We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen&#8217;s University.

1. Ausplattieren der Zellen in der Elektroporation Chambers <ol><li> In einer Laminar-Flow-Haube, trypsinieren die Zellen unter Verwendung von sterilen Technik wie gewohnt. HINWEIS: Es ist sehr wichtig, um durch Zentrifugation beseitigt alle Spuren von Trypsin, weil sie verhindern Ausbreitung der Zellen auf dem Glas, damit die Bildung von adherens und Gap Junctions. </li><li> Pipette 1 ml der Zellsuspension in sterilen Kammern Elektroporation mit dem in-situ-Elektroporator (Figur 1), und in ein 37 ° C, CO 2-Inkubator gestellt. HINWEIS: Die Zelladhäsion durch Plattieren auf Fibronektin, Kollagen, Poly-Lysin oder Zell-und Gewebekleber (siehe Materialien Table) verbessert werden. </li><li> Wenn die Zellen eine konfluente Schicht gebildet sie sind bereit für GJIC Prüfung. </li></ol> 2. Verfahren der Elektroporation Elektroporation für GJIC Prüfung kann außerhalb einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden,da es dauert nur ein paar Minuten. Wenn längere Inkubationszeiten für ein bestimmtes Experiment erforderlich ist, dann kann es vollständig in einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt werden. In allen Fällen müssen die Kammern, in denen die Zellen gezüchtet steril sein. <ol><li> Bereiten Sie eine 5 mg / ml Lucifer gelb Lösung: 10 mg LY-Pulver (mit dem Elektroporator vorgesehen) in 2 ml calciumfreien Wachstumsmedium. Für Experimente, die längere Inkubationszeiten erfordert, Filter-Lösung sterilisieren und bei 4 o C </li><li> Saugen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit Calcium-freiem Medium, man aufpassen, nicht auf die Monoschicht zerkratzen oder trocknen die Zellen. Wenn die Zellen getrocknet haben sie meist dunkler Kerne und abholen LY ohne Elektroporation. Die Wirkung ist stärker ausgeprägt in der Mitte des Schiebers das mehr Luftzug (4F) ausgesetzt ist. </li><li> Mit einer Eppendorf-Pipette pipettiert die Farbstofflösung auf die Zellen (400 ul für die ganze Kammer), am Rand der Kammer, being darauf, nicht die Zellschicht zu berühren. </li><li> Legen Sie die Kammer, in der mit dem mitgelieferten Halter Elektroporator und wenden Sie einen Impuls von der entsprechenden Stärke (siehe Diskussion). </li><li> Sorgfältig absaugen einige der LY-Lösung. Es kann ein zweites Mal für weniger wichtige Experimente verwendet werden. </li><li> Zusatz von Calcium-freiem DMEM mit 10% dialysierten Serum. </li><li> Die Zellen für 3-5 min im Brutschrank inkubieren, um die Farbstoffübertragung durch Gap Junctions ermöglichen. HINWEIS: Die Einbeziehung der dialysierten Serum an dieser Stelle hilft Porenverschluss. </li><li> Mit Calcium-freiem DMEM für Live Cell Beobachtung waschen Sie die nicht rechtsfähige Farbstoff. Alternativ können die Zellen in diesem Stadium durch Zugabe von 4% Formaldehyd zu der gut fixiert werden kann, und dann mit PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) gewaschen. In allen Fällen muss die Wasch alle Hintergrund zu entfernen. HINWEIS: In Vorversuchen die optimalen Bedingungen zu bestimmen, wenn die Spannung zu niedrig ist, dann ist es möglich, die Zellen zu gewinnen in der incubato zu lassenr für ein paar Minuten und elektroporieren derselben Folie ein zweites Mal, um in den Kosten der Folien zu speichern. </li></ol> 3. Die mikroskopische Untersuchung <ol><li> Beachten Sie die Zellen unter Fluoreszenzbeleuchtung mit einem inversen Mikroskop mit dem geeigneten Filter für die verwendeten Farbstoffs ausgestattet. Lucifer gelb, Anregung 423nm, 555nm Emissions, WBV Filter für eine Nikon IX70 Mikroskop. </li><li> Beseitigen Meniskus Effekte, indem Sie ein Glas Deckglas auf der Oberseite des Kunststoff Nun, nach an die Spitze mit Flüssigkeit zu füllen, um die Zellmorphologie unter dem Phasenkontrast zu untersuchen. Für bessere Bilder kann das auch von der Folie abgenommen werden, und das Deckglas auf dem Rahmen angeordnet. Für feste Zellen, die gut mit Glycerin zur mikroskopischen Beobachtung gefüllt werden, während für lebende Zellen ist es mit Wachstumsmedium gefüllt werden. HINWEIS: Waschen und Fotografieren ist einfacher, wenn die Zellen mit Formaldehyd nach der Übertragung des Farbstoffes (Schritt 2.7 oben) festgelegt. Wenn die Zellen nichtt festgelegt ist, die Fluoreszenz von den Zellen innerhalb von etwa 60 min, je nach Zelltyp, die Spannung und den LY eingeführt, während in fixierten Zellen Fluoreszenz wird für mehrere Stunden beibehalten eliminiert. Allerdings verblasst oder Fluoreszenz verliert sich nach O / N Inkubation, auch in fixierten Zellen. Aus diesem Grund muss Fotografien bald nach der Elektroporation (Figur 2) entnommen werden. </li></ol> 4. Quantifizierung der interzellulären Kommunikation <ol><li> Fotografieren Sie die Zellen mit einem 20x-Objektiv unter Fluoreszenz-und Phasenkontrast (Abbildung 3). </li><li> Identifizieren und markieren mit einem Sternchen die elektroporiert Zellen an der Grenze zu den nicht-elektroporiert Bereich (Abbildung 2, Pfeil, Elektroporation Flanke). </li><li> Identifizieren und Markieren mit einem Punkt auf der fluoreszierenden Zellen nicht elektroporiert Seite, wo der Farbstoff durch Gap Junctions übertragen (3A und 3B). </li><li> Teilen Sie die Gesamtzahl derfluoreszierenden Zellen auf der nicht elektroporiert Bereich durch die Anzahl der elektroporierten Zellen entlang der Kante (3A und 3B). HINWEIS: Der Transfer von mindestens 200 zusammenhängenden elektroporiert Grenzzellen für jedes Experiment berechnet. Die erhaltene Zahl ist der Wert GJIC. </li></ol>

