Wir danken für ihre Beratung auf die AbScale Experimente, Charles Yokoyama zur Bearbeitung des Manuskripts, Atsushi Miyawaki und Hiroshi Hama Eriko Ohshima und Miyuki Kishino für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von Forschungsgeldern aus RIKEN, t.h. und Grants-in-Aid für die wissenschaftliche Forschung vom Bundesministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) von Japan, t.h. unterstützt (Innovative Bereiche "Mesoskopischen Neurocircuitry"; 22115004) und S.S. (25890023).

Alle experimentelle Verfahren wurde vom RIKEN Wako Animal Experimente Committee und RIKEN genetische rekombinante Experiment Safety Committee genehmigt und durchgeführt nach den institutionellen Richtlinien der Tierhaltung des RIKEN Brain Science Institut.
1. Vorbereitung von Imaging-Kammern
<ol><li>
Imaging-Kammer19
	<ol>
<li>Mit Silikon-Beläge, bereiten Sie eine Kammer mit einer Dicke von ca. 5 mm und Boden Platten in verschiedenen stärken. Darüber hinaus bereiten Sie Petrischalen mit und ohne einem Glasboden (Abbildung 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Slice-Abstandhalter
	<ol>
<li>Bereiten Sie Abstandhalter für Samples, mit Silikon-Beläge mit einer Dicke von 0,5 mm (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Tracer Injektion
Hinweis: Stellen Sie Injektionen in der Pons (2.1) oder superior Colliculus (2.2). Injektion in den Pons Label Sub zerebralen Projektion Neuronen in einem breiten Hirnregion einschließlich der visuellen und motorischen Bereiche während der Injektion in die superior Colliculus Labels Sub zerebralen Projektion Neuronen im visuellen Bereich. Injizieren Sie für Experimente Kochsalzlösung statt eindringmittel beschriftet Cholera Toxin Untereinheit B. Verwenden Sie für die Wartung von sterilem Zustand sterilisierte Geräte und Plastikhandschuhe mit Ethanol gereinigt.
<ol><li>
Machen Sie Injektionen in der Pons Erwachsener Mäuse.
	<ol>
<li>1 µL eindringmittel beschriftet Cholera Toxin Untereinheit B zu zeichnen (25 µg/µL mit PBS-Puffer) in eine 26 G Hamilton-Spritze.</li>
		<li>Legen Sie eine Einspritzpumpe auf die Spritze.</li>
		<li>Legen Sie die Spritze und Pumpe auf dem Werkzeugträger eines Manipulator, platziert auf einem stereotaktischen Instrument. Kippen Sie den Manipulator 12° nach hinten aus der vertikalen Achse.</li>
		<li>Betäuben Sie eine männliche oder weibliche Erwachsene Maus (C57BL/6J oder Tlx3-Cre/Ai9) durch die intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht) oder durch die Gabe von Isofluran (2 – 3 %). Warten Sie, bis die Maus macht keine Antwort, wenn seine Rute eingeklemmt ist, mit der Pinzette, darauf hinweist, dass die Maus vollständig betäubt ist.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem stereotaktischen Instrument.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Haare mit einer Rasierklinge um Infektionen zu verhindern und 10 mm von der Kopfhaut zu schneiden, so dass die Bregma und Lambda sichtbar sind. Verabreichen Sie 0,1 mL von 1 % Lidocain mit einer Pipette. Legen Sie den Winkel des Kopfes, die vertikale Position des Mundstücks auf dem stereotaktischen Instrument so angepasst, dass die Bregma und Lambda die gleichen Z-Ebene haben.</li>
		<li>Passen Sie die Position des Manipulators am stereotaktischen Gerät schieben, so dass die Spitze der Spritze in der Nähe der Bregma und zeichnen Sie die Position des Manipulators. Ziehen Sie die Spritze durch Verschieben der Werkzeughalter auf dem Manipulator.</li>
		<li>Verschieben den Manipulator 5,4 mm nach hinten und 0,4 mm seitlich. Voraus die Spritze, so dass die Spitze in der Nähe der Einstiegspunkt auf dem Schädel ist. Ziehen Sie die Spritze und markieren Sie den Eintrittspunkt.</li>
		<li>Bohren Sie an der markierten Stelle ein Loch mit einem Durchmesser von ca. 1 mm.</li>
		<li>Legen Sie die Spitze der Spritze durch das Loch, so dass die Spitze Tiefe 6,9 mm ist mehr als, dass bei der Bregma gemessen.</li>
		<li>1 µL Tracer mit der Pumpe bei 0,2 µL/min zu injizieren.</li>
		<li>Ziehen Sie die Spritze aus dem Gehirn.</li>
		<li>Bei Bedarf decken Sie die exponierten Gehirn mit kleine Fragmente von mikrofibrillären Gefäßklemme und Sekundenkleber.</li>
		<li>Spülen Sie die exponierten Gehirn mit Kochsalzlösung mit einer Pipette geliefert um Infektionen zu verhindern und die Kopfhaut Naht.</li>
		<li>Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Gerät. Lassen Sie die Maus wieder aus der Narkose in einem Inkubator bei 30 ° c, in der Regel für 1 h. Nicht unbeaufsichtigt lassen die Maus bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Zurückzugeben Sie die Maus an die Gesellschaft anderer Tiere, nachdem es vollständig erholt hat.</li>
		<li>Halten Sie die Maus für 3 – 7 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Machen Sie Injektionen in den superior Colliculus Erwachsener Mäuse.
