يصف هذا البروتوكول أفضل طريقة لإضفاء الطابع الوظيفي على الـ AFM باستخدام خلايا T واحدة وجزيئات صلبة. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه النصائح للتحقيق في زوج واحد تفاعلات خلية تيتشاندريتي الخلية T ورصد الاستجابات الخلوية من حجم متقلب، على التوالي. ومن المزايا الرئيسية لهذه التقنية أنه يستخدم الغراء compatible لوظيفية خلية T واحدة من cantilevers.
هذا الغراء هو خامل للخلايا eukaryotic، وبالتالي الحفاظ على الخلايا التائية في مرحلة التنشيط خط الأساس. توفر هذه الطرق نظرة ثاقبة لتنشيط الخلايا المناعية والأحداث المعقدة بين الخلايا، مثل تشكيل المشبك المناعي. ويمكن أيضاً توسيع نطاق هذه الأساليب لتشمل أنظمة أخرى تشمل تفاعلات خلايا الخلية أو سطح الخلية.
بالنسبة لشخص جديد على هذه التقنية، من المهم التأكد من أن الخلايا T في حالة جيدة قبل الاستخدام ومن أن يتم المعالجة المسبقة مع IL-2 بين عشية وضحاها. بالإضافة إلى ذلك، عند استخدام الغراء الحيوي، والتحرك بسرعة لحمايته من الأكسدة غير الضرورية. لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد الخلايا T واحدة للمجهر عن طريق اتباع جنبا إلى جنب في بروتوكول النص.
ثم، إعداد أغطية الزجاج بذر مع الخلايا DC2.4، واحتضان الخلايا بين عشية وضحاها في غرفة مرطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تنظيف لينة، cantilevers تلميح مع ثابت الربيع منخفضة باستخدام علاج البيرانا، تنظيف البلازما، أو تنظيف الأوزون فوق البنفسجية. ثم، قم بتركيب الـ cantilever المنظف إلى رأس المسح الضوئي لـ AFM.
المقبل، وإعداد غرفة عينة نظيفة، وملء ذلك بالماء النقي. معايرة كانتليفر في محلول المياه عن طريق تشغيل أول منحنى قوة على الركيزة الزجاجية للحصول على حساسية من cantilever. ثم، تسجيل طيف الضوضاء الحرارية لاستخراج ثابت الربيع.
عندما يتم معايرة cantilever بشكل صحيح، إزالة رئيس مسح AFM من الحل. اغسل الـ cantilever المثبت ببضع قطرات من الإيثانول النقي، وأبقِ الـ cantilever جافًا على رأس المسح. سخني حاوية بيئة الخلايا الحية إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
ثم، جبل الزجاج coverlip البذور مع الخلايا DC2.4 إلى الجمعية عينة الغرفة، وعلى الفور إضافة 600 ميكرولترات من B المتوسطة إلى الغرفة. ضع التجميع المكتمل على مرحلة عينة AFM. إضافة خلايا T CD4-محتضنة في غرفة العينة IL-2-المحتضنة.
انتظر حتى يتم تسوية الخلايا التائية المستهدفة بشكل كامل على الجزء السفلي من الغطاء ، ثم إحضار الخلايا في مجال الرؤية تحت المجهر. الآن، إضافة قطرة اثنين microliter من الغراء compatible على نهاية cantilever شنت مع ماصة. مرة واحدة وقد تم تطبيق الغراء compatible بيولوجيا إلى cantilever، الخطوات اللاحقة يجب أن تنتهي في أقرب وقت ممكن من أجل تعظيم التصاق.
ضع بسرعة رأس المسح الضوئي على مرحلة العينة ، وغمر الـ cantilever المغلفة بالغراء في الحل. نقل مرحلة العينة حتى يتم وضع خلية T الصحة تحت غيض من cantilever. ثم، ضبط بدقة موقفها عن طريق تحريك رئيس المسح الضوئي.
بعد ذلك، خفض كانتليفر يدويا. تبدأ مع حجم خطوة 50 ميكرون، ثم تنخفض إلى 10، خمسة، واثنين، وأخيرا 0.5 ميكرون تدريجيا، كما هو مبين من حدة الصورة cantilever. الآن، عقد موقف المحركات السائر، وضبط وضعية رئيس المسح الضوئي لمحاذاة أفضل تلميح cantilever والخلية.
استمر حتى يتم الإشارة إلى الاتصال الثابت عن طريق إزاحة صغيرة من موضع الليزر ، يقابل قوة نموذجية من 0.5 إلى 1.5 نانوتونات. بعد 30 ثانية من الاتصال، تراجع عن المكنة. إذا تحركت الخلية مع cantilever، كان المرفق بنجاح.
إذا لم يكن كذلك، كرر خطوة التصاق تصل إلى ثلاث مرات قبل التحول إلى كانتليفر جديدة. ضع الخلية T المرفقة فوق خلية DC2.4 بتحريك مرحلة العينة ورأس المسح الضوئي. بعد إعداد المعلمات المناسبة، تشغيل الطيفية قوة عبر العينة.
لجولة جديدة من التحقيق، جبل جديدة، cantilever نظيفة. معايرته في الماء النقي، ثم العودة إلى زوج خلية T-dendritic وكرر المسح الضوئي. جبل أغطية الزجاج تنظيفها إلى الجمعية غرفة عينة.
إلى الجانب الأيسر من الغطاء، إضافة قطرة من محلول الخرز التي تم تخفيفها في الإيثانول ويحتوي على حبات البوليسترين قطرها ستة ميكرون. بمجرد أن يتبخر المذيب ، تحقق من تباعد الخرز باستخدام مجهر حقل مشرق مجهز بهدف 20x. تأكد من أن يتم فصل الخرز الفردية بشكل جيد.
ثم، تراجع تلميح micropipette أو مسواك في الغراء الايبوكسي مختلطة جيدا، ونقل كمية صغيرة من الغراء إلى ثلاث بقع منفصلة مع اللمسات لطيف المتعاقبة على الجانب الأيمن ولكن على مقربة من وسط الأغطية، كما هو مبين هنا. بعد ذلك، قم بتركيب علبة نظيفة، غير طرف إلى رأس المسح الضوئي لـ AFM، ومعايرتها في الهواء بسطح نظيف للحصول على ثابت الربيع. ثم، موقف تلميح cantilever على الحدود اليسرى من بقعة الغراء الايبوكسي الماضي، وجلب ببطء cantilever قريبة من الغراء باستخدام أحجام خطوة صغيرة على المحركات السائر.
مرة واحدة وقد تم الاتصال مع الغراء، وسحب بسرعة cantilever بشكل كبير عن طريق تحريك رئيس المسح AFM إلى الوراء. إزالة أي الغراء الزائد عن طريق فرك تشغيله ضد الزجاج، وترك سوى كمية صغيرة من الغراء في نهاية الحافة. الآن، نقل تلميح cantilever على رأس حبة معزولة بشكل جيد.
الاقتراب من حبة واحدة ببطء، وجعل اتصال ثابت معها في حدود اثنين إلى خمسة نانوتونات لمدة 10 ثانية تقريبا. أثناء إجراء الاتصال، استخدم ضبط البقشيش الدقيق لوضع الخرزة في نهاية الطرف. سحب الطرف في نهاية جهة الاتصال.
إذا اختفى الخرز من الطائرة البؤرية الأصلية، حدث حدث التصاق ناجح. وأخيرا ، demount cantilever تعديل حبة بعناية ، وتخزينها في مربع cantilever بين عشية وضحاها لايبوكسي لعلاج تماما. هنا منحنيات المسافة القوة النموذجية من تفاعل الربط بين خلية T واحدة و خلية تسخين واحدة على مدى دورة واحدة من نهج التراجع.
المنحنى الأحمر الفاتح هو منحنى التمديد، والأحمر الداكن هو منحنى التراجع. القيمة الدنيا في المنحنى تعطي قياس قوة التصاق الحد الأقصى بين الخلية T وخلية التسخين، وتمثل المساحة تحت المنحنى العمل المطلوب لفصلها. ويمكن تفسير أحداث تمزق حاد وتدبقية كما الحبال غشاء يجري سحبها من سطح الخلية بسبب الربط قوية في واجهة الخلية الخلية ومن ثم كسر بشكل منفصل تحت سحب المستمر.
هنا، يتم إظهار ربط الخلية T التقليدية إلى خلايا dendritic باللون الرمادي، ويتم عرض ربط خلية T التنظيمية إلى خلايا dendritic باللون الأزرق. قوى الالتصاق بين خلية T التقليدية والخلايا T التنظيمية تعترف مستضدات الببتيد التي تقدمها الخلايا المستضدية، في حين أن الخلايا T التنظيمية هي الخلايا التائية القامع التي تغلق مناعة الخلايا التائية التقليدية بوساطة الخلايا نحو نهاية رد فعل مناعي. هذا التخطيطي من الخلايا الفلورية المسماة، الفراتوسية الخام 264.7 يظهر الخلية التي اقترب مع واحد عارية، قطر ستة ميكرون، حبة البوليسترين.
عند إشراك الخرزة ، يتم فرز غشاء PIP2 في موقع الاتصال ، بالقرب من b ، مما يحفز بعد ذلك التوظيف الغشائي للموريسين ، مما يؤدي إلى حدث بَلَمَي. بالإضافة إلى الإجراء الموضح هنا، يمكن استخدام التحليل الطيفي للقوة أحادية الخلية المستندة إلى AFM مع تصوير الفلوريس لدراسة تنشيط الخلايا المناعية في الوقت الحقيقي على مستوى الخلية الواحدة. تقنيات الفلوريسنس المشتركة، وهذا الأسلوب يسمح لمعالجة العمليات الخلوية أكثر تعقيدا في الوقت الحقيقي، مثل تشكيل المشبك المناعي بين خلية التشجر والخلايا T زوج.