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Kritische Schritte in dem Protokoll Elektroporiert Material Die Reinheit des Materials, elektroporiert werden, ist sehr wichtig. Wenn die Zellen sehr flach sind, müssen dann höhere Konzentrationen des Tracking-Farbstoff verwendet werden (bis zu 20 mg / ml für LY) und in solchen Fällen ist die Reinheit noch wichtiger als in Zellen, die mit einer kugelförmigen Form 1. Neben LY eine große Vielzahl von anderen Farbstoffen oder nonpermeant Moleküle eingesetzt wurden, wie beispielsweise eine Reihe von Alexa-Farbstoffe, um als Sonden für die Kanäle, die aus verschiedenen Connexine 25 verwenden. Jedoch sind Farbstoffe wie Ethidiumbromid oder Propidiumiodid in der DNA interkaliert, so dass die Kerne fluoresziert sehr stark, was die Quantifizierung der Farbstoffübertragung erschwert (4D) ist. Die Tracking-Farbstoffe müssen vorbereitet werden und Waschungen in calciumfreien Wachstumsmedium durchgeführt, weil ein Calcium-Einstrom kann Junction-Kommunikation zu unterbrechen, sowie die Senkung cell Lebensfähigkeit. Alle Lösungen sind bei 37 o C vor der Elektroporation, der Porenverschluss erleichtert und Lebensfähigkeit 1 gehalten werden. Bestimmung der optimalen Spannung und Kapazität Elektrische Feldstärke ist ein kritischer Parameter für die Zelldurchlässigkeit, sowie Lebensfähigkeit. Die Anwendung von Mehrfachimpulsen hat sich gezeigt, bessere Ergebnisse hinsichtlich der Durchlässigkeit und die Lebensfähigkeit der Zellen als eine Einzelimpuls bieten. Die Insitu Porator Vorrichtung Zell Projekte verfügt über drei Einstellungen für Kapazität und Pulszahl: Mild (10 Impulse, 10 us auseinander, 0,1 Sekunden zwischen den Impulsen), Medium (20 Impulse, 80 us auseinander, 0,2 Sekunden zwischen den Impulsen) und Strong (50 Impulse , 120 us auseinander, 0,5 s zwischen den Impulsen), während die Spannung fein unabhängig (2-45V gesteuert werden). In der Tat, flachen Zellen erfordern niedrigere Spannungen als diejenigen verwandelt, Zellen in einem Klumpen oder Zellen mit einem kleinen Klebefläche auf dem Untergrund (zB Sf9-Insektenzellen), Möglicherweise aufgrund der großen Strommengen, die durch einen längeren Zelle, die in Kontakt mit einem leitfähigen Bereich größer ist. Für weitere Details zu diesem Thema finden Sie in 1. Mögliche Probleme und Fehlerbehebung Wenn die Zellen während der Manipulationen abgeschabt wurden, können sie holen die Farbstoff fluoresziert und ohne Elektroporation (4A). Die Menge an Energie an die Zellen geliefert beeinflusst die Effizienz der Elektroporation. Wenn der Impuls zu schwach ist (das heißt, zu niedrige Spannung und Pulseinstellungen), dann erscheinen die Zellen unter dem Phasenkontrast normal, aber sie nicht fluoreszieren, außer vielleicht für bestimmte Zellen tot sind oder während der Handhabung abgeschabt worden ist, kann (4A) . Wenn der Puls zu stark ist, unter dem Phasenkontrast Zellen scheinen sehr dunklen Kernen (4B), aber kann einige LY behalten und sogar erlauben, einige Farbstoffübertragung auf benachbarte Zellen. Am Vorabendn höhere Impulse werden die Zellen zerstört (4C). Solche Zellen werden lysiert, deshalb sind sie nicht LY zurückbehalten und fluoreszieren sehr schwach, wenn überhaupt. Bestimmten epithelialen Zelllinien wie T51B Kalotten Strukturen während Mediumwechsel kommen kann. Die umliegenden Zellen können dann fluoreszieren als der Farbstoff durch Gap Junctions (4E) übertragen werden. Beispiele für optimale Bedingungen für die Elektroporation repräsentativen Linien sind in Tabelle 1 gezeigt. Vorteile gegenüber anderen Techniken und Bedeutung DNA-Einführung Es gibt eine Vielzahl von Transfektions-Protokolle, wie beispielsweise Calcium-Phosphat-Kopräzipitation oder 26 verschiedene Arten von Liposomen. Jedoch kann sie die Zelle in subtiler Weise, die sehr wichtig sein kann, insbesondere für die Signaltransduktion Studien betreffen. Zum Beispiel kann die Tyr-705-Phosphorylierung von dem Signalwandler und Aktivator TranskriptIonen-3 (STAT3), die mit Transkriptions-Aktivität korreliert wird dramatisch durch das Verfahren des Calcium-Phosphat-Transfektion, auch in Abwesenheit von DNA erhöht. Dies könnte aufgrund der Tatsache, daß der Niederschlag verändert Zelle Zelladhäsion und Eingriffs Cadherin, ein bekannter Aktivator Stat3 27 sein. Bestimmte Liposomen hatte eine ähnliche, aber weniger ausgeprägte Wirkung, während