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Glaspipette mit einem Durchmesser von 30 – 50 µm.</li>
		<li>Verbinden Sie die Glaspipette mit einer Hamilton-Spritze durch ein Kunststoffrohr (Abbildung 2A).</li>
		<li>Füllen Sie die Glaspipette, Kunststoffrohr und Hamilton Spritze mit Paraffin Flüssigkeit.</li>
		<li>Legen Sie eine Einspritzpumpe auf die Spritze.</li>
		<li>Der Manipulator der Glaspipette aufsetzen und Kippen des Manipulators 60° nach hinten aus der vertikalen Achse (Abb. 2 b).</li>
		<li>Führen Sie 2.1.4–2.1.9. Die Position des Manipulators ist 1,4 mm posterior, 0,5 mm seitlich an den Lambda-Ausdruck.</li>
		<li>Legen Sie einen kleine Kunststoff-Paraffin-Film auf den Schädel, dann setzen Sie ca. 1 µL Tracer Lösung auf. Schnell die Glaspipette voraus und füllen Sie ihn mit mindestens 0,5 µL Tracer-Lösung.</li>
		<li>Fügen Sie die Glaspipette, sodass die Spitze Tiefe 3,0 mm von der Oberfläche des Gehirns ist.</li>
		<li>0,5 µL Tracer mit der Pumpe bei 0,2 µL/min zu injizieren.</li>
		<li>Die Glaspipette aus dem Gehirn zu entfernen.</li>
		<li>Führen Sie 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Fixierung und trimmen
<ol><li>Verleihen Sie Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal eine Maus (C57BL/6J oder Tlx3-Cre/Ai9, mit oder ohne die Tracer-Injektion wie in Schritt 2 beschrieben. Warten Sie, bis die Maus macht keine Antwort, wenn seine Rute eingeklemmt ist, mit der Pinzette, darauf hinweist, dass die Maus vollständig betäubt ist.</li>
	<li>Einschläfern der Maus menschlich von Vorrichtung die Maus Transcardially20 mit 0,9 % Kochsalzlösung.</li>
	<li>Fix die Maus20 durch Vorrichtung 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5).</li>
	<li>
Schneiden Sie die Kopfhaut mit einer Schere, um den Schädel wie beschrieben20verfügbar zu machen.
	<ol>
<li>Schneiden Sie die Mittellinie des freigelegten Schädel mit einer Schere. Entfernen Sie den Schädel mit Pinzette.</li>
		<li>Wenn markiert die Position des Bregma und Lambda notwendig ist, entfernen Sie zunächst eine Hemisphäre des Schädels. Legen Sie dünne Wolfram Nadeln in das Gehirn an den Stellen der Bregma und Lambda auf dem Schädel noch auf das Gehirn, dann entfernen Sie die restlichen Schädel. Hinweis: Das Gehirn kann mit PBS-Puffer bei 4 ° c gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Um durchzuführen Antikörper Färbung der hemmenden Neuronen, schneiden Sie die Gehirn-Muster in Scheiben.
