Wir danken herzlichst Shigeo Kita für seine wertvollen Anregungen und Diskussionen. Wir danken auch John und Sumire Eckstein für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts.

Hinweis: Die Proben, die in dieser Studie verwendet wurden, Mikroorganismen, schnell mit Propan in flüssigem Stickstoff eingefroren substituierte in Aceton, enthält 2 % Osmium ausgefällt und eingebettet in Epoxy Harz1,2,3Einfrieren, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. Vorbereitung der Trägerfolie (Abbildung 1-3)
Hinweis: Silberne Formvar Trägerfolie wird mit der auf Gußglas Methode19zubereitet.
<ol><li>100 mL 1,5 % zugeben Formvar in Ethylen Paraquatdichlorid zu einer Formvar-Herstellung-Apparatur (Abbildung 1). Tauchen Sie die Hälfte einer Glas-Folie (76 x 26 x 1,3 mm) in Formvar Lösung in der oberen Spalte des Geräts durch Drücken der Lösung mit Luft durch "a" mit einem Rubber Ball19.<ol>
<li>Lassen Sie die Lösung aus der Spalte durch die drei-Wege-Absperrhahn öffnen und loslassen Luft durch 'b', Druck zu verringern. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Gerät genommen und trockene Luft zu bilden einen Film auf der Oberfläche der Folie Glas. Verwenden Sie eine weißglühende Lampe zur Beschleunigung der Trocknung des Formvar Films.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem die vier Kanten des Films auf dem Objektträger mit einer Rasierklinge (Abbildung 2a) abschaben, und atmen auf der Folie, die Trennung des Films aus der Folie20, zu erleichtern die Folie auf dem Wasser zu schweben, durch Eintauchen der Objektträger in der das Wasser langsam in einem niedrigen horizontalen Winkel (ca. 10°, Abb. 2 b).</li>
	<li>Schöpfe die Formvar Film aus dem Wasser mit einem Alu-Rack (30 x 25 x 3 mm) mit Löcher (4 mm Durchmesser) (Abb. 3a). Halten Sie das Gestell mit dem Formvar Film in den Exsikkator gestellt bis zur Verwendung (Abb. 3 b).</li>
</ol>2. Trimmen des Probe-Blocks mit einem Ultraschall trimmen Klinge und eine Rasierklinge 21 unter einem Stereomikroskop (Abbildung 4)
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass gibt es Zellen auf der Oberfläche des Blocks durch die Beobachtung der Spitze des Blocks mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 4a).</li>
	<li>Montieren des Probe-Blocks in das Spannfutter (Block-Halter), und das Futter auf ein trimmen Bühne21 (Abbildung 4 b). Diese trimmen-Etappe hat einen Beleuchtung-Mechanismus von der Rückseite der Probe.</li>
	<li>Schneiden Sie den Block auf eine Größe von 0,7 mm x 1,0 mm (Abb. 4 c, 5d). Da das Epoxidharz sehr hart ist, schneiden Sie die Blöcke zuerst mit einem Ultraschall trimmen Klinge. Die Ultraschall trimmen Klinge ist eine neu eingeführte Maschine, und die Blöcke sind leicht getrimmt. Dann schneiden Sie den Block weiter mit einer Rasierklinge. Schneiden Sie eine Schulter markieren die Richtung des Schneidens (siehe Abbildung 5 d, Abbildung 8).</li>
</ol>(3) trimmen des Probe-Blocks mit Diamant Messer mit dem Mikrotom (Abbildung 5)
<ol><li>Inmitten des Probe Blocks Chuck Probenhalter für die regungsloses. Legen Sie die Probe 90° gegen den Uhrzeigersinn gegen die tatsächliche Position, wenn serielle ultradünnen Schnitt durchgeführt (siehe Abbildung 5-d).</li>
	<li>Schneiden Sie die Oberfläche des Blocks mit einem Diamant Trimmmesser (siehe Abbildung 5 d). Diamant Messerschneide parallel zur Fläche Probe-Block gesetzt, und schneiden Sie den Mindestbetrag der Probenoberfläche um nicht zu verlieren, jede Probe (Abb. 5D). Hinweis: Dieser Schritt ist getan, um die Probenoberfläche zu glätten. Der Teil der Probenoberfläche schlanke Teil intakt (daher dieser Teil ist nicht glänzend wie ein Spiegel, Abbildung 5 d), um keinen Teil der Probe für serielle Schnitt verlieren. Und zwar deshalb, weil das Muster auf der Oberfläche des Blocks ausgesetzt ist.</li>
	<li>Setzen Sie einen Spiegel (Mesa Schnitt, M) auf der Bühne Messer zum Schneiden von der Probe-Block (Abbildung 5 c) überwachen.</li>
	<li>Schneiden Sie den linken Rand (Dies wird die Oberseite, Abbildung 5 d, der Probe im seriellen Schnitt) des Blocks mit Trimmmesser durch rotierende Messer Stufe 30 ° nach links (Abb. 5a).</li>
	<li>Schneiden Sie die Block-Fläche an etwa 100 µm vom linken Rand der Probe (Dies wird die Unterseite der Probe in seriellen Schnitt, Abbildung 5 d) durch rotierende Messer Stufe 30 ° nach rechts (Abb. 5 b). Hinweis: Die Schnittserien schneidet sie aus dem schlanken Teil der Probe von etwa 90 nm x ca. 1 mm groß. Der Großteil wird zur Probenoberfläche und der Messerschneide anpassen, so dass sie parallel sind. Nach dem Einstellen der Probenoberfläche parallel zur Messerschneide sein, wird der große Teil mit einer Rasierklinge entfernt. Von oberen und unteren Rand der Probe mit dem Mikrotom schneiden, werden beide Seiten der Probe glatt und genau parallel zueinander (Abb. 5D), die ist notwendig, um gerade und ununterbrochene Band Abschnitte.</li>
</ol>4. anpassen der Probe Oberfläche und Messer Kante, so dass sie Parallel zu einander 21 Gesicht
<ol><li>Entfernen Sie das Schneidmesser, und drehen Sie den Probe Block 90° im Uhrzeigersinn.</li>
	<li>Legen Sie eine ultradünne Stationspunkte Messer auf der Messer-Bühne.</li>
	<li>Einstellen Sie die Probenoberfläche und der Messerschneide so, dass sie Parallel zueinander mit dem Großteil der Probenoberfläche konfrontiert. Hinweis: Der Großteil der Probe wird zur Einstellung verwendet, denn das Schneiden Gesicht des seriellen Schnitt so klein ist, macht es schwierig, Probe Oberfläche und Messer Rand mit diesen Teil nur, vor allem in vertikaler Richtung anpassen. So macht mit dem großen Teil der Probe Anpassung leicht.</li>
</ol>5. Verbreitung Neopren-Lösung auf die Probe-Block (Abbildung 6)
<ol><li>Um die Probe Futter an genau der gleichen Position wie die ursprüngliche Position zu platzieren, bringen Sie Klebeband auf das Futter und Futter Inhaber Mikrotom und schneiden Sie an der Grenze (Abb. 6a).</li>
	<li>Nehmen Sie das Präparat Chuck aus Mikrotom, und legen Sie es unter dem Stereomikroskop (Abb. 6 b). Schneiden Sie den Großteil der Probe mit einer Rasierklinge, indem man die schlanken Teil, unter dem Schnittserien erhältlich sind.</li>
	<li>Mit einer Pasteurpipette, fallen Sie ca. 1 µL 0,5 % Neopren Lösung (Abb. 6 b) auf die Probe, für serielle Schnitt verwendet werden, um den Abschnitt Seiten Klebstoff zu machen. Decken Sie die gesamte Probe mit Neopren-Lösung. Absorbieren Sie überschüssige Neopren Lösung sofort mit einem Stück Filterpapier in der Nähe der Probekörpers. Eine Band der Abschnitte ist essentiell für die Bilder von seriellen Zellteile und Neoprenkleber ist sehr nützlich für die Abschnitte zusammenkleben.</li>
	<li>3-Schlitz-Netze vorzubereiten (Größe der Schlitze: Mitte, 0,4 mm x 2,2 mm, beide Seiten 0,2 mm x 2,2 mm) (Abbildung 6 c) für die Abholung Schnittserien durch Biegen des Griffs der Netze 60°, behandeln die Netze mit 0,5 % Neopren-Lösung, und machen die Netze von hydrophilen Leuchten Sie Entlastung22.</li>
</ol>6. Herstellung Serienschnitte (Abbildung 7-9)
<ol><li>Ort der Probe Block Futter zurück in das Mikrotom an der gleichen Position wie 5.1 (Abb. 6a) durch Ausrichten der aufgezeichneten Teile. Dies hält die Block-Gesicht und die Messerschneide vollkommen parallel zueinander. Dann bringen Sie das Messer in der Nähe der Probe.</li>
	<li>Füllen Sie das Messer-Boot mit Wasser.</li>
	<li>Decken Sie das Mikrotom mit einer Kunststoff-Abdeckung, Luftstrom (Abbildung 7) zu verhindern. Hinweis: Luftstrom während der ultradünnen schneiden und Abruf der Abschnitte oft Probleme verursachen. Die Kunststoffabdeckung verfügt über drei Löcher: ein Loch ist für das Fernglas Objektive, und die beiden anderen Löcher sind für die Arme um den Betrieb zu ermöglichen, während der Deckel auf. Die hölzerne Armlehne dient für die Platzierung der Arme dabei heikle Arbeit, z. B. Abrufen von Schnittserien mit Gittern. Die hölzerne Armlehne befindet sich auf verschiedene Tabellen aus der Mikrotom-Tabelle (Abbildung 7, Pfeile), um nicht die Schwingung der Hände des Bedieners, Mikrotom zu übertragen.</li>
	<li>Fang an zu schneiden die Probe bei 200 nm Dicke (Abbildung 8). Einstellung bei 200 nm Dicke sparen Zeit, darin das Messer an der Oberfläche der Probe.</li>
	<li>Nach den ersten Schnitt gesetzt die Schnittdicke bis 70 nm (Abbildung 8).</li>
	<li>Wenn die Anzahl der Schnittserien erreicht 20 (genau gesagt, nach der Band erreicht etwa 1,8 mm; die Anzahl der Abschnitte abhängig von der Breite der Abschnitte variiert), setzen die Schnittdicke bis 10 nm (Abbildung 8) gleichzeitig schneiden. Hinweis: Da das Mikrotom 10 nm dicke Abschnitte schneiden kann, keine neuer Abschnitt erscheint, und die zuvor Zuschnitte von der Messerschneide getrennt werden. Es ist wichtig, um getrennte Abschnittsgruppen (Abbildung 9) für die Abholung Serienschnitte, Schwierigkeiten bei der Trennung von Abschnitten, die manuell über ein paar Haarsträhnen zu vermeiden. Da das Sichtfeld in der Transmissions-Elektronenmikroskop 2,0 mm ist, sollte Abschnitte höchstens 1,8 mm lang sein.</li>
	<li>Legen Sie die Schnittdicke bis 60 nm (Abbildung 8). Dies wird 70 nm Abschnitte (Abbildung 8) produzieren, weil die Maschine die letzten 10 nm Dicke hinzufügen wird.</li>
	<li>Legen Sie die Schnittdicke wieder auf 70 nm (Abbildung 8) und das Schneiden fortsetzen, bis 1,8 mm lange Abschnitte erhalten sind.</li>
	<li>Wiederholen Sie 6,6-6,8 bis fünf 1,8 mm lange Abschnitte (Abbildung 9) erreicht werden. Wir machen in der Regel fünf Abschnittsgruppen, da gibt es fünf Probenhalter in der Transmissions-Elektronenmikroskop in unserem Labor zur Verfügung, aber fünf nicht das Limit ist.</li>
</ol>7. Abholung Serienschnitte (Abbildung 10-12)
<ol><li>Legen Sie die "Abschnitt-Holding-Schleife"23 (innerer Durchmesser der Schleife: 5,0 mm) (Abb. 10a) auf die dritte Abschnittsgruppe (Abbildung 10). Hinweis: Es ist erforderlich, um die Abschnitte in der Reihenfolge ihrer schneiden zu fotografieren in der richtigen Reihenfolge abzurufen. Aber da auf dem Messer Boot gibt es fünf Abschnittsgruppen, ruft es oft verwirrend, welche Gruppen sind. Wenn Sie die Schleife auf der dritten Gruppe, wird klar, dass die beiden Gruppen in der Nähe der Betreiber sind die erste und zweite und entfernte zwei vom Betreiber sind die vierten und fünften Gruppen (Abbildung 10). Dadurch wird verhindert, die Reihenfolge vertauschen.</li>
	<li>Legen Sie "Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife"23 (WSRL, Innendurchmesser der Schleife: 4,0 mm) (Abb. 11a) auf der Bühne Messer (Abbildung 11 b). Die WSRL wird fest auf der Messer-Bühne stehen, weil es mit einem Magneten an der Unterseite ausgestattet.<ol>
<li>Legen Sie die Schleife der WSRL oberhalb der Schnittserien durch bewegte seinen Schaft und Griff. Senken Sie die Schlaufe des WSRL auf die Wasseroberfläche, so dass die Schleife in den Abschnitten umkreist.</li>
