갭 접합은 약물 대상으로 제안되었습니다. Iodide-YFP-GJIC 분석은 갭 접합 변조기를 발견하기 위해 높은 처리량 스크리닝과 호환됩니다. 그것은 상대적으로 짧은 기간에 갭 접합 활동에 화합물의 큰 숫자의 효과 테스트 하는 데 사용 되었습니다.
Iodide-YFP-GJIC 분석은 간단하고 견고하며 반복 가능하며 저렴합니다. 이 분석법은 수용자와 기증자 세포와 두 개의 균형 잡힌 염액만 필요합니다. 루시퍼 옐로우 와 칼신 AM과 같은 추가 시약이 필요하지 않습니다.
또한 단일 웰에서 세포의 총 갭 접합 활동을 측정하여 간 가변성이 낮습니다. 이 절차를 시작하려면 LN215 셀을 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 보충된 DMEM의 80%로 증가시합니다. 트랜스듀션 하루 전에 는 PBS의 10 밀리리터로 세포를 두 번 씻습니다.
세포에 0.25%의 트립신 EDTA의 2밀리리터를 추가하고 3분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 10 밀리리터 세로지학적 파이펫을 사용하여 배양 배지의 5밀리리터에서 세포를 재보중단하고 밀리리터당 50, 000 세포로 세포 밀도를 조절한다. 24웰 배양판의 각 웰에 20, 000개의 셀이 포함된 400개의 마이크로리터를 추가합니다.
섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하세요. 다음 날 배양 배지를 렌티바이러스와 폴리브레네로 보충한 신선한 배양 매체의 1대 1 혼합물400 마이크로리터로 교체하여 밀리리터당 4마이크로그램의 최종 농도를 변형시킵니다. 바이러스 제어를 위해 밀리리터 당 4 마이크로 그램의 최종 농도에서 폴리 브레인으로 보충 된 신선한 배양 매체로 배양 매체를 대체합니다.
15시간 동안 섭씨 37도에서 배양하세요. 그런 다음 렌즈 바이러스를 함유 하는 매체를 흡인 하 고 신선한 배양 배지를 흡인. 추가 72 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양.
그 후, PBS의 0.5 밀리리터로 각각 의 세포를 두 번 씻는다. 세포에 0.25%의 트립신 EDTA300 마이크로리터를 추가하고 3분간 섭씨 37도에서 배양합니다. 배양 배지의 2 밀리리터에서 세포를 다시 중단한 다음 푸오마이신의 밀리리터 당 2마이크로그램으로 6웰 배양 판에 접시를 매는다.
제어 우물의 모든 세포가 죽을 때까지 세포를 배양하며, 일반적으로 약 1주일 정도 걸립니다. 첫째, 별도로 배양LN215-YFP 및 LN215-요오드 세포배양 배지에서 100밀리미터 플레이트에 있는 배양배지에 필요한 인구에 도달한다. 분석 하루 전에 각 접시를 PBS 10 밀리리터로 씻으시면 됩니다.
각 플레이트에 0.25%의 트립신 EDTA 용액2밀리리터를 처리하고 5분간 섭씨 37도에서 배양합니다. 배양 배지의 4밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 15 밀리리터 원내 튜브로 이송합니다. 원심분리기는 세포를 펠릿하는 3분 동안 1, 000 g에서.
상체를 버리고 배양 배지의 5 밀리리터에서 각 세포 펠릿을 재연하십시오. 파이펫은 세포 덩어리를 분해하기 위해 약 20 번 위아래로. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.
그리고 배양 배지에서 세포를 희석하여 여기에 도시된 밀도에서 세포 현탁액을 만든다. 다음으로 각 셀 서스펜션의 7밀리리터를 저수지에 함께 섞는다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 이 혼합물의 100마이크로리터를 96웰 배양 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
섭씨 37도에서 24시간 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다. 첫째, 20배율 과 GFP 필터를 사용하여 96웰 플레이트를 확인하여 세포 덩어리가 없고 배양이 완전히 수렴되고 잘 분포되어 있는지 확인합니다. 분석이 마이크로 플레이트 판독기를 켜고 섭씨 37도로 설정하기 최소 30분 전에.
