Mit dieser Methode können Sie dreidimensionale histologische Bilder aus kleinen Millimeterstichproben erzeugen, einschließlich kleiner Modellorganismen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die eingebetteten Proben sehr stabil sind, so dass Sie die Proben über einen längeren Zeitraum aufbewahren und mehrmals abbilden können, z. B. mit verschiedenen Bildgebungsmethoden über Jahre hinweg. Die Ausgabe dieser Methode wird sehr nützlich für Hochdurchsatzmodell-System-Phänomik, Toxikologie, und möglicherweise sogar menschliche GewebeDiagnostik.
Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil die Proben relativ klein und schwer zu orientieren oder zu manövrieren sind. Die visuelle Demonstration ist von entscheidender Bedeutung, da aufmerksamkeitsgemäß eicht werden muss, um Beispielschäden zu vermeiden. Für jugendliche oder ältere Zebrafische, verhungern sie für mindestens 24 Stunden, um das Volumen des Darmgehalts vor der Fixierung zu reduzieren.
10% neutraler Puffer formalin oder NBF und 2x Tricaine-S vorgekühlt auf vier Grad Celsius auf Eis verschieben. Verdoppeln Sie die Fischwassermenge mit gekühltem 2x MS-222 für schnelle und humane Euthanasie. Sechzig Sekunden, nachdem sich die Fische nach humaner Euthanasie nicht mehr bewegt haben, legen Sie den Fisch in gekühlter 10%NBF-Lösung in flachbodenige Glasfläschchen bei Raumtemperatur und fixieren Sie sie über Nacht.
Am zweiten Tag die festen Fischproben dreimal in 1x PBS pH-pH-Wert 7,4 für jeweils 10 Minuten abspülen. Nach dem Waschen die Proben in 35% Ethanol untertauchen und 20 Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Rühren brüten. Wiederholen Sie diesen Schritt dann mit 50% Ethanol.
Inkubieren Sie die Proben in frisch zubereiteter 0,3%Phosphowolfram-Säure oder PTA-Lösung über Nacht bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung, um sie zu färben. Beginnen Sie den dritten Tag mit der Zubereitung einer eins-zu-eins Volumen-für-Volumen-Mischung aus 100% Ethanol und LR weißem Acrylharz. Spülen Sie die Proben dreimal in 70% Ethanol für jeweils 10 Minuten, dann inkubieren Sie die Proben in 90% Ethanol bei Raumtemperatur für 30 Minuten mit sanfter Rührung.
Wiederholen Sie die Inkubation unter den gleichen Bedingungen, aber 95%Ethanol und dann zwei weitere Male mit 100%Ethanol. Am Ende tauchen Sie die Proben in eins zu eins Ethanol und LR weiß Acrylharz Mischung, und inkubieren bei Raumtemperatur über Nacht mit sanfter Rührung. Am vierten Tag die Mischung aus der Durchstechflasche entfernen und 100%LR weißes Harz hinzufügen, um die Proben zu untertauchen.
Zwei Stunden bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung bebrüten. Nach zwei Stunden das Harz durch frisches 100%LR weißes Harz ersetzen und eine Stunde bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung bebrüten. Verwenden Sie zur Montage des Einbettungsgeräts den Poly MI-Schlauch mit einem Durchmesser von mindestens 0,1 Millimetern, der größer ist als der Durchmesser der Probe, und schneiden Sie ihn auf eine Standardlänge von 30 Millimetern.
Befestigen Sie dann einen P1000-Mikrorohrkopf am weißen Ende des Einbettadapters und legen Sie den Poly MI-Schlauch an sein schmales Ende. Nachdem die Proben für eine Stunde in 100%LR weißem Harz inkubiert haben, übertragen Sie sie auf ein kleines Wägeboot und tauchen Sie sie vollständig in 100%LR weißes Harz. Richten Sie die Schläuche des Einbettvorrichtungsgeräts am breiten Ende der festen Probe oder in Richtung des Kopfes aus und leiten Sie die Probe langsam in den Schlauch.
Positionieren Sie die Probe in der Mitte des Schlauches, und stellen Sie sicher, dass die Schläuche über und unter der Probe mit Harz gefüllt sind. Unmittelbar danach, um das offene Ende der Schläuche zu versiegeln, glätten Sie ein Stück ölbasierter weicher Modellierton in eine etwa einen Millimeter dicke Platte und stabilisieren Sie die Schläuche zwischen Zeige- und Mittelfinger. Dann drücken Sie langsam den Ton gegen das Ende der Schläuche mit Daumen, und entfernen Sie überschüssigen Ton.
Entfernen Sie das Einbettgerät vom Mikrorohrkopf. Ziehen Sie die Schläuche durch sanfte Rotation heraus. Während Sie einen Finger gegen das versiegelte Ende halten, um das Auswerfen des Tons zu verhindern, versiegeln Sie das andere Ende, indem Sie langsam das unversiegelte Ende der Schläuche in den Ton drücken.
Legen Sie die Schläuche horizontal auf ein Rohrgestell, und lassen Sie das Harz für 24 Stunden bei 65 Grad Celsius im Ofen polymerisieren. Am Ende des folgenden Tages sammeln Sie die Proben für die Bildaufnahme. Eine erfolgreich eingebettete Zebrafischlarve hat keine Luftblasen gefangen.
Wenn während des Einbettungsprozesses Luft eingefangen wird, kann sie sich in Richtung der Probe bewegen, wenn die Probe während der Polymerisation nicht horizontal platziert wird, was die Bildqualität beeinträchtigen kann. Dieses Protokoll war erfolgreich bei der Einbettung verschiedener Modellorganismen. Wie Zebrafisch, Drosophila, Daphnia und Maus embryo.
Die erfolgreiche Einbettung kann mit rekonstruierten 3D-Renderings gezeigt werden, die durch mikro-CT-Scans für Zebrafische, Daphnia und Drosophila dargestellt werden. Einbettharz kann in allen Scans außerhalb der Probe gesehen werden, stört aber nicht die Probe selbst. Diese Proben können über einen längeren Zeitraum gelagert und für mehrere Bildgebungssitzungen wiederverwendet werden, wie mit Zebrafischlarven aus dem Jahr 2011 gezeigt.
Und dann wieder im Jahr 2013. Anatomische Merkmale bleiben nach der Speicherung erhalten, wie bei Nahaufnahmen der Muskeln beider Scans zu sehen ist. Darüber hinaus werden Intensitätsprofile, die entlang segmentierter Linien auf die entsprechenden Durchschnittswerte normalisiert wurden, in beiden Scans räumlich übereinstimmende lokale Spitzen angezeigt.
Die durchschnittlichen Intensitätswerte für ausgewählte Regionen in beiden Scans wurden durch einen Durchschnitt für den Hintergrund dividiert und zur Erzeugung von Signal-Rausch-Verhältnissen verwendet, die gut zwischen den Scans übereinstimmten. Beim Versuch dieser Methode ist es wichtig, vorsichtig zu arbeiten, um Probenschäden zu vermeiden und sorgfältig zu arbeiten, um das Einbringen von Luftblasen zu verhindern. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Histologie oder Elektronenmikroskopie eingesetzt werden, um Muster der Proteinexpression zu untersuchen oder eine höhere Auflösung von Regionen zu erreichen, die für 2D von Interesse sind.
Wir hoffen, dass diese Publikation Ihnen helfen wird, auf die Macht von hochauflösendem Gewebe-Mikro-CT zuzugreifen.
