Lückenkreuze wurden als Drogenziele vorgeschlagen. Der Iodide-YFP-GJIC-Assay ist mit einem Hochdurchsatz-Screening kompatibel, um Lückenknotenmodulatoren zu entdecken. Es wurde verwendet, um die Auswirkungen einer großen Anzahl von Verbindungen auf LückenknotenAktivitäten in relativ kurzer Zeit zu testen.
Der Iodide-YFP-GJIC-Test ist einfach, robust, wiederholbar und kostengünstig. Dieser Test erfordert nur Akzeptor- und Spenderzellen und zwei ausgewogene Salzlösungen. Es werden keine zusätzlichen Reagenzien wie Luzifergelb und Calcein AM benötigt.
Auch misst es die Gesamtlücken-Kreuzungsaktivitäten der Zellen in einem einzigen Brunnen, was zu einer geringen Variabilität zwischen den Brunnenführt führt. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, wachsen LN215-Zellen in ergänzter DMEM auf 80 %, wie im Textprotokoll beschrieben. Einen Tag vor der Transduktion waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Milliliter PBS.
Fügen Sie zwei Milliliter 0,25% Trypsin EDTA zu den Zellen hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette setzen Sie die Zellen in fünf MilliliterKulturmedium wieder auf und passen die Zelldichte auf 50 000 Zellen pro Milliliter an. Fügen Sie 400 Mikroliter Medien, die 20.000 Zellen enthalten, zu jedem Brunnen einer 24-Well-Kulturplatte hinzu.
24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag werden zwei Brunnen durch 400 Mikroliter einer Eins-zu-eins-Mischung aus Lentivirus und frischem Kulturmedium, ergänzt durch Polybren, in einer Endkonzentration von vier Mikrogramm pro Milliliter ersetzt. Für die no virus controls ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Kulturmedium, ergänzt durch Polybren bei einer Endkonzentration von vier Mikrogramm pro Milliliter.
15 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dann aspirieren Sie das Medium mit Lentiviren und frisches Kulturmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für weitere 72 Stunden.
Danach die Zellen in jedem Brunnen zweimal mit 0,5 Milliliter PBS waschen. Fügen Sie 300 Mikroliter 0,25%Trypsin EDTA zu den Zellen hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Setzen Sie die Zellen in zwei Milliliter Kulturmedium aus, und verkleben Sie sie dann in Sechs-Well-Kulturplatten mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Puromycin.
Kultur die Zellen, bis alle Zellen in den Kontrollbrunnen tot sind, was in der Regel etwa eine Woche dauert. Erstens, separat Kultur LN215-YFP und LN215-iodid Zellen in 100-Millimeter-Platten in Kulturmedium, um die Populationen für den Test erforderlich zu erreichen. Einen Tag vor dem Test, waschen Sie jede Platte mit 10 Milliliter PBS.
Behandeln Sie jede Platte mit zwei Millilitern 0,25%Trypsin EDTA-Lösung, und inkubieren bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Die Zellen in vier MilliliterKulturmedium wieder aufsetzen und in ein 15-Milliliter-Konikonröhren übertragen. Zentrifugieren Sie bei 1.000 g für drei Minuten, um die Zellen zu pellet.
Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie jedes Zellpellet in fünf Milliliterkulturmedium. Pipette auf und ab etwa 20 Mal, um alle Zellklumpen zu brechen. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen.
Und dann verdünnen Sie die Zellen in Kulturmedium, um Zellsuspension an den hier gezeigten Dichten zu machen. Als nächstes mischen Sie sieben Milliliter jeder Zellsuspension in einem Reservoir zusammen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 100 Mikroliter dieser Mischung zu jedem Brunnen einer 96-Well-Kulturplatte hinzuzufügen.
Inkubieren Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Verwenden Sie zunächst ein Fluoreszenzmikroskop mit 20-facher Vergrößerung und einen GFP-Filter, um die 96-Well-Platten zu überprüfen, um sicherzustellen, dass es keine Zellklumpen gibt und dass die Kulturen vollständig konfluent und gut verteilt sind. Mindestens 30 Minuten vor dem Test ein Mikroplattenleser einschalten und auf 37 Grad Celsius einstellen.