	<ol>
<li>Legen Sie die Gehirn-Probe auf einem Vibratome.</li>
		<li>Scheiben Sie bis zu 500 µm Dicke mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur und fahren Sie mit Schritt 5 (AbScale-Methode).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn Antikörper Färbung nicht erforderlich ist, trim zu Probe Gehirn blockiert (bis zu 3 mm dick) mit einer Rasierklinge (Abbildung 3) und fahren Sie mit Schritt 4 (SeeDB-Methode). Hinweis: Das Gehirn kann mit PBS-Puffer bei 4 ° C nach dem Schneiden oder Trimmen gespeichert werden. Die SeeDB-Methode ist vorzuziehen, wenn Antikörper Färbung nicht notwendig ist, denn es weniger Zeit als die AbSca-l-e-Methode erfordert.</li>
</ol>4. löschen ohne Antikörper Färbung (SeeDB Methode)
<ol><li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 20 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 40 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 60 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 80 % (w/V) Fruktose enthält und 12 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 100 % (w/V) Fruktose enthält und 12 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 80,2 % (w/w) Fruktose enthält und 24 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Behandeln Sie die Probe sorgfältig, um Verformungen so gering wie möglich zu halten. Inkubieren Sie Proben länger als angegeben, nicht als Proben schnell undurchsichtig werden können.</li>
	<li>Betten Sie die Probe in einer bildgebenden Kammer gefüllt mit 80,2 % Fructose-Lösung (Abbildung 1 b). Gegebenenfalls zu beheben die Probe indem man kleine Stücke von Kautschukkleber um. Wenn die Kammer zu tief ist, legen Sie eine Bodenplatte in der Kammer vor den Proben.</li>
	<li>Die Petrischale mit einer Glasabdeckung auf der bildgebenden Kammer legen Sie und Wasser in die Schüssel und Bild eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit. Erregung Wellenlängen und Emission Filter sind in Tabelle 1beschrieben. Verwenden Sie ggf. eine motorisierte Bühne.</li>
</ol>(5) Clearing mit Antikörper Färbung (AbScale-Methode)
<ol><li>Bereiten Sie Reagenzien, wie in Tabelle 2beschrieben.</li>
	<li>Übertragen Sie die Scheiben mit einem Spatel zu einer 5 mL-Kunststoff-Rohr mit 4 mL des Sca/eS0 Lösung und inkubieren sie 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° C (Abbildung 4 b).</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL Sca/eA2 Lösung hinzugeben und die Scheiben für 36 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL Sca/eB4-Lösung und inkubieren die Scheiben für 24 h mit sanft schütteln bei 37 ° c</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL Sca/eA2 Lösung hinzugeben und die Scheiben für 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL PBS hinzu und inkubieren Sie die Scheiben für 6 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 2 mL-kunststofftube mit einem Spatel.</li>
	<li>Brüten Sie mit Primärantikörpern (Tabelle 3) in 1 mL AbScale Lösung für 48-72 h bei 37 ° C (Abbildung 4) mit sanft schütteln.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 5 mL-kunststofftube mit einem Spatel.</li>
	<li>Brüten Sie in 4 mL AbScale Lösung für 2 h 2 Mal bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 2 mL-kunststofftube mit einem Spatel.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit fluoreszent-markierten Sekundärantikörper (Table of Materials, 1: 100) in 1 mL AbScale Lösung für 48 h bei 37 ° C mit sanft schütteln.</li>
	<li>Vorsichtig die Scheiben mit einem Spatel zu einer 5 mL-Kunststoff-Rohr mit 4 mL der AbScale Lösung zu entfernen und die Scheiben für 6 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL AbScale Lösung hinzugeben und die Scheiben für 2 h 2 Mal mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL 4 % PFA und die Scheiben für 1 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL PBS hinzu und inkubieren Sie die Scheiben für 1 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL der Sca/eS4 Lösung hinzufügen und die Scheiben für 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Legen Sie das Distanzstück auf einen Glasobjektträger und legen Sie die Scheiben in der Abstandhalter und Tauchen Sie die Scheiben mit Sca/eS4 Lösung ein. Versiegeln Sie das Distanzstück mit einem Deckglas (Abbildung 1).</li>