Elektroporation oder retrovirale Infektion hatte keinen Einfluss auf Stat3 Stufen 6. Die Einführung von Peptiden Ein übliches Verfahren ist die Konstruktion eines Fusionspeptids mit Sequenzen, die die Zellmembran durchqueren, wie aus der HIV-tat-Gen abgeleitet ist. Jedoch ist die Übertragung durch die Membran ein relativ langsamer Prozess und Signal Inhibierung nicht so wirksam ist. Für die Untersuchung der Sequenz von Ereignissen, die auftreten, Rezeptoraktivierung durch einen Liganden, der die Fähigkeit zur sofortigen Einleitung eines Peptids, bietet Peptidomimetikum oder andere Verbindung eine wichtige Advantage. Elektroporation einer Zelle durchlässigen Peptid auf seine Aufnahme zu beschleunigen, ist nicht möglich, wahrscheinlich, weil die lipophilen Peptid wird in die Zellmembran eingebettet ist, wie mit FITC-gekoppelten Peptide (Raptis, unveröffentlicht) offenbart. Es ist interessant zu bemerken, dass die Hemmung von ERK-Aktivierung durch EGF durch die Verwendung einer Zelle durchlässigen Peptid blockiert die Grb2-SH2-Domäne beispielsweise nur teilweise 28, während der Elektroporation des gleichen Peptids erreicht eine vollständige Hemmung des Signals 29 ( Abbildung 5). Andere Techniken, basierend auf Liposomen sind in der Existenz. Aber sie erlauben nicht die Prüfung von unbehandelten Zellen Seite an Seite mit Behandelten in Verbindung mit Gap Junction Studien, die die stärkste Beweis dafür, dass das Signal Hemmung muss fällig bieten können, um das Material eingeführt (Abbildung 5, verschnörkelten Halterung , c). Gap Junction-Studien Mikroinjektionvon Farbstoffen oder Kratzen Lade werden üblicherweise verwendet, aber sie sind immer Zellschäden einzuführen. Eine andere Technik, fluorescence recovery after photo nicht invasive aber teure Ausrüstung erfordert, und einige Zellen können zu einem Zeitpunkt untersucht werden, während die Bildung von phototoxischen Substanzen kann ein Problem sein. Der Fallschirm-Assay besteht aus Vorspann Zellen mit dem Farbstoff Calcein AM (grün), dann lassen sich die Zellen anhaften, auf einer Zellschicht, wie Gap Junctions bilden innerhalb von 15 min 3 Stunden. Eine große Anzahl von Zellen kann in dieser Weise behandelt werden, aber die Fähigkeit der Zellen, die Gap Junctions in diesem Assay bilden sehr unterschiedlich mit der Zelle 30 ein. Begrenztheit Die erforderliche Spannung ist höher für die Einführung von Molekülen mit großer Größe und elektrische Ladungen. Bei den hohen Spannungen für die Einführung von großen Plasmiden erforderlich ist, kann es einige Zelltod. Die relativen Spannungen für verschiedene Moleküle erforderlichzuvor 9,12 beschrieben. Obwohl wir mit einer bestimmten Elektroporationseinrichtung beschreiben die Elektroporation, ist es möglich, dass jemand erlebt mit Elektrogeräten, um sie mit Hilfe der detaillierten Beschreibung zu machen in 19, oder einen einfacheren Aufbau mit einem Top-Elektrode oberhalb der Zellen, und ätzen mit Säuren 1. Zukünftige Richtungen Software wurden entwickelt, um genau zu quantifizieren GJIC 31. Eine weitere Verbesserung ist die Entwicklung von Quantenpunkten, die fluoreszieren, wenn sie nur in der Zelle, so dass es keine Notwendigkeit, die Personen Farbstoff waschen. Dies vermeidet die Belastung der Wasch, während der Prozess in lebenden, nicht fixierten Zellen in Echtzeit beobachtet werden. Die Einführung von Peptiden an Signalwege unterbrechen ist eine leistungsfähige Methode für die In-vivo-Bewertung der Relevanz der Wechselwirkungen identifiziert unter Verwendung von gereinigten Komponenten. Die Prüfung der Topfrenz verschiedener Peptide, eine spezifische inhibieren ist der erste wichtige Schritt in der Entwicklung der peptidomimetische Arzneimittel, die für die rationelle Behandlung von Neoplasie. Andere Kommentare Die Folien können mit Extran-1000-Lösung mit einer kleinen Pinsel, um die ITO-Oberfläche in der Vertiefung erreichen gewaschen und mit Wasser gespült. Wenn die Zellen auf dem Objektträger fixiert worden ist, kann es notwendig werden, Spuren von Protein mit Trypsin oder anderen proteolytischen Enzymen zunächst zu entfernen. Natriumdodecylsulfat enthaltenden Waschmittel zu vermeiden. Gewaschen Dias können mit Peroxid Gas sterilisiert werden. Es ist jedoch sehr wichtig, um zu vermeiden, das Siegel der auch auf den Objektträger, denn wenn alle LY Lösung Lecks in der Halterung kann es einen Kurzschluss verursachen.

