) Ein Embryo, der die frühen Stadien der Gastrulation abgeschlossen hat (Sternchen). (B) Eine dritte Instar-Larve. (C) Ein P7 Pharat Erwachsener während der Metamorphose. (D) Eine erwachsene Frau. Verschiedene Organe werden hervorgehoben: BWM, Körperwandmuskulatur; Br, Gehirn; Cd, Cardia; Cr, Ernte; DLMs, dorsale Längsmuskulatur; DVM, dorsale ventrale Muskeln; E-AD, Augen-Antennenscheibe; Em, Embryo; FB, fette Körper; FBCs, Fettkörperzellen; H, Herz; Hg, Hinterdarm; La, Lamina; L, Bein; Mg, Mitteldarm; OL, Gehirnoptiklappen; Ov, Ovipositor; PC, Puppenkutikula; SG, Speicheldrüsen; VNC, ventrale Nervenschnur; W, Flügel; WD, Flügelscheibe. Scale Bars (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, Links. Scanparameter: Abstand Quelle zu Probe (mm): (A, D) 36,5, (B) 48,8, (C) 40,3. Abstand quelle zu Kamera (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Kamera-Pixelgröße (μm): (A-D) 11.6. Bildpixelgröße (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> Abbildung 3: Scanparameter und Bildauflösung verändern morphometrische Analysen nicht. Ein erwachsener Kopf, der sowohl mit (A, A') "schnellen" Scannereinstellungen (Hunderte von Projektionen) als auch (B, B') "langsamen" Scannereinstellungen (Tausende von Projektionen) gescannt wurde. Das Gehirn ist gelb umrandet. (C) Gehirnvolumenmessungen durch langsame und schnelle Scans. Hervorgehobene Strukturen: AL; Antennenlappen; CB, zentrales Gehirn; FB, fächerförmiger Körper; FCs, Fettzellen; La, Lamina; Lo, lobula; LoP, Lobula-Platte; Ich, medulla; Re, Netzhaut. n = 5, Welchs t-Test. ns = nicht signifikant. Maßstabsbalken = 100 μm. Scanparameter: Quelle-Zu-Probe-Abstand (mm): (A) 44,4, (B) 36,5. Abstand Quelle zur Kamera (mm): (A) 348 (B) 350. Kamera-Pixelgröße (μm): (A-B) 11.6. Bildpixelgröße (μm): (A) 2.95, (B) 1.2. Diese Zahl wurde von Schoborg et al.40modifiziert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> Abbildung 4: Drosophila melanogaster Abdomen, röntgenmikroskopisch dargestellt. Die Abdomen wurden mit 0,5% PTA gefärbt und hydratisiert (Wasser) oder nach der Trocknung kritischer Punkte (CPD) abgebildet. (A) Kritischer Punkt Getrockneter Bauch, dargestellt aus der YZ-Perspektive und (A') XZ-Perspektive. (B) Hydratisierter Bauch, dargestellt aus der YZ-Perspektive und (B') XZ-Perspektive. Verschiedene Organe werden hervorgehoben: FC, Fettzellen; Hg, Hinterdarm; Mg, Mitteldarm; SP, Spermienpumpe; Te, Hoden. Skalenbalken (A) = 250 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, Links. Scanparameter: Abstand quelle zu Probe (mm): (A) 6,7, (B) 7. Abstand quelle zu Kamera (mm): (A) 28 (B) 29.5. Objektiv: (A-B) 4X. Bildpixelgröße (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Film 1: Eine dritte Instar-Larve, die mit dem Movie Maker in Dragonfly in 3D gerendert wurde. Zu den hervorgehobenen Organen gehören das Gehirn (gelb), die Augen-Antennen-Imaginalscheiben (rot), der Fettkörper (blau) und die Körperwandmuskulatur (grün). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>
Film 2: Vergleich von Proben, die in Wasser abgebildet wurden, oder nach der Trocknung kritischer Punkte. Abdomen, die mit 0,5% PTA gefärbt sind, werden gezeigt. Beide Abdomen wurden mit identischen Bildpixelgrößeneinstellungen (0,65 μm) gescannt. Eine Reihe von 2D-Scheiben wird in einem "Z-Stack" -Format (YZ) gezeigt, das an der dorsalen Oberfläche beginnt und an der ventralen Oberfläche des Abdomens endet. Hervorgehobene Organe: FC, Fettzellen; Mg, Mitteldarm; SP, Spermienpumpe; Te, Hoden. Scanparameter: Abstand quelle zu Probe (mm): (A) 6,7, (B) 7. Abstand quelle zu Kamera (mm): (A) 28 (B) 29.5. Objektiv: (A-B) 4X. Bildpixelgröße (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>

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Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Es wird ein Protokoll vorgestellt, das die Visualisierung intakter Drosophila melanogaster in jedem Entwicklungsstadium mittels Mikrocomputed Tomographie ermöglicht.

Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

4.8K Aufrufe.  University of Wyoming. Es wird ein Protokoll vorgestellt, das die Visualisierung intakter Drosophila melanogaster in jedem Entwicklungsstadium mittels Mikrocomputed Tomographie ermöglicht.

Serie: Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Forschung

Biologie

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Entwicklungsbiologie

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Biotechnik

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Neurowissenschaften

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

3D mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel von Serial-Abschnitt Elektron Tomographie aufgedeckt

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

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