		<li>Drücken Sie die Schleife durch Drehen der Schraube nach unten, so dass die Wasseroberfläche durch Oberflächenspannung (Zahlen 11 c-d) auslöst. Verschieben Sie den Abschnitt in der Mitte der Schleife, positionieren Sie es an die Spitze des Wassers und passen Sie die Richtung des Abschnitts mithilfe einer Haar-Strang-21.</li>
		<li>Abschnittsgruppen durch Berührung mit einem nackten Schlitz-Raster, die von einer Pinzette gehalten und immer parallel zur Wasseroberfläche (Abbildung 11 d) abholen. Es ist wichtig für Abschnitte, das Netz zuerst berühren nicht das Wasser, um Abschnitte genau in der Mitte des Rasters (Abbildung 11 d) zu platzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Gitter mit Abschnitten zusammen mit einem Tropfen Wasser auf Formvar Unterstützung Film16 (Abbildung 12), und entfernen Sie überschüssiges Wasser mit Filterpapier. Hinweis: Faltenbildung der die Trägerfolie ist oft ein Problem wenn Abschnitte mithilfe eines Rasters mit Trägerfolie abgeholt werden, weil Membran (Abschnitte) Membran (Trägerfolie) direkt berührt. Das Problem der immer Falten auf der Trägerfolie wird deutlich reduziert, indem ein Abschnitt tragenden Raster zusammen mit einem Tropfen Wasser auf die Formvar Unterstützung Film16.</li>
</ol>(8) Färbung Abschnitte16,24 (Abbildung 13)
<ol><li>Nach die Abschnitten vollständig getrocknet sind, reißen Sie den Formvar Film von rund um die Netze zu, und entfernen Sie die Gitter mit den Abschnitten.</li>
	<li>Legen Sie die Gitter in die Nut der die Färbung Rohr16 in der richtigen Reihenfolge (Abbildung 13), und Flecken Sie Abschnitte mit Uranyl Acetat und Blei Citrat24. Hinweis: Befindet sich eine Nut 0,6 mm tief entlang der Längsachse des Rohres mit einer Rasierklinge geschnitten. Die Röhre ist nützlich zur Vermeidung versehentlichen Bruch der Unterstützung Filme Verwendung einer Pinzette, da direkte Handhabung von Grids während der Färbung und waschen Prozess16 entfällt.</li>
</ol>9. Beobachtung der Schnittserien (Abbildung 14)
<ol><li>Legen Sie die 5 Raster im Multi-Probenhalter in der richtigen Reihenfolge (Bild 14a), Ausrichtung der Längsachse der Raster Schlitz senkrecht zur Probe Halter. Die Griffe (Pfeilspitzen) der Netze müssen nicht geschnitten werden, da die Raster-Fixierer die Griffe nicht berührt werden.</li>
	<li>Befestigen Sie die Gitter mit "Raster-Fixierer" (Abb. 14 b) und der Transmissions-Elektronenmikroskop einfügen Sie Probenhalter. Hinweis: Es ist oft nützlich, geringer Vergrößerung Bilder von allen Zellteile (Abbildung 15), interessante Mikroorganismen oder Zellen in gutem Zustand ohne Kontamination und mit gute Fixierung zu finden nehmen vor dem Fotografieren der Zielzelle.</li>
	<li>Machen Sie Fotos von den Zielzellen in allen Zellteile bei hoher Vergrößerung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+an+ultrastructural+study.">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+ultrastructure+of+yeast+cells+by+electron+microscopy.">Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy.</a> Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans+examined+by+freeze-substitution+electron+microscopy.">Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Exophiala+yeast+cells+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Saccharomyces+cerevisiae+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).</li><li>Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning.">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+Escherichia+coli.+cells+by+serial+ultrathin+sectioning+reveals+the+precise+cell+profiles+and+the+ribosome+density.">Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density.</a> Microscopy. 66, 283-294 (2017).</li><li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+virulent+Mycobacterium+tuberculosis,+which+survives+with+only+700+ribosomes+at+density+per+0.1+fl+cytoplasm.">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm.</a> PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-voltage+electron+microscopy+tomography+and+structome+analysis+of+unique+spiral+bacteria+from+the+deep+sea.">High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea.</a> Microscopy. 65, 363-369 (2016).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryote+or+eukaryote?+A+unique+microorganism+from+the+deep-sea.">Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea.</a> J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning+of+the+Myojin+parakaryote+discovered+in+the+deep+sea.">Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea.</a> Cytologia. 78, 333-334 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Worman, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-sea+microorganisms+and+the+origin+of+the+eukaryotic+cell.">Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell.</a> Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electron+microscopic+study+of+microorganisms:+from+influenza+virus+to+deep-sea+microorganisms.">An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms.</a> JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+specimen+preparation+for+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+of+yeast+cells.">Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells.</a> J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis+cell+by+freeze-substitution+and+serial+sectioning+electron+microscopy.">Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).</li><li>Kozubowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+kinetochore+assembly+in+the+human+pathogenic+basidiomycetous+yeast,+Cryptococcus+neoformans.">Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans.</a> mBio. 4, e00614-e00613 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Adachi, K., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+support.">Specimen support.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 52-57 (2011).</li><li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+films.">Support films.</a> Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 216 (2000).</li><li>Yamaguchi, M., Kita, S., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning.">Ultrathin sectioning.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 40-52 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+hydrophilicity/hydrophobicity+of+the+plasma-polymerized+naphthalene+film+(Super+support+film)+and+other+support+films+and+grids+in+electron+microscopy.">Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy.</a> Microscopy. 65, 444-450 (2016).</li><li>Kita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+method+for+obtaining+serial+ultrathin+sections+using+new+small+tools.">Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools.</a> Kenbikyo. 46, 253-257 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+use+of+uranyl+acetate+solution+in+section+staining+in+transmission+electron+microscopy.">Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy.</a> Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).</li><li>Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+the+collection+of+ultrathin+serial+sections+for+large+volume+TEM+reconstructions.">Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions.</a> Microsc. Microanal. 12, 86-87 (2006).</li><li>Hildebrand, D. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish.">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier vorgestellte Methode erfordert keine teure Ausrüstung. Es erfordert nur ein Alu-Rack (Abbildung 3), 3-Schlitz-Raster (Abbildung 6 c), Abschnitt-Holding Schleifen (Abb. 10a), Wasser-Oberfläche-Anhebung Schleife (Abbildung 11a) und eine Färbung Rohr (Abbildung 13). Es gibt viele Features des vorliegenden Verfahrens. Der große Teil der Probe wird verwendet, um die Probe Oberfläche und Messer Kante so einstellen, dass sie Parallel zueinander stehen. Serienschnitte werden in Gruppen zu Schwierigkeiten bei der trennende Abschnitte mit ein paar Haarsträhnen, wenn eine Gruppe von Serienschnitte auf den Schlitz-Netzen abgerufen werden geschnitten. Eine "Abschnitt-Holding-Schleife" wird verwendet, um zu vermeiden, mischen Sie die Reihenfolge der Abschnittsgruppen. Eine "Wasser-Oberfläche-Anhebung Schleife" wird verwendet, um sicherzustellen, dass die Abschnitte auf der Spitze des Wassers positioniert sind und dass sie das Raster zuerst berühren, um sie in die gewünschte Position auf den Gittern zu platzieren. Formvar Trägerfolie auf ein Aluminium-Gestell wird verwendet, um die Abschnitte auf den Gittern zu erholen und zu vermeiden, Faltenbildung der die Trägerfolie erleichtert. Eine Färbung Röhre wird verwendet, um zu vermeiden, versehentlich brechen die Unterstützung-Filme mit einer Pinzette.
Vor kurzem wurde eine automatische Band sammeln regungsloses entwickelten25 Abschnitte automatisch für Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Bildgebung am Elektron-opak-Kunststoff-Bänder zu sammeln. Diese Methode kann zuverlässig Schnitt Tausende ultradünnen Abschnitte26, was nicht durch das vorliegende Verfahren möglich ist. Auch serielle Block Gesicht (SBF) 27 und Fokus Ionenstrahl (FIB)-SEM28 werden verwendet, um 3D Informationen von Zellen und Gewebe von Tieren sammeln. In diesen Methoden ist schneiden mit einer Diamant-Messer oder Fokus Ionenstrahl integriert in die SEM-Mikroskop und vollautomatisch, das erfordert keine speziellen Techniken durchgeführt. Obwohl diese Methoden nützlich sind, ist das Gerät so teuer, dass nicht viele Institutionen diese Maschinen zu kaufen. Auch, da diese Methoden SEM Foto Abschnitten beschäftigen, ist die Auflösung von den Mikrographen schlechter als das vorliegende Verfahren, das Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) beschäftigt. Diese Methoden können die einzelnen Ribosom Partikel, Mikrotubuli, beschäftigt und DNA Fasern derzeit nicht lösen.
Für die Structome Analyse von Mikroorganismen und für Ultrastrukturforschung Studie von unbekannten Mikroorganismen ist es notwendig, die Zellen und Zellbestandteile wie Zellwand, Plasmamembran, endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, Zellkern, Kernmembran beobachten, Chloroplasten, Plastiden, Golgi-Apparat, Ribosomen und faserigen Elementen mit hoher Auflösung. TEM Beobachtung der ultradünnen Schnittserien ist eine der wenigen Methoden, um eine solche Analyse in drei Dimensionen möglich. Da ultradünnen Abschnitte nach Beobachtung bei dieser Methode bleiben, kann der gleichen Gegend wiederholt beobachtet werden; Dies ist nicht möglich in SBF oder FIB-SEM, da die beobachteten Bereich nach Beobachtung verloren geht. Diese Funktion ist wichtig, Tiefsee Mikroorganismen zu studieren, es notwendig ist, suchen interessante Organismen bei kleiner Vergrößerung zuerst, und dann fotografieren seriell auf den Zielorganismus bei hoher Vergrößerung.
Zusammenfassend, serielle ultradünnen Stationspunkte Methode kann jetzt durchgeführt werden in eine einfache, preiswerte und Relaible Weg durch die vorliegende Studie, die für 3D Ultrastructual Studie der Mikroorganismen in hoher Auflösung in der Elektronenmikroskopie.