Das Anlegen von elektrischem Strom an eine Zelle die Bildung von Poren in der Zellmembran durch ein Verfahren, genannt Elektroporation. Die Poren ermöglichen den Durchgang von einer Vielzahl von nonpermeant Moleküle durch die Membran. Das elektrische Feld kann präzise gesteuert werden, so daß die gebildeten Poren sind sehr klein und schnell wieder zu schließen, mit minimaler Störung der Zellphysiologie. Interessanterweise können anhaftende Zellen auf einem Objektträger mit einer leitfähigen und transparenten Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichtet und in situ elektroporiert, die auf der Oberfläche, wo sie wachsen angebaut werden, ohne abgelöst zu Suspension elektroporiert werden. Zellen können sehr gut auf dieser Fläche wachsen und wie sie gebunden sind, und erweiterte detaillierte mikroskopische Beobachtung möglich ist. Mit dieser Technik können kleine Moleküle nonpermeant sofort und eingeführt werden, in im wesentlichen 100% der Zellen, die diese Technik besonders für Studien über die Aktivierung comp machtonents eines Weges folgenden Liganden Stimulation eines Rezeptors (Übersicht in 1). Elektroporation wurde hauptsächlich für die Einführung von DNA (auch Elektrotransfektion) verwendet. Jedoch kann die Elektroporation in situ wertvoll für die Einführung einer großen Vielfalt von Molekülen, wie Peptiden 2-4, Oligonukleotide, wie Antisense-RNA, Doppelstrang-DNA-Decoy-Oligonukleotide zur Hemmung der Bindung von Transkriptionsfaktoren oder siRNA 3,5, 6, radioaktive Nukleotide 7-10, Proteine ​​11 12 oder 13 Pro-Drugs. Nach der Elektroporation können Zellen für biochemische Analysen lysiert oder fixiert und mit Antikörpern gefärbt. Die leitfähige ITO-Beschichtung ist sehr dünn, 800-1,000Å, so dass das Zellwachstum wird durch die Höhendifferenz der beiden Oberflächen gestört, da die Zellen wachsen über die Kante der leitenden Beschichtung. Dies bietet den Vorteil, dass nicht-electroporated Zellen elektroporiert mit denen gezüchtet werden Seite an Seite, um als Kontrollen dienen. Der gleiche Ansatz kann für die Prüfung von Gap Junction, interzelluläre Kommunikation (GJIC) verwendet werden, wie im Video beschrieben. Gap junctions sind Kanäle, welche die Innenräume von benachbarten Zellen 14. Gap Junction, spielt der interzellulären Kommunikation eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung und Metastasierung, während Onkogene wie Src unterdrücken GJIC 15,16. Zu prüfen GJIC einen fluoreszierenden Farbstoff, wie Lucifer Gelb (Ly) wird oft in kultivierte Zellen durch Mikroinjektion eingeführt oder kratzen Lade 17 und der Diffusion des Farbstoffs in die benachbarte Zellen mikroskopisch unter Fluoreszenzbeleuchtung beobachtet. Diese Techniken führen jedoch unweigerlich Zellschäden. Wir beschreiben nun ein Verfahren, bei dem Zellen auf einem Objektträger, der teilweise mit ITO beschichtet 18 gewachsen. Ein elektrischer Impuls wurde in Gegenwart von LY (oder anderen Farbstoffen) eingesetzt camit ihr Eindringen in die Zellen wachsen auf dem leitfähigen Teil des Schlittens, während die Farbstoffwanderung zu den benachbarten, nicht-elektroporierten Zellen wurde mikroskopisch durch Fluoreszenz-Beleuchtung beobachtet. Um störende empfindlichen Zellen, die dazu neigen, von der Monoschicht trennen zu vermeiden, um eine Anordnung entworfen, die nicht eine Elektrode erforderlich war oben auf die Zellen, um den elektrischen Strom 19 gelten platziert werden. Dieser Ansatz bietet die Möglichkeit, GJIC in einer großen Anzahl von Zellen zu quantifizieren, ohne nachweisbare Störungen der Zellstoffwechsel, da durch das Fehlen einer Wirkung auf die Länge der G1-Phase nach der Serumstimulation 12 angedeutet, Erhöhung des Niveaus der fos Protoonkogen Protein (Raptis, unveröffentlicht) oder zwei Kinasen mit zellulären Stress, der p38-Schwein oder JNK / SAPK-Kinase-1 verbunden. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen den Ebenen der Onkogenexpression, Transformation und GJIC 18, sowie die Wirkung von Src und STAT3 auf GJIC in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Zellen aus Lungentumorproben 20-23 frisch kultiviert. Zusätzlich wird in situ Elektroporation mit dem beschriebenen Aufbau, der eine obere Elektrode wurde erfolgreich für den Nachweis der Gap-junction-Verschluss auf Adipozyten Differentiation eingesetzt fehlt, wobei die Zellanhaftung an das Substrat ist in diesem Stadium 19,24 verringert.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td><td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM without Calcium</td><td>Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>Donor Calf Serum&amp;nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td><td>Cat.# B15-008</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td><td>Cat.# A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation apparatus</td><td>Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/</td><td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-04-CC</td><td>4-wells</td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-08-CC</td><td>8-wells</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-25-LY</td><td>High purity</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>Cell and tissue adhesive</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

