Dieses Protokoll beschreibt, wie die AFM-Ausleger am besten mithilfe einzelner T-Zellen und Feststoffpartikel funktionalisiert werden können. Diese Tipps können dann verwendet werden, um ein paar dendritische Zell-T-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen und zelluläre Reaktionen von wankelmütiger Größe zu überwachen. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen biokompatiblen Klebstoff für die Einzel-T-Zell-Funktionalisierung von Auslegern verwendet.
Dieser Klebstoff ist inert zu eukaryotischen Zellen, so dass T-Zellen in ihrer Basisaktivierungsphase zu halten. Diese Methoden geben Einblick in die Aktivierung von Immunzellen und komplexe interzelluläre Ereignisse, wie z. B. die Immunsynapsebildung. Die Methoden können auch auf andere Systeme mit Zell-Zell- oder Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen ausgedehnt werden.
Für jemanden, der neu in dieser Technik ist, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die T-Zellen in gutem Zustand vor der Verwendung sind und dass sie mit IL-2 über Nacht vorbehandelt werden. Darüber hinaus, bei der Verwendung der biokompatiblen Klebstoff, schnell bewegen, um es vor unnötiger Oxidation zu schützen. Bereiten Sie die einzelnen T-Zellen für die Mikroskopie vor, indem Sie das Textprotokoll folgen.
Dann bereiten Sie Glasabdeckungen mit DC2.4-Zellen gesät, und bebrüten die Zellen über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius und 5%CO2. Reinigen Sie weiche, spitzenlose Ausleger mit einer niedrigen Federkonstante mit Piranha-Behandlung, Plasmareinigung oder UV-Ozonreinigung. Montieren Sie dann den gereinigten Ausleger am AFM-Scankopf.
Als nächstes bereiten Sie eine saubere Probenkammer vor und füllen Sie sie mit reinem Wasser. Kalibrieren Sie den Ausleger in der Wasserlösung, indem Sie zunächst eine Kraftkurve auf dem Glassubstrat laufen lassen, um die Empfindlichkeit des Auslegers zu erhalten. Zeichnen Sie dann ein thermisches Geräuschspektrum auf, um die Federkonstante zu extrahieren.
Wenn der Ausleger richtig kalibriert ist, entfernen Sie den AFM-Scankopf aus der Lösung. Waschen Sie den montierten Ausleger mit ein paar Tropfen reinem Ethanol und halten Sie den Ausleger trocken auf dem Scankopf. Ein Lebendzellen-Umgebungsgehäuse mit 5% CO2 auf 37 Grad Celsius vorheizen.
Dann montieren Sie den mit DC2.4-Zellen gesäten Glasdeckel in die Probenkammerbaugruppe und fügen Sie der Kammer sofort 600 Mikroliter Medium B hinzu. Platzieren Sie die fertige Baugruppe auf der AFM-Beispielstufe. Fügen Sie menschliche IL-2-inkubierte CD4-positive T-Zellen in die Probenkammer ein.
Warten Sie, bis die Ziel-T-Zellen vollständig auf der Unterseite des Coverslips abgerechnet sind, und bringen Sie die Zellen dann unter dem Mikroskop in das Sichtfeld. Fügen Sie nun einen zweiMikroliter Tropfen biokompatiblen Kleber mit einer Pipette auf das Ende des montierten Auslegers. Sobald der biokompatible Kleber auf den Ausleger aufgebracht wurde, müssen die nachfolgenden Schritte so schnell wie möglich abgeschlossen werden, um die Haftung zu maximieren.
Legen Sie den Scankopf schnell auf die Probenbühne und tauchen Sie den mit Klebstoff beschichteten Ausleger in die Lösung ein. Verschieben Sie die Probephase, bis sich eine Integritätszelle T unter der Spitze des Auslegers befindet. Passen Sie dann ihre Position fein an, indem Sie den Scankopf bewegen.
Als nächstes senken Sie den Ausleger manuell. Beginnen Sie mit einer 50-Mikron-Schrittgröße, und verringern Sie dann auf 10, fünf und zwei und schließlich 0,5 Mikrometer allmählich, wie durch die Schärfe des Auslegerbildes angezeigt. Halten Sie nun die Position der Schrittmotoren und passen Sie die Positionierung des Scankopfes an, um die Auslegerspitze und die Zelle besser auszurichten.
Fahren Sie fort, bis ein fester Kontakt durch eine kleine Verschiebung der Position des Lasers angezeigt wird, was einer typischen Kraft von 0,5 bis 1,5 Nanonewton entspricht. Nach 30 Sekunden Kontakt den Ausleger zurückziehen. Wenn sich die Zelle mit dem Ausleger bewegt, war die Anlage erfolgreich.
Wenn nicht, wiederholen Sie den Haftschritt bis zu dreimal, bevor Sie zu einem neuen Ausleger wechseln. Positionieren Sie die angeschlossene T-Zelle über einer DC2.4-Zelle, indem Sie die Probenstufe und den Scankopf bewegen. Führen Sie nach dem Einrichten der richtigen Parameter die Kraftspektroskopie über die Probe aus.
Für eine neue Sondierungsrunde montieren Sie einen neuen, sauberen Ausleger. Kalibrieren Sie es in reinem Wasser, und gehen Sie dann zurück zu einem T-Zell-dendritischen Zellpaar und wiederholen Sie den Scan. Montieren Sie einen gereinigten Glasdeckel an der Probenkammerbaugruppe.
Fügen Sie auf der linken Seite des Deckels einen Tropfen einer Ink.-Lösung hinzu, die in Ethanol verdünnt wurde und Polystyrolperlen mit sechs Mikrometern Durchmesser enthält. Sobald das Lösungsmittel verdampft, überprüfen Sie den Abstand der Perlen mit einem Hellfeldmikroskop, das mit einem 20-fachen Objektiv ausgestattet ist. Stellen Sie sicher, dass die einzelnen Perlen gut getrennt sind.
Dann tauchen Sie eine Mikropipette-Spitze oder einen Zahnstocher in einen gut gemischten Epoxidkleber und übertragen Sie eine kleine Menge des Klebers an drei separate Stellen mit aufeinanderfolgenden sanften Berührungen auf der rechten Seite, aber in der Nähe der Mitte des Coverslips, wie hier gezeigt. Als nächstes montieren Sie einen gereinigten, spitzenlosen Ausleger am AFM-Scankopf und kalibrieren Sie ihn in Luft mit einer sauberen Oberfläche, um die Federkonstante zu erhalten. Positionieren Sie dann die Auslegerspitze über die linke Grenze des letzten Epoxid-Kleberflecks und bringen Sie den Ausleger langsam in die Nähe des Klebers mit kleinen Schrittgrößen auf den Schrittmotoren.
Sobald der Kontakt mit dem Kleber hergestellt wurde, ziehen Sie den Ausleger schnell seitlich, indem Sie den AFM-Scankopf nach hinten bewegen. Entfernen Sie überschüssigen Kleber, indem Sie ihn gegen das Glas reiben, so dass nur eine winzige Menge des Klebers am Ende der Spitze übrig bleibt. Bewegen Sie nun die Auslegerspitze auf eine gut isolierte Perle.
Nähern Sie sich der einzelnen Perle langsam, und machen Sie einen festen Kontakt mit ihm im Bereich von zwei bis fünf Nanonewton für etwa 10 Sekunden. Verwenden Sie beim Kontakt die Feinspitzeneinstellung, um die Perle ganz am Ende der Spitze zu positionieren. Ziehen Sie die Spitze am Ende des Kontakts ein.
Wenn die Perle von der ursprünglichen Brennebene verschwindet, ist ein erfolgreiches Haftungsereignis aufgetreten. Schließlich den perlenmodifizierten Ausleger sorgfältig abmontieren und in einer Auslegerbox über Nacht aufbewahren, damit das Epoxid vollständig aushärtet. Hier sind typische Kraft-Distanz-Kurven aus der Bindungsinteraktion zwischen einer einzelnen T-Zelle und einer einzelnen dendritischen Zelle im Laufe eines Annäherungs-Rückzugs-Zyklus.
Die hellrote Kurve ist die Verlängerungskurve, und die dunkelrote kurve ist die Rückzugskurve. Der Mindestwert in der Kurve gibt ein Maß für die maximale Haftkraft zwischen der T-Zelle und der dendritischen Zelle an, und der Bereich unter der Kurve stellt die Arbeit dar, die erforderlich ist, um sie zu trennen. Die scharfen und stufenweisen Bruchereignisse können als Membranbinden interpretiert werden, die aufgrund der starken Bindung an der Zell-Zell-Schnittstelle von der Zelloberfläche herausgezogen werden und dann diskret unter dem kontinuierlichen Ziehen brechen.
Hier wird die konventionelle T-Zellbindung an dendritische Zellen in Grau und die regulatorische T-Zellbindung an dendritische Zellen blau dargestellt. Die Haftkräfte zwischen einer konventionellen T-Zelle und einer regulatorischen T-Zelle erkennen Peptid-Antigene, die von Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden, während regulatorische T-Zellen Suppressor-T-Zellen sind, die die konventionelle T-Zell-vermittelte Immunität gegen Ende einer Immunreaktion herunterfahren. Dieser Schaltplan einer fluoreszierend beschrifteten, phagozytischen RAW264.7-Zelle zeigt, wie die Zelle mit einem einzigen nackten, sechsMikron-Durchmesser, der Polystyrolperle, angegangen wird.
Beim Eingreifen der Perle wird Membran PIP2 an der Kontaktstelle in der Nähe von b sortiert, was dann die Rekrutierung von Moesin durch Membran induziert, was zu einem phagozytischen Ereignis führt. Zusätzlich zu dem hier beschriebenen Verfahren kann die AFM-basierte Einzelkraftspektroskopie zusammen mit Fluoreszenz-Bildgebung verwendet werden, um die Immunzellaktivierung in Echtzeit auf einzelzelliger Ebene zu untersuchen. Kombinierte Fluoreszenztechniken, diese Methode ermöglicht die Adressierung komplexerer zellulärer Prozesse in Echtzeit, wie die Bildung einer Immunsynapse zwischen dendritischen Zellen und T-Zellpaar.