Richtige ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik ist unerlässlich, um Zellen und Zellbestandteile dreidimensional auf mikroskopischer Ebene Elektron zu studieren. Wir haben untersucht die Dynamik der Spindel Pol Körper im Zellzyklus von Hefezellen und offenbart morphologische Veränderungen ihrer Ultrastruktur während des Zellzyklus und die Zeit von Doppelarbeit1,2,3, 4,5. Im Jahr 2006 haben wir ein neues Wort "Structome" durch die Kombination von "Struktur" geprägt und "-Ome", und als die 'quantitative und dreidimensionalen Strukturinformationen einer ganzen Zelle auf mikroskopischer Ebene Elektron' 6,7definiert.
Durch eine Structome Analyse, die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik erfordert, wurde festgestellt, dass eine Hefezelle von Saccharomyces Cerevisiae und Exophiala Dermatitidis etwa 200.000 Ribosomen7,8, ein hatte Escherichia coli Zelle 26.000 Ribosomen9, Mycobacterium Tuberculosis Zelle hatte 1.700 Ribosomen10 und Myojin Spirale Bakterien hatten nur 300 Ribosomen11. Diese Informationen sind hilfreich bei der Abschätzung der nicht nur der Wachstumsrate in jedem Organismus, sondern auch bei der Identifizierung von Arten9.
Darüber hinaus Structome Analyse führte zu die Entdeckung eines neuen Organismus; Parakaryon Myojinensis fand in der Tiefsee vor der Küste Japans, deren Zellstruktur waren ein Zwischenprodukt zwischen denen der Prokaryoten und Eukaryoten12,13,14,15. Derzeit gilt die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik so schwer sein, dass es lange, zu meistern dauern würde. In dieser Studie haben wir eine zuverlässige Methode entwickelt, in der jemand serielle ultradünnen Schneiden problemlos durchführen kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Formvar making apparatus</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>652</td>
			<td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Matsunami Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>-</td>
			<td>76 x 26 x 1.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum rack with 4-mm holes</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>658</td>
			<td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic trimming blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming</td>
			<td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td>
			<td>-</td>
			<td>45&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for ultrathin sectioning</td>
			<td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td>
			<td>-</td>
			<td>45&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>-</td>
			<td>Ultracut S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesa cut</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>-</td>
			<td>Mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special 3-slit nickel grid</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2458</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special 3-slit copper grid</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2459</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Section-holding loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>526</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-surface-raising loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>527</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining tube</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-specimen holder</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>EM-11170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy

Beobachtung von Zellen und Zellbestandteile in drei Dimensionen bei hoher Vergrößerung im Transmissions-Elektronenmikroskopie erfordert Vorbereitung ultradünne Schnittserien der Probe. Obwohl Vorbereitung ultradünne Schnittserien gilt als sehr schwierig sein, ist es ziemlich einfach, wenn die richtige Methode verwendet wird. In diesem Beitrag zeigen wir eine schrittweise Anleitung für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen sicher. Die wichtigsten Punkte dieser Methode sind: 1) verwenden Sie den großen Teil der Probe und Probe Oberfläche und Messer Rand anpassen, so dass sie parallel zueinander; (2) zu schneiden Schnittserien in Gruppen und vermeiden Schwierigkeiten beim trennen Abschnitte mit ein paar Haarsträhnen, wenn eine Gruppe von Serienschnitte auf den Schlitz-Netzen abgerufen werden; (3) zu verwenden, eine "Abschnitt-Holding-Schleife" und zu vermeiden, mischen Sie die Reihenfolge der Abschnittsgruppen; (4), verwenden Sie eine Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife, und stellen Sie sicher die Abschnitte auf der Spitze des Wassers positioniert sind und dass sie das Raster zuerst berühren, um sie in die gewünschte Position auf den Gittern zu platzieren; (5), verwenden Sie die Trägerfolie auf ein Aluminium-Gestell und machen es einfacher, die Abschnitte auf den Gittern zu erholen und zu vermeiden, von der Trägerfolie Faltenbildung; und 6) verwenden Sie eine Färbung zu vermeiden, versehentlich brechen die Unterstützung-Filme mit einer Pinzette. Diese neue Methode ermöglicht ultradünne Schnittserien ohne Schwierigkeiten. Die Methode ermöglicht die Zellstrukturen von Mikroorganismen mit hoher Auflösung in 3D, zu analysieren, die nicht mithilfe der automatischen Band sammeln regungsloses Methode und serielle Block-Gesicht oder fokussierten Ionenstrahl Rasterelektronenmikroskopie erreicht werden kann.