a functional assay for gap junctional examination; electroporation of adherent cells on indium-tin oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

Abbildung 2 zeigt Rattenleberzellen epithelialen T51B 22, mit LY elektroporiert und unter Fluoreszenz (Panel A und B) fotografiert oder Phasenkontrast-(C) Beleuchtung, nach Fixierung und Waschen. In Abbildung A ist die Kante des elektroporiert Bereich rot markiert. Die Steigung der Fluoreszenz rechts von der roten Linie zeigt Übertragung über Gap Junctions. In 3A und 3B ist die Quantifizierung von Gap Junction-Kommunikation gezeigt: Die Zellen auf den Rand des elektroporierten Bereich identifiziert und mit einem Stern markiert, während die Zellen, in denen der Farbstoff übertragen waren, wurden mit einem Punkt markiert. Das Verhältnis zeigt die durchschnittliche Anzahl von Zellen, die den Farbstoff in über pro elektroporiert Grenzzelle. In diesem Beispiel gibt es 57 Punkte und 10 Sternen, dh GJIC = 5,7. In C und D, der Signalgeber und Aktivator der Transkription-3 (Stat3) in T51B Zellen herunterreguliert worden turch stabile siRNA Ausdruck mit einem lentiviralen Vektor, und dies bewirkt eine Verringerung GJIC, wie durch die Abwesenheit von Über 22 gezeigt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51710/51710fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Die Elektroporation Elektrode und Schlittenanordnung. (A) Draufsicht: Die Zellen werden auf einem Glasträger aufgewachsen, mit leitfähigen und transparenten Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichtet ist. Ein Kunststoffkammer auf dem Objektträger verbunden ist, um einen Behälter für die Zellen und LY bilden. Der Überzug ist Laser-geätzt in einer geraden Linie in der Mitte, im wesentlichen zwei Elektroden bildet. Ein Damm wird verwendet, um die aktuellen nach oben umzuleiten, wodurch ein scharfer Übergang der elektrischen Feldstärke. Nicht-leitende Bereiche bereitzustellen, wird die ITO auch in zwei Rechtecke geätzt. Strom (rote Pfeile) von dem Impulsgenerator fließt von jedem Kontaktpunkt zum anderen, über eine leitende Autobahn zwischen den Rechtecken, die Verbreitung in einer direktenIonen parallel zu der Mittelbarriere, dann über den Damm durch das Medium zu der anderen Seite, Elektroporation der Zellen in Bereichen parallel zum Damm. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist das vordere Teil der Kammer entfernt wird (B) Seitenansicht.: Der Objektträger mit den Zellen wachsen auf der ITO-beschichtete (hellgrün) und geätzt, blanke Glas Regionen gezeigt. (-), Und die Zellen, die in diesem Bereich gebildet wird, wenn das Medium, das LY Elektroporation in die Kammer bis zu einem Niveau oberhalb der Höhe des Dammes dann ein elektrischer Pfad zwischen den Elektroden (+) und zugegeben. Beachten Sie, dass die ITO-Schicht mit übertriebener Dicke der Deutlichkeit halber gezeigt, obwohl seine tatsächliche Dicke (800 A) ist viel geringer als die Dicke der Zellen. (C) Der Bereich der Elektroporation und nicht elektroporierten Zellen vergrößert dargestellt. Der Farbstoff ist dicht in der Nähe der Staumauer, wo alle Zellen wurden durch Elektroporation und blendet über die elektroporiert Kante als die Konzentration schwächt durch mehrere Gap Junction transfERS. Großen Pfeile zeigen die Richtung der Farbübertragungs durch