자동화된 인젝터의 튜브를 70%에탄올 3밀리리터, 증류수 3밀리리터, I-솔루션 3밀리리터로 세척합니다. 다음으로, 수조에서 섭씨 37도까지 C와 I-솔루션을 따뜻하게 합니다. 성장 매체를 흡인하거나 접시를 비우기 위해 반전합니다.
잔여 매체를 탭합니다. 그런 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 저장소에 C-솔루션을 추가하여 플레이트의 각 웰에 200 마이크로리터의 C-솔루션을 추가합니다. 용액을 흡인하거나 플레이트를 비우기 위해 플레이트를 반류하여 잔류 용액을 탭합니다.
각 웰에 50 마이크로리터의 C-솔루션을 추가합니다. 그런 다음 2.5 밀리머 화학 주식 또는 DMSO의 마이크로 리터 를 차량으로 추가하고 각 우물에 C 용액 50 마이크로 리터를 추가합니다. 약 10 분 동안 공기에서 섭씨 37도에서 세포를 배양.
인큐베이션 중에 프로토콜 관리 버튼을 클릭하여 마이크로 플레이트 판독기 프로그램의 매개 변수 설정을 시작합니다. 새 단추를 클릭합니다. 측정 방법 섹션에서 형광 강도와 읽기 모드 섹션에서 음 모드를 선택합니다.
다음으로 확인 버튼을 클릭합니다. 새 탭이 나타납니다. 기본 매개 변수 메뉴에서 흥분 파장을 485 나노미터로 설정하고 방출을 520 나노미터로 설정합니다.
하단 광학을 선택하여 아래에서 형광을 읽습니다. 그런 다음 측정 시작 시간을 0초로 설정하고, 간격수가 25로, 우물당 깜박임 수와 간격이 20으로, 간격 시간은 0.4초로 설정합니다. 레이아웃 메뉴에서 읽을 플레이트의 영역을 그립니다.
농도/볼륨/Shacking 메뉴에서 마이크로 플레이트 판독기는 초당 135 마이크로리터의 주입 속도로 각각 100 마이크로리터의 I-솔루션에 주입하도록 설정합니다. 주입 시간 메뉴에서 사출 시작 시간을 1초로 설정합니다. 그런 다음 시작 측정 버튼을 클릭합니다.
인큐베이션이 완료되면 96웰 플레이트를 마이크로플레이트 판독기로 옮기고 시작 측정 버튼을 다시 클릭하여 측정을 시작합니다. 이 연구에서는 요오드-노란 형광 단백질-갭 접합-세포간 통신 분석이 LN215-YFP 및 LN215-요오드 세포와 함께 2, 320화학 물질을 스크린하여 새로운 갭 접합 간 통신 변조기를 식별하는 데 사용된다. 호모살레이트는 세포내 통신의 갭 접합의 50%를 억제하는 것으로 나타났다.
테르비나파인은 완전히 억제합니다. 이것은 틈새 접합 억제제로 테르비나파인을 확인합니다. 이 분석은 인접한 기증자와 수용자 세포 사이에 GJIC를 측정하므로 기증자 와 수용자 세포는 도금 전에 완전히 해리해야합니다.
그리고 혼합 배양의 합류는 세포 사이의 갭 접합의 형성을 최대화하기 위해 100 %여야한다. 시간 과정 데이터, 용량 반응 관계, 갭 접합 변조기의 가역성 평가는 Iodide-YFP-GJIC 분석으로 얻을 수 있다. 또한, Iodide-YFP 특이적 코넥신 GJIC 어세는 기능적 갭 접합이 없는 세포에 관심 있는 코넥신의 발현을 유도함으로써 확립될 수 있다.
이를 통해 특정 유형의 코넥신의 화학 물질의 IC50 값을 결정할 수 있습니다. Iodide-YFP-GJIC 분석은 견고하고 반복 가능하며 저렴하기 때문에 고처리량 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 이 연구는 약물 발견 및 독성 평가를 위한 간격 접합 변조 화학 물질을 찾는 데 도움이 됩니다.