	<li>Das Deckglas und Bild eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit setzen Sie Wasser auf. Verwenden Sie ggf. eine motorisierte Bühne. Hinweis: Überprüfen Sie, ob die tiefen Teile der Probe zu den oberflächlichen teilen, ohne eine deutliche Kennzeichnung Voreingenommenheit bestätigen ähnlich beschriftet werden. Hinweis: Die Durchdringung der getesteten Antikörper ist in Tabelle 3beschrieben.</li>
</ol>6. Zelle Positionsbestimmung
<ol><li>Berechnen Sie für jede Position in den gescannten Bildern Korrelationswerte mithilfe ein dreidimensionales Bild Filter14 (Abb. 5A-5D).</li>
	<li>Bestimmen der Gipfel der Korrelationswert (Abbildung 5).</li>
	<li>Untersuchen Sie Bilder rund um die Gipfel, Zellen (Abb. 5E) zu finden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lein, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir stellten Verfahren um großformatige dreidimensionale Bilder der Zelle Typ-spezifische Organisation der wichtigsten Zelltypen in Maus neokortikalen Schicht 5 zu erhalten. Im Vergleich zu herkömmlichen Slice Färbung, eignet sich die Methode bei der Bestimmung der dreidimensionalen Organisation des Neocortex. Die Methode ermöglicht die Bildaufnahme aus der breiteren und tieferen Hirnregionen im Vergleich zu den typischen in Vivo 2-Photonen-Mikroskopie oder konventionelle konfokale Mikroskopie und somit können die umfassende Analyse der neokortikalen Mobilfunk Organisation.
Ein wichtiger Schritt der Methode ist die Antikörper-Penetration. Eine Teilmenge von Antikörpern zeigt schlechte Penetration in dicken Proben (Tabelle 3) und daher nicht für die AbSca-l-e-Methode verwendet werden. Um einheitliche Kennzeichnung mit den in dieser Studie verwendeten Antikörper zu erhalten, war es notwendig, das Gehirn in 500 µm Scheiben schneiden. Die Verwendung von kleineren Antikörperfragmente, z. B. Fab oder F(ab') 2 Fragmente und/oder andere clearing Methoden21,22,23,24,25,26 27,28 kann zur Verbesserung der Ergebnisse.
Antikörper-Antigen-bindenen Besonderheit zeichnet sich in der Regel in dünne Gewebe Scheiben aber möglicherweise unterschiedlich Dicke Gewebe verarbeitet werden für das Clearing. Um Antikörperbesonderheit zu kontrollieren, wir gemeinsam mit der Bezeichnung Gewebe mit Tracer Injektion und Marker-gen-Expression bei transgenen Tieren und auch blockierende Experimente mit Antigen Proteine und Peptide14durchgeführt. Diese Verfahren und Experimente mit mutierten Tieren fehlt die Ziel-Antigene sollte für die Bestätigung der Spezifität von Antikörpern nützlich sein.
Eine Einschränkung der Methode ist, dass einige Verformung der Probe durch die Handhabung der weichen Mischproben unvermeidlich ist. In Vivo Bilder vor der Fixierung zu erhalten und diese Bilder zu verwenden, da Verweise hilft, um solche Verformungen zu korrigieren.
Die derzeitigen Verfahren wurden für die Analyse der neokortikalen Schicht 5 entwickelt. Aktuelle Analysen haben viele molekulare Marker identifiziert das Label neuronalen Zelltypen in anderen Schichten4,5,6,7, und die Anwendung dieser Hersteller auf das vorliegende Verfahren ermöglichen Kennung der wichtige zelluläre Organisation in anderen Schichten. Darüber hinaus sollte es möglich sein, ähnliche Analysen in den Gehirnregionen außer den Neocortex und in den Organen als das Gehirn zu untersuchen, ob eine präzise zelluläre Organisation ähnlich wie Microcolumns vorhanden ist.

Der Säugetier-Neocortex besteht aus eine Vielzahl von Zelltypen, die jeweils mit spezifischen gen Expressionsmuster, elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und Funktionen in Vivo 1,2 ,3,4,5,6,7. Ob dieser Zelltypen in wiederholten Strukturen organisiert sind war ungeklärt. Kortikale Säulen, einschließlich visuelle Orientierung Spalten und somatosensorischen Fässer haben Strukturen wiederholt, aber ihre zelluläre Organisation bleibt unklar8,9. Diese sind in der kortikalen Bereiche und sind kein Gehirn-System.
