Dieses Protokoll ermöglichte es uns, die Struktur des menschlichen TRPC3 zu lösen, ein Mitglied einer wichtigen, aber unterstudierten Familie von Ionenkanälen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die hohe Effizienz, mit der sie angewendet werden kann, um eine Vielzahl von Proteinen auszudrücken und zu reinigen, sowohl für strukturelle als auch funktionelle Studien. Diese Methode kann ein effizientes Proteinexpressions- und Reinigungssystem für die Untersuchung der Proteinbiochemie und Biophysik bieten und kann auf eine Vielzahl von Ionenkanälen und anderen Membranproteinen angewendet werden.
Überprüfen Sie zunächst die relative Virusexpression, indem Sie die GFP-Fluoreszenz des Virus in einer Probe der Virusproduzierenden Kultur anzeigen. In einem verwirrten Boden Erlenmeyer Kulturkolben von ausreichender Größe, bereiten Sie ein wünschenswertes Volumen einer HEK293 Säugetierzellsuspensionskultur, bei einer Konzentration von 3,5 bis 3,8 Millionen Zellen pro Milliliter im Expressionsmedium, ergänzt mit 1%sterilen FBS. Fügen Sie 8% volumenmäßig der vorbereiteten P2-Virus-Stammlösung hinzu und in einem Orbital Shaker bei 37 Grad Celsius und 135 RPM zu brüten.
Nach 12 bis 18 Stunden nach der Infektion 10 Millimolar-Natriumbutyrat hinzufügen, bei 30 Grad Celsius für die Zeit inkubieren, die für eine optimale Proteinexpression erforderlich ist. Danach zentrifugieren Sie bei 2, 880 mal Schwerkraft für 20 Minuten, um die Zellen zu ernten. Waschen und suspendieren Sie die Zellen in etwa 100 Milliliter TBS pro Liter der geernteten Zellen.
Zentrifugieren Sie wieder bei 2, 880 mal Schwerkraft für 20 Minuten und sammeln Sie das Zellpellet. Sammeln Sie auch kleine, ein Milliliter Zellpellet Ernten zu unterschiedlichen Zeitpunkten und löslich für zwei Stunden bei vier Grad Celsius mit Aufregung in Gegenwart von verschiedenen Reinigungsmitteln und /oder Additiven. Klären Sie diese kleinen, solubilisierten Proben durch Ultrazentrifugation bei 235.000-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Führen Sie sie dann als 30-Mikroliter-Proben auf einer SEC-Chromatographie-Säule aus, um die beste Zeit für die Expression und die besten Löslichkeitsbedingungen zu bestimmen. Das Pellet in 100 Milliliter Puffer pro Liter geernteter Zellen auftauen. Sobald die Zellen aufgetaut sind, Pipette oder rühren Sie sie, um sicherzustellen, dass die Lösung homogen ist.
Lassen Sie die Zellen bei vier Grad Celsius in einem Becher in Eis getaucht für zwei Stunden, während von einem Rührstab gerührt. Als nächstes entfernen Sie alle Zellablagerungen durch Ultrazentrifugation bei 235.000-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Führen Sie eine 30-Mikroliter-Probe des Überstandes auf einer SCC-Säule per HPLC aus, um die Proteinmenge zu verifizieren und das Zielprotein durch GFB-Signalausgang zu visualisieren.
Tragen Sie den kobaltaffinen Harz gebundenen Überstand, der das lösliche Protein enthält, auf eine Gravitationssäule auf und sammeln Sie den Durchfluss. Führen Sie eine 30-Mikroliter-Probe des Durchflusses auf einer SCC-Säule durch, um zu überprüfen, ob das Protein an das Harz gebunden ist. Dann waschen Sie das Harz mit 10 SäulenVolumen Puffer.
Führen Sie eine 30-Mikroliter-Probe der Wäsche auf einer SCC-Säule durch, um den Proteinverlust zu überprüfen. Mit Puffer, elute das Harz gebunden menschlichen TRPC3. Führen Sie eine 90-Mikroliter-Probe des Eluants, das einbis 100 auf einer SSC-Säule verdünnt wurde, aus, um zu überprüfen, ob das Protein eluiert wurde, und um das Vorhandensein eines GFP-Signals an der Position zu überprüfen, die der Zielproteingröße entspricht.
