Dieses Protokoll in Kräutern kontinuierliche Messung von genetischen Schaltkreisen in E.coli und die Berechnung der Signalvariabilität und Signal-Rausch-Verhältnis in einzelnen Bakterienzellen zur Beurteilung der Schaltungsleistung. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie leicht an verschiedene Stämme und Labore angepasst werden kann, minimale sorgsam und ohne spezielle Ausrüstung erfordert und relativ kostengünstig ist. Lärm spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Funktionalität biologischer Systeme.
Derzeit besteht ein Interesse am Bau von groß angelegten Genkreisläufen. Diese Systeme können durch Lärm gehemmt werden Achten Sie darauf, die Proben gut zu trocknen, diese Chillpads so lange wie möglich bei vier Grad Celsius zu halten und die Teile geduldig und schonend zu schneiden und zu teilen. Um die Bakterien für die Analyse vorzubereiten, impfen Sie eine einzelne Kolonie aus einer transfizierten E.coli-Kultur.
Zum Beispiel eine Schaltung mit einem GFP-Reporter. In einem Glasrohr mit fünf Millilitern LB-Brühe wird es mit den entsprechenden Antibiotika ergänzt. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute in einem zitternden Inkubator für zwei Stunden, bis die Brühe trüb ist.
Am Ende der Inkubation einen Milliliter Verdünnungslösung in einer Zwei-Milliliter-Mini-Mikrozentrifuge abdrehen und 30 Mikroliter Bakterien und das gesamte Volumen der Verdünnungslösung in eine neue Zwei-Milliliter-Röhre übertragen. Dann bebrüten Sie die Kultur für eine Stunde mit Schütteln, bevor Sie 40 bis 60 Mikroliter dieser Suspension auf M9-Kulturplatten säen. Um die Bakterien für die Analyse vorzubereiten, impfen Sie eine einzelne Kolonie aus einer transfizierten E.Coli-Kultur.
Zum Beispiel eine Schaltung mit einem GFP-Reporter in einem Glasrohr mit fünf Millilitern LB-Brühe, ergänzt durch die entsprechenden Antibiotika. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute in einem zitternden Inkubator für zwei Stunden, bis die Brühe trüb ist. Am Ende der Inkubation einen Milliliter Verdünnungslösung in einem Zwei-Milliliter-Mini-Mikrozentrifugenrohr versenken und 30 Mikroliter Bakterien und das gesamte Volumen der Verdünnungslösung in ein neues Zwei-Milliliter-Rohr übertragen.
Dann bebrüten Die Kultur für eine Stunde mit Schütteln. Um Mikroskopplatten herzustellen, mischen Sie 112,5 Milligramm niedrigschmelzenden Agar mit 40 Milligramm Agar und einen Milliliter 2%Casaminosäure in einem 25 Milliliter Erlenmeyer Kolben. Als nächstes fügen Sie 8,92 Milliliter minimales Medium über die inneren Lippen eines 25 Milliliter Erlenmeyer Kolbens und Mikrowelle die resultierende Lösung in kurzen, zwei bis drei Sekunden Bursts.
Dann stellen Sie das Wasserbad auf 55 Grad Celsius. Wenn die Lösung klar ist, legen Sie den 25 Milliliter Erlenmeyer-Kolben in ein 60 Grad Celsius-Wasserbad und lassen Sie die Agar-Lösung abkühlen, bis ihre Temperatur auf etwa 45 bis 50 Grad Celsius fällt. Während der Agarkühlung, reinigen Sie die Laborbank mit 70% Ethanol und glätten Sie ein Stück Laborband auf die gereinigte Bank.
Legen Sie einen Glasdeckel auf das Band und legen Sie einen zweiten Deckelschlupf in der Nähe. Die gekühlte Agarlösung zu den entsprechenden Antibiotika und der entsprechenden Lösung hinzufügen. Gießen Sie 1,5 Milliliter frisch zubereitete Gellösung auf den über das Band platzierten Deckelschlupf und legen Sie den zweiten Deckelschlupf auf das Gel, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden.
Bringen Sie den Erlenmeyer ins Warmwasserbad zurück und decken Sie die Deckelschlupffürst2 minutenlang ab. Drehen Sie die Abdeckung Slips für eine Stunde Inkubation bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Deckelschlupf vom trockenen Gel entfernen und ein kleines Pad aus der Agarose schneiden.
Während der Inkubation sechs Mikrolitertröpfchen der vorbereiteten bakteriellen Suspension in eine 35-Millimeter-Schale geben und die Tropfen mindestens 15 bis 30 Minuten trocknen lassen. Dann legen Sie das Pad vorsichtig auf ein Tröpfchen von Bakterien und lassen Sie die Proben für 20 Minuten bei Raumtemperatur einstellen. Um das Agarbett ohne Verschmieren der Probe zu platzieren, positionieren Sie das kühle Pad vorsichtig mit sanftem Klopfen auf das Tröpfchen.
Um die Proben abzubilden, entfernen Sie den Kolben aus dem Wasser und lassen Sie die Gellösung auf Körpertemperatur abkühlen. Gießen Sie drei Millimeter des Gels auf den Umfang der Probenplatte. Wenn die Agarose verfestigt ist, versiegeln Sie die Platte mit Klebeband und verwenden Sie eine 25-Spur-Nadel, um mehrere Löcher in das Band zu stecken.
Dann stellen Sie die Platte auf vier Grad Celsius für mindestens 30 Minuten, damit die Agarose vollständig erstarrt, während Zellmitose zu verhindern. Verwenden Sie innerhalb von 24 Stunden ein fluoreszenzkonfokales Mikroskop, um die Probe bei der niedrigsten Vergrößerung zu lokalisieren und das automatische Fokussystem des Mikroskops einzubinden. Tragen Sie Öl auf das entsprechende Ziel auf und verwenden Sie die Plattformsteuerung, um die Platte zu bewegen, um das Öl vorsichtig zu verteilen.
Setzen Sie dann den automatischen Fokus erneut ein und folgen Sie dem Standardvorschlag für Z-Schrittquerschnitte, um das Beispiel abzubilden. Der E.coli sollte als schwarze länschliche Formen auf einem weißen Hintergrund erscheinen. Und der Dynamikbereich der Leuchtdichte sollte eine Spitze in der Mitte zeigen.
Mitoseereignisse können zunächst durch Fluoreszenzmikroskopie nach 30 Minuten nachgewiesen werden. Obwohl einzelne Zellen bei geringer Vergrößerung schwer zu erkennen sind. Bakterielle Zellkulturen, die mit einem falschen Verdünnungsverhältnis hergestellt werden, können eine unveränderliche Anzahl von Zellen aufweisen, und Proben, die ohne Plattenversiegelung hergestellt werden, können eine übermäßige Schrumpfung aufweisen, was zu einem Verlust des Fokus führt.
Zellen können das Gel auch bei der Suche nach Nährstoffen einrücken, was zu einer Stapelung der Bakterienzellen übereinander führt und die Zellmonoschicht kompromittiert, wodurch die Zelldetektion effektiv verhindert und zuverlässige fluoreszierende Signalmessungen durchgeführt werden. Wie aus diesen Daten vorgeschlagen, wirkt sich die Zellstufe im Teilungszyklus nicht auf den Geräuschpegel aus, da verschiedene Flächenbereiche den gleichen Trend aufweisen. Darüber hinaus wird keine wesentliche Änderung des Signal-Rausch-Verhältnisses zwischen GFP und Superfold GFP beobachtet, wie diese repräsentativen Daten zeigen.
Achten Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens darauf, das richtige Verdünnungsverhältnis für den für das Experiment verwendeten Bakterienstamm zu bestimmen. Der Vergleich des Signal-Rausch-Verhältnisses jeder geregelten Schaltung mit dieser Basislinie ermöglicht die Auswahl der besten Leistungsschaltung und kann interessante Phänomene aufdecken