gap junctions. Beachten Sie, dass die Größe und Dicke der Zellen werden zur Verdeutlichung übertrieben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51710/51710fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51710/51710fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Elektroporation von T51B, Rattenleber Epithelzellen. LY wurde in T51B Rattenleber Epithelzellen (mild, 12 Volt) elektroporiert. Nach einer 5 min. Inkubation wurden die Zellen unter Fluoreszenz (A, B) oder Phasenkontrast (C) Beleuchtung fotografiert. Beachten Sie die umfangreiche Übertragung durch Gap Junctions, durch den Gradienten der Fluoreszenz zeigt, die sich von der Kante des elektroporierten Bereich (Pfeile, rote Linie A). Zur gleichen Zeit gibt es keine sichtbare Schädigung der Zellen, ein<html> s unter Phasenkontrast (C) zu sehen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51710/51710fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51710/51710fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Die Quantifizierung von Gap Junction Übertragung. Die Zellen an der Kante der Fläche, die elektroporiert LY durch Elektroporation (Spender von LY den nicht elektroporierten Zellen) aufgenommen wurden mit einem Stern markiert. Zellen, in denen in LY durch gap junctions übertragen wurden mit einem Punkt markiert. In (A) und (B), gibt es 57 Punkte und 10 Sternen, dh GJIC = 5,7. Zellen (C) und (D) nicht über Gap Junctions, wie durch die Abwesenheit eines Gradienten von Fluoreszenz gezeigt. Pfeile zeigen auf die Kante der Fläche elektroporiert. Bar = 100 um.es / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/51710/51710fig4highres.jpg" /> Figur 4 (A) T51B Zellen, die durch Schaben während der Handhabung beschädigt wurden. Diese Zellen können abholen LY auch ohne Elektroporation und kann sie auf ihre Nachbarn durch gap junctions übertragen. (B) und (C) Zellen, die durch einen Impuls, der zu stark beschädigt ist. (B) T51B Rattenleber Epithelzellen wurden bei milden Einstellung elektroporiert , 20 Volt. Die Zellen auf der linken Seite des geätzten Linie (Pfeil) durch Elektroporation beschädigt. In diesem Fall haben sich die Zellen nicht zu lösen, aber ein Blick auf die Phasenkontrastaufnahme (Mitteltafel, weißer Pfeil) zeigt die Zellen, um dunkle Kerne haben, während sie fluoreszieren sehr schwach, wenn überhaupt (oben). Allerdings übertragen thGrob Gap Junctions offensichtlich ist, zu den Zellen auf der rechten Seite, die nicht elektroporiert werden. Die untere Foto wurde durch die Kombination von UV-und Phasenkontrast-Beleuchtung, um die Betrachtung des Randes der Elektroporation erleichtern. (C) T51B Rattenleber Epithelzellen bei mittlerer Einstellung, 30 Volt elektroporiert. Die Zellen auf der linken Seite des geätzten Linie wurden stark von der Puls beschädigt. Beachten Sie, wie die Zellen sich lösen und fluoreszieren nicht. Einige Überlebende um den Rand haben LY (D) T51B Zellen mit 10 ug / ml Propidiumiodid elektroporiert abgeholt und angezeigt werden, auf der Übergabe an ihre Nachbarn auf der rechten Seite über Gap Junctions.. Beachten Sie die intensive Färbung der Kerne. (E) Kuppeln der Epithelzellen. T51B Zellen bei milden Einstellung, 15 Volt elektroporiert. Beachten Sie auch die Elektroporation von Zellen auf der linken Seite. Allerdings, wenn