In diesem Protokoll wurden 3-Schlitz-Raster für die Abholung Schnittserien verwendet. Die Gitter sind aus Nickel oder Kupfer gefertigt. Die Schnittserien befinden sich auf den mittleren Schlitz. Die Schlitze auf beiden Seiten sind notwendig, um die Abschnitte anzuzeigen, wenn sie mit dem Netz aufnehmen. Um die Netze parallel mit der Schnittserien halten, wenn sie mit einer Pinzette (Abbildung 11 d) aufnehmen, ist der Griff gebogen (Abb. 6 c, rechts). Ein kleiner Griff ist vorteilhaft, um zu verhindern, Biegen des Hauptteils des Rasters, wodurch schwerwiegende Probleme in den Griff zu Abschnitten, und um zu vermeiden, fallen in den Abschnitten während der Färbung. Dieses Raster hat Vorteile gegenüber der herkömmlichen 2,0 x 1,0 mm Einloch-Raster. Nämlich, Abschnitte werden direkt von zwei Metall-Stangen-Abstand von 0,4 mm unterstützt (schmaler als 1,0 mm) und von der Trägerfolie Formvar in einem drei-Schlitz-Raster, während Abschnitte nur von der Trägerfolie in einem konventionellen Einloch-Raster unterstützt werden. Probe-Drift kann daher verhindert werden, bei hoher Vergrößerung mit einem drei-Schlitz-Raster zu fotografieren.
Abbildung 15 zeigt eine geringe Vergrößerung Ansicht von fünf Rastern, die Schnittserien tragen. Da jeder Abschnitt zusammenhält, ist es einfach die gleiche Zelle im nächsten Abschnitt auch bei stärkerer Vergrößerung zu finden. Abbildung 16 und 17 sind Beispiele für serielle Bilder von Zellteile. Da Teile sicher auf 3-Schlitz-Netze unterstützt werden, sind bei hoher Vergrößerung (x 50,000) leicht ohne Probe Drift fotografiert. Fasern von DNA 2 nm Durchmesser wurden in diesen Studien9,12fotografiert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig1.jpg"> Abbildung 1 . Formvar Unterstützung Filmemachen Apparat. Die Hälfte der gläsernen Objektträger ist eingetaucht in Formvar Lösung in der oberen Spalte des Apparates durch die Lösung mit Luft durch "a" mit einem Gummiball drücken. Die Lösung ist aus der Spalte leer, durch die drei-Wege-Absperrhahn öffnen und loslassen Luft durch 'b', Druck zu verringern. (Übernommen aus: Yamaguchi und Adachi, 201119 mit Erlaubnis). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig2.jpg"> Abbildung 2 . Methode für die Freigabe des Films aus dem Glas gleiten auf dem Wasser. (a) die vier Kanten des Films auf dem Objektträger sind mit Rasierklinge abgekratzt. (b) Formvar Film ist aus auf dem Wasser schwebte, durch eine Senkung der Objektträger in einem flachen Winkel langsam. (Übernommen aus: Yamaguchi und Adachi, 201119 mit Erlaubnis). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig3.jpg"> Abbildung 3 . Formvar Trägerfolie auf einem Aluminium Gestell. (a) der Formvar Film ist mit einem Aluminium-Gestell aus dem Wasser hob. (b) das Gestell ist in den Exsikkator bis zum Gebrauch aufbewahrt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig4v2.jpg"> Abbildung 4 . Trimmen des Probe-Blocks mit einem Ultraschall trimmen Klinge und eine Rasierklinge unter einem Stereomikroskop. (a) das Vorhandensein der Probe wird bestätigt durch die Beobachtung des Probe Blocks unter einem Lichtmikroskop. Der Block gezeigt in der Abbildung enthaltenen Mikroorganismen verbunden mit einer Skala-Wurm Chaeta (ca. 1,7 mm Länge) aus der Tiefsee12,14gesammelt. (b) trimmen Bühne. (c) Gesamtbild eines Stereomikroskops. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig5.jpg"> Abbildung 5 . Trimmen des Probe-Blocks mit Diamant Messer mit Mikrotom. (a) Abbildung zum linken Rand schneiden. (b) das Block-Gesicht wird geschnitten, an einer Stelle von ca. 100 nm vom linken Rand der Probe. (c) Spiegel (Mesa Schnitt, M) auf der Messer-Bühne platziert. (d) Probenoberfläche. Beachten Sie, dass die Oberseite und der Unterseite des schlanken teils glatt und perfekt parallel sind. Beachten Sie auch, dass die Schulter geschnitten wird, um die Richtung des Schneidens (siehe Abbildung 8) zu markieren. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig6.jpg"> Abbildung 6 . Neopren-Behandlung auf der Probenoberfläche. (a), das Futter Probe wieder in genau die ursprüngliche Position zu stellen, das Futter und Futter Inhaber Mikrotom mit einem Band versehen und Schneiden an der Grenze. (b) Benetzung die Probe mit Neopren-Lösung mittels Pasteurpipette. (c) 3-Schlitz Raster für die Abholung Schnittserien. Der Griff ist in 60 Grad Celsius, richtig gebogen. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig7.jpg"> Abbildung 7 . Kunststoff-Abdeckung der Mikrotom und hölzerne Armlehne. Die Plastikabdeckung ist nützlich, um Luftstrom während des ultradünnen schneiden zu vermeiden. Die hölzerne Armlehne ist dafür heikle Arbeit wie Abrufen von Schnittserien verwendet. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig8v2.jpg"> Abbildung 8 . Einstellung der Schnittdicke und Abschnitte in die richtige Dicke zu erhalten. Nachdem die Anzahl der Schnittserien 20 erreicht hat, soll Schnittdicke bis 10 nm. Da das Mikrotom 10 nm dicke Abschnitte schneiden kann, keine neuer Abschnitt erscheint, und die zuvor Zuschnitte von der Messerschneide getrennt werden. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig8v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig9.jpg"> Abbildung 9 . Beispiel für ultradünne Abschnitte durch das Protokoll erhalten. Beachten Sie, dass die fünf Gruppen von Schnittserien von etwa 1,8 mm lang nach dem Schneiden bereits getrennt sind. In diesem speziellen Fall ist die Farbe des Zentrums der ultradünnen Abschnitte gelblich wegen des Vorhandenseins der Probe. Die anderen Teile des Abschnitts, die nicht enthalten die Probe und des Harzes nur bestehen, sind in der Farbe Silber. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig10.jpg"> Abbildung 10 . "Abschnitt-Holding-Schleife". (a) Draufsicht (oberer Teil) und die Ansicht von unten (unterer Teil der Foto) der Schleife. (b) die Abschnitt-Holding-Schleife wird verwendet, um die dritte Gruppe von Schnittserien zu halten. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig11.jpg"> Abbildung 11 . Abruf von Schnittserien. (a) "Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife" (WSRL). Der Griff der Schleife kann aus dem Schacht entfernt werden, die beweglich ist. Die Schleife kann auch durch Drehen der Schraube oben oben und unten verschoben werden. (b) die WSRL ist auf der Bühne Messer durch einen Magneten fixiert. (c) Nähere Ansicht des (b). (d) schematische Darstellung der Schleife, Wasseroberfläche, Abschnitte und Raster beim Abrufen (Seitenansicht). Ultradünnen Abschnitte können durch eine Senkung der nackten Raster Parallel zu den ultradünnen Abschnitten genau an die Schlitz-Netz abgerufen werden. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig11large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig12.jpg"> Abbildung 12 . Das Raster auf Formvar Film platziert. Das Gitter hält die Abschnitte befindet sich zusammen mit einem Tropfen Wasser auf dem Formvar Film auf Aluminium-Gestell. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig12large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig13.jpg"> Abbildung 13 . Färbung Rohr16. Eine Nut 0,6 mm tief erfolgt entlang der Längsachse mit einer Rasierklinge. Netze werden in die Nut in der richtigen Reihenfolge platziert. Ein Ende des Rohres wird (Pfeilspitze) geschnitten, um seine Richtung zu markieren. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig13large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig14.jpg"> Abbildung 14 . Platzieren die Gitter im Probenhalter. (a) die Netze werden im Probenhalter in der richtigen Reihenfolge platziert. (b) die Netze sind dann mit "Raster-Fixierer" fixiert. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig14large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig15.jpg"> Abbildung 15 . Serienschnitte auf Schlitz Gitter montiert. Die Abbildung zeigt 18 bis 25 Abschnitte auf ein Gitter montiert. Die Zahlen in jedem Schlitz geben die Sequenz Zahl Anfang aus dem ersten Abschnitt. Der erste Abschnitt ist dicker als die anderen (siehe Abbildung 8). Beachten Sie, dass die Abschnitte miteinander verbunden sind und die gleiche Dicke haben. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig15large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig16.jpg"> Abbildung 16 . Serienschnitte von Parakaryon Myojinensis12. Die Zahlen am linken unteren geben die Reihenfolge gegenüber dem ersten Abschnitt. Die Abbildung zeigt 12 von 67 komplette Abschnitte. Diese Zelle zeigte sich eine große Nucleoid bestehend aus nackte DNA Fasern mit einem einzigen Nucleoid Membran und Endosymbionts, die Bakterien, aber keine Mitochondrien ähneln. Somit scheint dieses Organismus eine Zwischenform Leben von intramolekulare Eukaryote12weiterentwickelt werden. N, Nucleoid. Übernommen aus: Yamaguchi und Worman, 2014. 14 mit Erlaubnis. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig16large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56235/56235fig17.jpg"> Abbildung 17 . Serienschnitte von Escherichia coli9. Die Zahlen am linken unteren geben die Reihenfolge gegenüber dem ersten Abschnitt. Die Abbildung zeigt 12 komplette Abschnitte. Diese Zelle wurde gefunden, um 21.700 Ribosomen9enthalten. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56235/56235fig17large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Diese Studie bietet zuverlässige und einfache Verfahren zur Erlangung von ultradünnen Schnittserien eines Mikroorganismus ohne teure Ausrüstung im Transmissions-Elektronenmikroskopie.

Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

a-method-for-obtaining-serial-ultrathin-sections-microorganisms

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Engineering

14.0K Aufrufe.  Chiba University. Diese Studie bietet zuverlässige und einfache Verfahren zur Erlangung von ultradünnen Schnittserien eines Mikroorganismus ohne teure Ausrüstung im Transmissions-Elektronenmikroskopie.

Serie: A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted significant interests across the research fields of materials science, physics, chemistry and biology. The key enabling technology is a liquid cell. We fabricate liquid cells with thin viewing windows through a sequential microfabrication process, including silicon nitride membrane deposition, photolithographic patterning, wafer etching, cell bonding, etc. A liquid cell with the dimensions of a regular TEM grid can fit in any standard TEM sample holder. About 100 nanoliters reaction solution is loaded into the reservoirs and about 30 picoliters liquid is drawn into the viewing windows by capillary force. Subsequently, the cell is sealed and loaded into a microscope for in situ imaging. Inside the TEM, the electron beam goes through the thin liquid layer sandwiched between two silicon nitride membranes. Dynamic processes of nanoparticles in liquids, such as nucleation and growth of nanocrystals, diffusion and assembly of nanoparticles, etc., have been imaged in real time with sub-nanometer resolution. We have also applied this method to other research areas, e.g., imaging proteins in water. Liquid cell TEM is poised to play a major role in revealing dynamic processes of materials in their working environments. It may also bring high impact in the study of biological processes in their native environment.

We have developed a self-contained liquid cell, which allows imaging through liquids using a transmission electron microscope. Dynamic processes of nanoparticles in liquids can be revealed in real time with sub-nanometer resolution.

Verräterische dynamischen Prozesse der Materialwirtschaft in Flüssigkeiten mit Hilfe von flüssigen Zelle Transmission Electron Microscopy

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted ...

Forschung

Ingenieurwesen

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. The aggressive scaling of feature sizes, both on devices and interconnects, leads to serious challenges to ensure the required product reliability. Standard reliability tests and post-mortem failure analysis provide only limited information about the physics of failure mechanisms and degradation kinetics. Therefore it is necessary to develop new experimental approaches and procedures to study the TDDB failure mechanisms and degradation kinetics in particular. In this paper, an in situ experimental methodology in the transmission electron microscope (TEM) is demonstrated to investigate the TDDB degradation and failure mechanisms in Cu/ULK interconnect stacks. High quality imaging and chemical analysis are used to study the kinetic process. The in situ electrical test is integrated into the TEM to provide an elevated electrical field to the dielectrics. Electron tomography is utilized to characterize the directed Cu diffusion in the insulating dielectrics. This experimental procedure opens a possibility to study the failure mechanism in interconnect stacks of microelectronic products, and it could also be extended to other structures in active devices.

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. This paper demonstrates the procedure of an in situ TDDB experiment in the transmission electron microscope, which opens a possibility to study the failure mechanism in microelectronic products.

In Situ Zeitabhängige Dielectric Breakdown im Transmissionselektronenmikroskop: eine Möglichkeit, die Fehlermechanismus in mikroelektronischen Bauelementen Verstehen

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a microfluidic chamber assembled in the specimen holder for Transmission Electron Microscopy (TEM) and STEM. The microfluidic system consists of two silicon microchips supporting thin Silicon Nitride (SiN) membrane windows. This article describes the basic steps of sample loading and data acquisition. Most important of all is to ensure that the liquid compartment is correctly assembled, thus providing a thin liquid layer and a vacuum seal. This protocol also includes a number of tests necessary to perform during sample loading in order to ensure correct assembly. Once the sample is loaded in the electron microscope, the liquid thickness needs to be measured. Incorrect assembly may result in a too-thick liquid, while a too-thin liquid may indicate the absence of liquid, such as when a bubble is formed. Finally, the protocol explains how images are taken and how dynamic processes can be studied. A sample containing AuNPs is imaged both in pure water and in saline.

This protocol describes the operation of a liquid flow specimen holder for scanning transmission electron microscopy of AuNPs in water, as used for the observation of nanoscale dynamic processes.

Studium dynamischer Prozesse von Nano-Größe Objekte in Liquid Scanning Transmission Electron Micros mit

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Characterization of Ultra-fine Grained and Nanocrystalline Materials Using Transmission Kikuchi Diffraction

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and nanocrystalline materials. The traditional techniques associated with scanning electron microscopy (SEM), such as electron backscatter diffraction (EBSD), do not possess the required spatial resolution due to the large interaction volume between the electrons from the beam and the atoms of the material. Transmission electron microscopy (TEM) has the required spatial resolution. However, due to a lack of automation in the analysis system, the rate of data acquisition is slow which limits the area of the specimen that can be characterized. This paper presents a new characterization technique, Transmission Kikuchi Diffraction (TKD), which enables the analysis of the microstructure of UFG and nanocrystalline materials using an SEM equipped with a standard EBSD system. The spatial resolution of this technique can reach 2 nm. This technique can be applied to a large range of materials that would be difficult to analyze using traditional EBSD. After presenting the experimental set up and describing the different steps necessary to realize a TKD analysis, examples of its use on metal alloys and minerals are shown to illustrate the resolution of the technique and its flexibility in term of material to be characterized.

This paper provides a detailed method to characterize the microstructure of ultra-fine grained and nanocrystalline materials using a scanning electron microscope equipped with a standard electron backscatter diffraction system. Metal alloys and minerals presenting refined microstructures are analyzed using this technique, showing the diversity of its possible applications.

Charakterisierung von ultrafeinkörnig und Nanokristalline Materialien mit Übertragung Kikuchi Diffraction

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and ...

Fabrication of Magnetic Nanostructures on Silicon Nitride Membranes for Magnetic Vortex Studies Using Transmission Microscopy Techniques

Electron and x-ray magnetic microscopies allow for high-resolution magnetic imaging down to tens of nanometers. However, the samples need to be prepared on transparent membranes which are very fragile and difficult to manipulate. We present processes for the fabrication of samples with magnetic micro- and nanostructures with spin configurations forming magnetic vortices suitable for Lorentz transmission electron microscopy and magnetic transmission x-ray microscopy studies. The samples are prepared on silicon nitride membranes and the fabrication consists of a spin coating, UV and electron-beam lithography, the chemical development of the resist, and the evaporation of the magnetic material followed by a lift-off process forming the final magnetic structures. The samples for the Lorentz transmission electron microscopy consist of magnetic nanodiscs prepared in a single lithography step. The samples for the magnetic x-ray transmission microscopy are used for time-resolved magnetization dynamic experiments, and magnetic nanodiscs are placed on a waveguide which is used for the generation of repeatable magnetic field pulses by passing an electric current through the waveguide. The waveguide is created in an extra lithography step.

A protocol for the fabrication of magnetic micro- and nanostructures with spin configurations forming magnetic vortices suitable for transmission electron microscopy (TEM) and magnetic transmission x-ray microscopy (MTXM) studies is presented.

Herstellung von magnetische Nanostrukturen auf Silizium-Nitrid Membranen für magnetische Wirbel Studien mit Übertragungstechniken Mikroskopie

Electron and x-ray magnetic microscopies allow for high-resolution magnetic imaging down to tens of nanometers. However, the samples need to be prepared ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by employing an aberration-corrected scanning transmission electron microscope as the exposure tool. Here, we present results of single-digit nanometer patterning of two widely used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. The method achieves sub-5 nanometer features in poly (methyl methacrylate) and sub-10 nanometer resolution in hydrogen silsesquioxane. High-fidelity transfer of these patterns into target materials of choice can be performed using metal lift-off, plasma etch, and resist infiltration with organometallics.

We use an aberration-corrected scanning transmission electron microscope to define single-digit nanometer patterns in two widely-used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. Resist patterns can be replicated in target materials of choice with single-digit nanometer fidelity using liftoff, plasma etching, and resist infiltration by organometallics.