Fügen Sie Thrombin mit einem Verhältnis von 1 bis 20 Mol hinzu und fügen Sie der eluierten Probe 10 Millimolaren EDTA hinzu. Drei Stunden lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Danach das Eluant in ein 15 Milliliter Zentrifugalfilterrohr übertragen.
Drehen Sie das Rohr bei 2, 800-mal Schwerkraft und bei vier Grad Celsius in fünf Minuten Schritten, um das Eluant auf 500 Mikroliter oder weniger zu konzentrieren. Pipette die Proteinlösung nach oben und unten zwischen Spins, um das Protein wieder auszusetzen und eine Überkonzentration zu verhindern. Laden Sie das Konzentrat im Puffer auf eine SSC-Säule.
Führen Sie eine schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie durch und sammeln Sie 300 Mikroliter-Fraktionen. Kombinieren Sie dann die Spitzenfraktionen, die den TRPC3-Tetramer enthalten, wie durch das UV-Absorptionssignal visualisiert. Und konzentrieren Sie sich wieder auf eine Endkonzentration von mindestens fünf Milligramm pro Milliliter.
Der menschliche TRPC3 ist eine ganze Zelllösung, die in einer Vielzahl von Waschmitteln mit einer kritischen Micelle-Konzentration von 0,01 bis 20 Mikromolaren so limbilisiert ist, und wurde in einem DDM/CHS-haltigen Puffer ausgeführt. Obwohl DDM/CHS die höchste Löslichkeit des menschlichen TRPC3 zeigt, erscheint die Spitzenposition zu groß, um der tetramere menschliche TRPC3 zu sein. Nach der Löslichkeit ganzer Zellen wird der Zelllyseabfall entfernt und das gelöste Protein auf eine SSC-Säule geladen und auf HPLC in DDM/CHS-Waschmittel mit Puffer ausgeführt, um die absolute Löslichkeit und das Spitzenvolumen des menschlichen TRPC3 unter verschiedenen Bedingungen im Vergleich zu einer TRPM4-Kontrolle zu vergleichen.
Alle verschiedenen waschmittellöslichen TRPC3-Proben weisen Spitzenpositionen um 11,9 Milliliter auf, was wahrscheinlich zu groß ist, da die tetramere Form des menschlichen TRPC3 ein geringeres Molekulargewicht hat als die positive menschliche Kontrolle TRPM4. Anschließend werden zwei verschiedene Löslichkeits- und Laufpuffer getestet, die DDM/CHS und Digitonin enthalten. Der Proteinlauf im Puffer, der Digitonin enthält, liefert den höchsten Peak in einer vernünftigen Position relativ zur Positivkontrolle.
Während eine kleine Reinigung mit 25 Millilitern Zellen mehrere breite Spitzen aufweist, zeigt das Protein Merkmale eines einzelnen tetramerischen menschlichen TRPC3-Kanals in 2D-Klassifikation durch Negativfleck. Additive werden dann auf der Grundlage des physiologischen Charakters des menschlichen TRPC3 gescreent. EDTA zeigt einen bemerkenswerten Einfluss auf die Stabilisierung des menschlichen TRPC3 in einer intakten tetramerischen Spitzenposition und hat die Anzahl der Partikel im Kryo-EM-Mikrographen signifikant erhöht und das Rauschen im Hintergrund verringert.
Die Qualität der Endergebnisse hängt von einer guten Fehlerbehebung der FSCC-Profile auf HPLC ab. Und nach Abschluss aller Reinigungsschritte schnell, idealerweise an einem einzigen Tag. Nach diesem Eingriff können Strukturelle Bestimmung, Antikörpererzeugung und funktionelle Studien wie Bindungstests oder Elektrophysiologie durchgeführt werden.
Diese Technik kann und wurde angepasst, um andere Ionenkanäle und Proteinfamilien zu untersuchen und gereinigte Proteine für Anwendungen jenseits der strukturellen Bestimmung zu produzieren. Es sollten geeignete Vorsichtsmaßnahmen für die Bewirtschaftung von Zellkulturbiogefahren getroffen werden, wie z. B. das Arbeiten in einer laminaren Strömungshaube, das Tragen von Schutzkleidung und die ordnungsgemäße Entsorgung von Abfällen.