konfluent, T51B Zellen bilden Kuppeln, die während Manipulation und Waschen kommen können, und die umliegenden Zellen kann take bis LY. Beachten Sie die umfangreichen Farbübertragungs. (F) Zellen, die getrocknet sind können abholen LY ohne electroporation.The Wachstumsmedium wurde von T51B Zellen und Zellen entfernt wurden in einer Laminar-Flow-Haube für 30 Minuten verlassen. LY wurde anschließend zu den Zellen für 1 min zugegeben und die Zellen wurden anschließend fixiert, gewaschen und unter dem Fluoreszenz (oben) oder Phasenkontrast-(unten) fotografiert Beleuchtung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51710/51710fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/51710/51710fig5highres.jpg" /> Abbildung 5. Der Grb2-SH2 blocking peptide hemmt EGF-vermittelte ERK-Aktivierung in intakten, lebenden Zellen. Kombination GJIC und Signaltransduktion Studien. Nach Ligandenbindung, eine Anzahl von Wachstumsfaktor-Rezeptoren, wie den epidermalen Wachstumsfaktor Receptor (EGFR) sind trans-phosphoryliert zu spezifischen Tyrosin-Reste. Diese bilden Andockstellen für die Src-Homologie-2-Domänen von Signalgebern, wie Grb2, die den GTP / GDP-Austauschfaktor SOS, die so auf die Membran gebracht wird, und aktiviert Ras gebunden ist. Dies führt zur Aktivierung der Raf / MEK / ERK Kaskade, und die Phosphorylierung von Erk einem P TE P Y Sequenz. Daher Sondieren mit spezifischen Phospho-Erk-Antikörper können ein Maß für die Aktivierung des EGF-Rezeptors. Nach der Fixierung werden die Zellen mit einem Anti-Antikörper Perk (Cell Signaling) sondiert, gefolgt von einem Biotin-gekoppelten sekundären Antikörper, Streptavidin-Horse-Rettich-Peroxidase und Diaminobenzidin-Substrat, das eine braune Farbe 29 gibt. In diesem Experiment wurde ein Phosphopeptid Blockierung der Grb2-SH2-Domäne (PVPE p Y IEQ) durch in situ Elektroporation into NIH 3T3 Zellen, die in Kammern und Elektroporation in verbrauchten Medium wachstums verhaftet. 5 min nach der Impuls Anwendung wurden die Zellen mit EGF für 5 min stimuliert, fixiert, für aktivierte phospho-ERK1 / 2 durch Immunoperoxidase stainingand Zellen aus dem gleichen Gebiet unter Hell (oben) oder Phasenkontrast (unten) fotografiert Beleuchtung sondiert. Beachten Sie, dass die Grb2-SH2 blocking peptide den EGF-Signal drastisch reduziert, dh, Erk-Phosphorylierung (Bereich A). Die Hemmung des Signals erstreckt sich in ~ 3-4 Reihen von benachbarten Zellen in der nicht-elektroporiert Bereich (Zickzackwinkel), wahrscheinlich aufgrund der Bewegung des 1123 Da-Peptid durch gap junctions. Diese Feststellung bildet zwingende Beweise dafür, daß die beobachtete Hemmung muss aufgrund des Peptids, sondern als ein Artefakt der Elektroporation, da Zellen, die in diesem Bereich hat keinen Strom empfangen, aber das Peptid von ihren Nachbarn erfasst. Zur gleichen Zeit gibt es keine nachweisbare Wirkung auf die Zellmorphologievon Phasenkontrast gezeigt. Der Pfeil zeigt auf die Kante der Fläche elektroporiert. Vergrößerung: 240x. Für mehr Details und Kontrollen siehe Referenz 29. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51710/51710fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Aufrufe.  Queen's University. This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Serie: A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Forschung