Waschen Sie die Schläuche eines automatisierten Injektors mit drei Millilitern 70%Ethanol, drei Milliliter destilliertem Wasser und drei Milliliteri I-Lösung. Als nächstes wärmen Sie die C- und I-Lösungen in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Entweder das Wachstumsmedium ansaugen oder die Platte umkehren, um sie zu entleeren.
Tippen Sie auf ein beliebiges Restmedium. Fügen Sie dann die C-Lösung zu einem Reservoir mit einer Mehrkanalpipette hinzu, um 200 Mikroliter C-Lösung zu jedem Brunnen der Platte hinzuzufügen. Entweder die Lösung ansaugen oder die Platte umkehren, um sie zu entleeren, so dass jede Restlösung abklopfen.
Fügen Sie 50 Mikroliter C-Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Dann fügen Sie einen Mikroliter eines 2,5-Millimolaren chemischen Lagers oder DMSO als Fahrzeug hinzu und fügen Sie jedem Brunnen weitere 50 Mikroliter C-Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in der Luft für etwa 10 Minuten.
Beginnen Sie während der Inkubation mit dem Festlegen der Parameter im Mikroplattenleserprogramm, indem Sie auf die Schaltfläche Protokolle verwalten klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neu. Wählen Sie die Fluoreszenzintensität im Abschnitt Messmethode und den Brunnenmodus im Abschnitt Lesemodus aus.
Klicken Sie als Nächstes auf die Schaltfläche OK. Eine neue Registerkarte wird angezeigt. Legen Sie im Menü "Grundparameter" die Anregungswellenlänge auf 485 Nanometer und die Emission auf 520 Nanometer fest.
Wählen Sie die Bodenoptik aus, um die Fluoreszenz von unten zu lesen. Legen Sie dann die Messstartzeit auf Null Sekunden, die Anzahl der Intervalle auf 25, die Anzahl der Blitze pro Bohrwert und das Intervall auf 20 und die Intervallzeit auf 0,4 Sekunden fest. Zeichnen Sie im Menü Layout einen Bereich der zu lesenden Platte.
Im Menü Konzentrationen/Volumen/Shacking stellen Sie den Mikroplattenleser so ein, dass 100 Mikroliter I-Lösung mit einer Injektionsgeschwindigkeit von 135 Mikrolitern pro Sekunde in jeden Brunnen injiziert werden. Legen Sie im Menü Injektionszeit die Startzeit der Injektion auf eine Sekunde fest. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Messung starten.
Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, übertragen Sie die 96-Well-Platten auf den Mikroplattenleser und starten Sie die Messung, indem Sie erneut auf die Schaltfläche Messung starten klicken. In dieser Studie wird der jodgelbe fluoreszierende Protein-Lücke-Knoten-Interzelluläre Kommunikationstest mit LN215-YFP und LN215-Jodzellen verwendet, um 2, 320 Chemikalien zu untersuchen, um neuartige Lückenknoten-intrazelluläre Kommunikationsmodulatoren zu identifizieren. Homosalat wird gesehen, um 50% der Lücke Kreuzung intrazelluläre Kommunikation zu hemmen.
Während Terbinafine es vollständig hemmt. Dies bestätigt Terbinadin als Lückenknotenhemmer. Dieser Test misst GJIC zwischen benachbarten Spender- und Akzeptorzellen, so dass die Spender- und Akzeptorzellen vor der Beschichtung vollständig getrennt werden müssen.
Und der Zusammenfluss der Mischkultur sollte 100%, um die Bildung von Spaltverbindungen zwischen Zellen zu maximieren. Zeitverlaufsdaten, Dosisreaktionsbeziehungen und die Beurteilung der Reversibilität von Gap Junction Modulatoren können mit Iodide-YFP-GJIC-Assay ermittelt werden. Außerdem können Iodide-YFP-spezifische Connexin-GJIC-Assays erstellt werden, indem die Expression eines Voninteressesins in die Zellen ohne funktionelle Spaltverbindungen induziert wird.
Dadurch ist es möglich, den IC50-Wert einer Chemikalie eines bestimmten Connexintyps zu bestimmen. Der Iodide-YFP-GJIC-Assay kann für das Screening mit hohem Durchsatz verwendet werden, da er robust, wiederholbar und kostengünstig ist. Diese Assays helfen, Lückenknoten modulierende Chemikalien für die Entdeckung von Arzneimitteln und toxikologische Bewertung zu finden.