Einstelligen Nanometer Elektronenstrahl Lithographie mit einem Aberration korrigiert Scan Transmissions-Elektronenmikroskop

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

Graphene-Assisted Quasi-van der Waals Epitaxy of AlN Film on Nano-Patterned Sapphire Substrate for Ultraviolet Light Emitting Diodes

This protocol demonstrates a method for graphene-assisted quick growth and coalescence of AlN on nano-pattened sapphire substrate (NPSS). Graphene layers are directly grown on NPSS using catalyst-free atmospheric-pressure chemical vapor deposition (APCVD). By applying nitrogen reactive ion etching (RIE) plasma treatment, defects are introduced into the graphene film to enhance chemical reactivity. During metal-organic chemical vapor deposition (MOCVD) growth of AlN, this N-plasma treated graphene buffer enables AlN quick growth, and coalescence on NPSS is confirmed by cross-sectional scanning electron microscopy (SEM). The high quality of AlN on graphene-NPSS is then evaluated by X-ray rocking curves (XRCs) with narrow (0002) and (10-12) full width at half-maximum (FWHM) as 267.2 arcsec and 503.4 arcsec, respectively. Compared to bare NPSS, AlN growth on graphene-NPSS shows significant reduction of residual stress from 0.87 GPa to 0.25 Gpa, based on Raman measurements. Followed by AlGaN multiple quantum wells (MQWS) growth on graphene-NPSS, AlGaN-based deep ultraviolet light-emitting-diodes (DUV LEDs) are fabricated. The fabricated DUV-LEDs also demonstrate obvious, enhanced luminescence performance. This work provides a new solution for the growth of high quality AlN and fabrication of high performance DUV-LEDs using a shorter process and less costs.

A protocol for graphene-assisted growth of high-quality AlN films on nano-patterned sapphire substrate is presented.

Graphen-Assisted Quasi-van der Waals Epitaxy von AlN Film auf Nano-PatternEd Sapphire Substrat für ultraviolette Leuchtdioden

This protocol demonstrates a method for graphene-assisted quick growth and coalescence of AlN on nano-pattened sapphire substrate (NPSS). Graphene layers ...

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

Resistive switching crossbar architecture is highly desired in the field of digital memories due to low cost and high-density benefits. Different materials show variability in resistive switching properties due to the intrinsic nature of the material used, leading to discrepancies in the field because of underlying operation mechanisms. This highlights a need for a reliable technique to understand mechanisms using nanostructural observations. This protocol explains a detailed process and methodology of in&#160;situ nanostructural analysis as a result of electrical biasing using transmission electron microscopy (TEM). It provides visual and reliable evidence of underlying nanostructural changes in real time memory operations. Also included is the methodology of fabrication and electrical characterizations for asymmetric crossbar structures incorporating amorphous vanadium oxide. The protocol explained here for vanadium oxide films can be easily extended to any other materials in a metal-dielectric-metal sandwiched structure. Resistive switching crossbars are predicted to serve the programmable logic and neuromorphic circuits for next-generation memory devices, given the understanding of the operation mechanisms. This protocol reveals the switching mechanism in a reliable, timely, and cost-effective way in any type of resistive switching materials, and thereby predicts the device&#39;s applicability.

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

Presented here is a protocol for analyzing nanostructural changes during in&#160;situ biasing with transmission electron microscopy (TEM) for a stacked metal-insulator-metal structure. It has significant applications in resistive switching crossbars for the next generation of programmable logic circuits and neuromimicking hardware, to reveal their underlying operation mechanisms and practical applicability.

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Basierend auf Mixed-Phased a-VOx

Resistive switching crossbar architecture is highly desired in the field of digital memories due to low cost and high-density benefits. Different ...

Performing In Situ Closed-Cell Gas Reactions in the Transmission Electron Microscope

Gas reactions studied by in situ electron microscopy can be used to capture the real-time morphological and microchemical transformations of materials at length scales down to the atomic level. In situ closed-cell gas reaction (CCGR) studies performed using (scanning) transmission electron microscopy (STEM) can separate and identify localized dynamic reactions, which are extremely challenging to capture using other characterization techniques. For these experiments, we used a CCGR holder that utilizes microelectromechanical systems (MEMS)-based heating microchips (hereafter referred to as &#34;E-chips&#34;). The experimental protocol described here details the method for performing in situ gas reactions in dry and wet gases in an aberration-corrected STEM. This method finds relevance in many different materials systems, such as catalysis and high-temperature oxidation of structural materials at atmospheric pressure and in the presence of various gases with or without water vapor. Here, several sample preparation methods are described for various material form factors. During the reaction, mass spectra obtained with a residual gas analyzer (RGA) system with and without water vapor further validates gas exposure conditions during reactions. Integrating an RGA with an in situ CCGR-STEM system can, therefore, provide critical insight to correlate gas composition with the dynamic surface evolution of materials during reactions. In situ/operando studies using this approach allow&#160;for detailed investigation of the fundamental reaction mechanisms and kinetics that occur at specific environmental conditions (time, temperature, gas, pressure), in real-time, and at high spatial resolution.

Performing In Situ Closed-Cell Gas Reactions in the Transmission Electron Microscope

Here, we present a protocol for performing in situ TEM closed-cell gas reaction experiments while detailing several commonly used sample preparation methods.

Durchführung von geschlossenzelligen In-situ-Gasreaktionen im Transmissionselektronenmikroskop

Gas reactions studied by in situ electron microscopy can be used to capture the real-time morphological and microchemical transformations of materials at ...

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the surgical and instrumental expertise required to accurately quantify the structure and organization across multiple length scales have stunted its advancement. This work provides a detailed description of the murine dissection, en bloc staining, sample processing, and correlative imaging procedures for depicting the heart valve at different length scales. Hydrostatic transvalvular pressure was used to control the temporal heterogeneity by chemically fixing the heart valve conformation. Micro-computed tomography (&#181;CT) was used to confirm the geometry of the heart valve and provide a reference for the downstream sample processing needed for the serial block face scanning electron microscopy (SBF-SEM). High-resolution serial SEM images of the extracellular matrix (ECM) were taken and reconstructed to provide a local 3D representation of its organization. &#181;CT and SBF-SEM imaging methods were then correlated to overcome the spatial variation across the pulmonary valve. Though the work presented is exclusively on the pulmonary valve, this methodology could be adopted for describing the hierarchical organization in biological systems and is pivotal for the structural characterization across multiple length scales.

Here, we describe a correlative workflow for the excision, pressurization, fixation, and imaging of the murine pulmonary valve to determine the gross conformation and local extracellular matrix structures.

Chirurgie und Probenverarbeitung zur korrelativen Bildgebung der murinen Pulmonalklappe

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...