Genetik

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Biotechnik

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Entwicklungsbiologie

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

Neurowissenschaften

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Biologie

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

<meta charset="utf8"></head><body>TEEI-Methode zur Elektroporationsanalyse und Verabreichungsvorhersage in A431-Zellen

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other types of intracellular delivery, PSEP relies heavily on fluorescent markers and fluorescent microscopy to determine successful delivery. To gain insight into the intermediate steps of the electroporation process, a PSEP platform with integrated transepithelial electrical impedance (TEEI) monitoring was developed. Cells are cultured in commercially available inserts with porous membranes. After a 12 h incubation period to allow for the formation of a fully confluent cell monolayer, the inserts are placed in transfection media located in the wells of the PSEP device. The cell monolayers are then subjected to a user-defined waveform, and delivery efficiency is confirmed through fluorescent microscopy. This workflow can be significantly enhanced with TEEI measurements between pulsing and fluorescent microscopy to collect additional data on the PSEP process, and this additional TEEI data is correlated with delivery metrics such as delivery efficiency and viability. This article describes a protocol for performing PSEP with TEEI measurements.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Optimierung der Elektroporation poröser Substrate durch Mikro- und Nanokanäle für ein verbessertes Monitoring und eine Charakterisierung in d

Porous substrate electroporation (PSEP) pairs consistent, high throughput delivery with high cell viability. Introduction of transepithelial electrical impedance (TEEI) measurements provides insight into the intermediate processes of PSEP and allows for label-free delivery. This article discusses a method for performing PSEP delivery experiments and TEEI measurement analysis simultaneously.

Poröse substratbasierte Elektroporation mit transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other ...

Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

Zusammenfassung

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Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

Entwicklung eines

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Poröse substratbasierte Elektroporation mit transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung

Poröse substratbasierte Elektroporation mit transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung

Poröse substratbasierte Elektroporation mit transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung