Dieses Protokoll zielt auf die frage der begrenzten Transplantationsorganversorgung ab, indem es die Bewertung verschiedener kardioprotektiver Konditionierungsstrategien erleichtert, um die Verwendung von Herzen zu ermöglichen, die nach dem Kreislauftod gespendet wurden. Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, das auf Medium eingestellt ist. Nachdem Sie eine fehlende Reaktion auf Zehenstiche bei einer anästhesierten erwachsenen Ratte bestätigt haben, legen Sie eine rektale Temperatursonde ein.
Befestigen Sie einen transdermalen Pulsoximetersensor an einer Hinterpfote und bedecken Sie die Ratte mit einem saugfähigen Pad, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Machen Sie einen drei- bis vier Zentimeter großen Mittellinien-Hautschnitt im Hals und verwenden Sie eine stumpfe, gekrümmte Schere, um das unterkutane Gewebe stumpf zu sezieren, um den rechten Sternohyoidmuskel freizulegen. Mit nicht-traumatischen Zangen, bewegen Sie den Muskel seitlich, bis die rechte Halsschlagader, Jugular vene, und Vagusnerv identifiziert werden.
Verwenden Sie eine Schere, um den Vagusnerv sorgfältig von der Halsschlagader zu trennen. Injizieren Sie 2.000 internationale Einheiten pro Kilogramm Heparin in die rechte Jugularvene und üben Sie Druck auf die Injektionsstelle nach dem Nadelrückzug aus, um Blutlecks zu vermeiden. Verwenden Sie gekrümmte Zangen, um zwei 5-0 Seidennähte um die Halsschlagader zu übergeben.
Befestigen Sie die distale Naht fest, um die Halsschlagader am überlegenen Aspekt der exponierten Arterie zu verschließen, die proximale Naht ungebunden zu halten und die Ratte unter ein Stereomikroskop zu stellen. Verwenden Sie dann eine Mikrochirurgie-Schere, um vorsichtig einen Ein-Millimeter-Schnitt über die vordere Wand der Halsschlagader zu machen, und legen Sie einen 22-Spur, ein Zoll geschlossenen intravenösen Katheter in Richtung des Aortenbogens ein. Die Verwendung von Vergrößerungs- und Mikrodissektionswerkzeugen ist für diese Schritte sehr zu empfehlen.
Ein sauberes Feld kann durch Anspannung der proximalen Naht erreicht werden, um Blutungen zu vermeiden. Herzspende ist notwendig, um die ex vivo Cardioplegia Apparat zu montieren. Um das DCD-Protokoll zu initiieren, extubieren Sie zuerst das Tier, dann verwenden Sie Mückenzange, um die Luftröhre zu klemmen, beginnend mit der Agonalphase.
Beginnen Sie mit der Zählung der funktionellen WIT, wenn der systolische Spitzenblutdruck unter 30 Millimeter Quecksilber oder Asystole oder Kammerflimmern fällt, je nachdem, was zuerst eintritt. Führen Sie am Ende von WIT eine mediale Sternotomie durch, wobei Sie den Thorax bei Bedarf mit einem Alm-Retraktor offen halten. Trennen Sie das Herz von den Lungenvenen und anderen thorakalen Strukturen, um die Kardiektomie zu vervollständigen.
Tauchen Sie das Herz sofort in eiskalte Krebs-Lösung für einen schnellen Transport zum ex vivo-System ein. Verwenden Sie eine 2-0 Seidennaht, um die Aorta fest am Langendorff-Apparat zu fixieren, und öffnen Sie dann den Hahn. Öffnen Sie nun den Fluss zur Kanüle vollständig und beginnen Sie die anfängliche Reperfusions- und Stabilisierungszeit.
Drehen Sie das Herz so, dass die Vorhöfe dem Drucksensor zugewandt sind, und sezieren Sie die Lungenvenen, um die linke ventrikuläre Vorhoföffnung bei Bedarf zu erweitern. Legen Sie als Nächstes einen Latexballon ein, der mit einem Drucksensor verbunden ist, um sicherzustellen, dass der Ballon vollständig im Ventrikel positioniert ist. Füllen Sie den Ballon langsam mit Kochsaline, bis der Diastolische Druck am Ende 15 Millimeter Quecksilber erreicht.
Legen Sie die Schrittelektrode in das vordere Gesicht des Herzens ein, ohne die Herzkranzgefäße zu durchkreuzen. Sobald spontanes Schlagen beobachtet wird, stellen Sie das Tempo auf 300 Schläge pro Minute. Nach 10 Minuten Stabilisierung, initiieren Sie die kontinuierliche intraventrikuläre Druckmessung Aufzeichnung, um die Rekonditionierung sanieren und Assessment-Phase zu beginnen.
Nach einer Stunde entfernen Sie das Herz aus dem Langendorff-Gerät und verwenden Sie eine gerade hochkohlenstoffhaltige Stahlklinge, um die Vorhöfe zu entfernen. Mit dem rechten Ventrikel nach unten schneiden Sie ein bis zwei Millimeter dicke querventrikuläre Scheiben. Verbrauchen Sie den rechten Ventrikel aus der dritten Scheibe des Gewebes, und fangen Sie den linken Ventrikel für nachgelagerte biochemische Analysen ein.
Die restlichen Abschnitte in frisch zubereitete 5%TTC-Lösung in PBS für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius untertauchen. Am nächsten Morgen die Proben zweimal in frisches PBS waschen und die Proben zur Bildgebung in frische PBS untertauchen. Lebensfähige Gewebe erscheinen ziegelrot in der Farbe.
Nach der Extubation sinkt der Blutdruck in einem vorhersagbaren Muster rapide und die erwartete Todeszeit beträgt weniger als fünf Minuten. Hier werden durchschnittliche Druck- und Zeitkurven zu Beginn der Rekonditionierung nach Null, 10 und 15 Minuten WIT angezeigt. Die kontraktile Funktion wird sich im Laufe der Zeit verbessern, die Verwendung von kurzen Zeiträumen von WIT wird es ermöglichen, die Kontraktilität wieder normal zu machen, und morphologische Schäden werden nicht nachweisbar sein.
Die Verwendung eines mit der Kardioplegie und in der Stabilisierungsphase hinzugefügten Konditionierungsmittels zeigte, dass die durch 15 Minuten WIT in diesem Modell verursachten Schäden durch kardioprotektive Mittel modulationsfähig sind. Diese Technik ermöglicht die vollständige Kontrolle aller relevanten Variablen und pharmakologischen und nichtpharmakologischen Interventionstests und kann in größeren Modellen reproduziert werden, was die klinische Übersetzung erleichtert.