In neokortikalen Schicht 5 sind die große Mehrheit der Neuronen in vier Haupttypen eingeteilt. Eine wichtige Art von exzitatorischen Neuronen, Sub-zerebrale Projektion Neuronen Axone, subkortikale Ziele einschließlich der Pons, Rückenmark und Colliculus superior-Projekte und stellt daher, die größeren kortikalen Ausgang Weg10. Kortikalen Projektion Neuronen, eine weitere wichtige Art von exzitatorischen Neuronen innervieren den Kortex-10. Hemmende Neuronen enthalten auch zwei Hauptgruppen: Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen11.
Jüngste Analysen deuten darauf hin, dass die vier Zelltypen in wiederholten Strukturen12,13,14organisiert sind. Sub-zerebrale Projektion Neuronen12,13,14 und kortikalen Projektion Neuronen14 organisieren in Zelltyp spezifische Microcolumns mit einem Durchmesser von 1 – 2 Zellen. Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen richten Sie speziell mit Microcolumns von Sub-zerebrale Projektion Neuronen, aber nicht mit Microcolumns von kortikalen Projektion Neuronen14. Microcolumns selbst ausrichten in regelmäßigen Abständen in Form eines sechseckigen Gitter Array14 und sind in mehrere kortikalen Bereiche einschließlich visuelle, somatosensorische und motorische Bereichen Maus Gehirn12,14 und in Sprache Bereiche des menschlichen Gehirns13. Neuronen in den einzelnen Microcolumn synchronisierte Aktivität aufweisen und haben ähnliche sensorischen Antworten14. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Schicht 5 Zelltypen in einer Microcolumn Gitterstruktur repräsentieren die erste bekannte Gehirn-weiten Organisation wiederholen Funktionsmodule zu organisieren.
Microcolumns haben einen Radius von ca. 10 µm und eine räumliche Periodizität von etwa 40 µm. Darüber hinaus ist die Ausrichtung des Microcolumns parallel zu ihrer apikalen Dendriten und ändert sich je nach ihrer Position in der Kortex-14. Das Microcolumn System ist daher schwer zu analysieren, mit herkömmlichen kortikalen Scheiben mit einer typischen Dicke von ein paar Dutzend Mikrometer. Darüber hinaus die Analyse der Periodizität erfordert dreidimensionale Daten aus einer Vielzahl von Hirnareale und daher die typische imaging-Bereich der konfokalen Mikroskopie oder in Vivo 2-Photonen-Bildgebung ist zu schmal.
Vor kurzem haben Techniken entwickelt worden, um Dicke Gewebe15,16zu löschen. Hier beschreiben wir die Anwendung dieser Methoden auf groß angelegte, dreidimensionale Bilder der wichtigsten Zelltypen in Maus neokortikalen Schicht 5 erhalten, aus die das Microcolumn-System besteht. Subcerebral Projektion Neuronen sind gekennzeichnet durch die retrograde Beschriftung oder den Ausdruck das erhöhte grün fluoreszierende Protein in Crym-Egfp Transgene Mäuse12und kortikalen Projektion Neuronen durch entweder die retrograde beschriftet sind Kennzeichnung oder durch den TdTomato Ausdruck im Tlx3-Cre/Ai9 Mäuse17. Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen sind von Immunohistochemistry bezeichnet. (Antikörper Skala S) AbScale Methode18 dient für den Antikörper Experimente, Färbung, während die SeeDB (siehe Deep Brain) Methode19 für andere Experimente verwendet wird. Diese Methoden der konventionellen bildgebenden Verfahren die oben genannten Schwierigkeiten überwinden und zeigen die genaue zelluläre Organisation der Schicht 514.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Crym-egfp transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>012003-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tlx3-cre transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>36547-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROSA-CAG-flox-tdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX #7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-01</td>
			<td>0.5 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-02</td>
			<td>1.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-05</td>
			<td>3.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C022241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 310</td>
			<td>Pons injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 100</td>
			<td>Superior colliculus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Xylocaine injection 1% with epinephrine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Toyo Associates</td>
			<td>HP-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avitene microfibrillar hemostat</td>
			<td>Davol Inc</td>
			<td>1010090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alonalfa</td>
			<td>Daiichi-Sankyo</td>
			<td>Alonalpha A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K881H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Liquid, light</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26132-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Otsuka</td>
			<td>1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26126-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needle</td>
			<td>Inter medical</td>
			<td>&#934;0.1 *L200 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL plastic tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-thioglycerol</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33709-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-) Fructose</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>16315-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BluTack</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>CKBT-450000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1RMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>COMS</td>
			<td>PT100C-50XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-492/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-575/25-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-629/56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>D605/55m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic tube</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>VIO-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tube</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35905-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyserol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>191612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-)-sorbitol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-14735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo chemical industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Cyclodextrin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-hydroxyproline</td>
			<td>Skin Essential Actives</td>
			<td>33996-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>13445-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35624-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTIP2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Statb2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GABA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Swant</td>
			<td>235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Frontier Institute</td>
			<td>PV-Go-Af460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Somatostatin</td>
			<td>Peninsula Laboratories</td>
			<td>T-4103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fos</td>
			<td>CalbioChem</td>
			<td>PC38</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale three-dimensional imaging of cellular organization in the mouse neocortex

Säugetier-Neocortex besteht aus vielen Arten von erregenden und hemmenden Neuronen, mit jeweils spezifischen elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und in Vivo Funktionen, aber ihre grundlegende funktionelle und anatomische Organisation von zellulären Netzwerk maßstabsgetreu ist wenig bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode für die dreidimensionale Bildgebung von eindringmittel beschriftet Neuronen über große Bereiche des Gehirns für die Untersuchung der kortikalen zelluläre Organisation. Bestimmte Arten von Neuronen sind durch die Injektion von fluoreszierenden retrograde neuronaler Tracer oder Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen bei transgenen Mäusen beschriftet. Block Gehirn Proben, z. B. eine Halbkugel, zubereitet nach der Fixierung mit Gewebe clearing Methoden transparent gemacht und fluoreszierende Immunolabeling der spezifischen Zelltypen unterzogen. Große Flächen werden gescannt, konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit großen Arbeiten Abstand Ziele und motorisierte Stufen ausgestattet. Die regelmäßige Organisation der Zelle typspezifischen Microcolumn Funktionsmodule in der Maus Neocortex kann mit dieser Methode beheben. Das Verfahren kann für das Studium der dreidimensionalen zellulären Architektur in den verschiedenen Hirnarealen und anderen komplexen Geweben nützlich sein.

Wir beschriftet kortikalen Projektion Neuronen durch Expression von TdTomato in Tlx3-Cre/Ai9 Transgene Mäuse und Sub-zerebrale Projektion Neuronen durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons visualisiert. Die linke Hemisphäre des Gehirns wurde an die SeeDB-Methode unterzogen und mit einem zwei-Photonen-Mikroskop verfügt über eine lange Distanz Ziel arbeiten Wasserlagerung gescannt (25 X, N.A. 1.1, Arbeitsabstand 2 mm) und einem motorisierten Stadium. Ein Stapel von 401 Bilder (512 x 512 Pixel, Pixel-Größe = 0,99 µm) bei Z-Step = 2,8 µm bei jedem der 30 Positionen Scannen wurde erhalten. Die Zellkörper der zwei Zelltypen waren über einen weiten Bereich der Hirnareale (Abbildung 6) und optischen Abschnitte zeigten periodischen Microcolumns (Abb. 7A) sichtbar. Darüber hinaus wurden die Gehirne von Crym-Egfp -Mäusen (gepflegt als heterozygoten mit C57BL/6J Hintergrund) durch die SeeDB-Methode und wie oben abgebildet. Die Zellkörper und apikalen Dendriten EGFP exprimierenden Sub zerebralen Projektion Neuronen waren in optischen Abschnitte (Abb. 7 b) sichtbar.
Wir führten auch retrograde Kennzeichnung von Sub-zerebrale Projektion Neuronen in C57BL/6J Mäuse mit CTB488. Das feste Gehirn war mit einer Dicke von ca. 500 µm in koronalen Scheiben schneiden und unterzogen die AbScale Methode beschriften Parvalbumin exprimierenden Zellen (Anti-Parvalbumin, 1: 1000; Anti-Maus IgG eindringmittel beschriftet). Bilder zu Stapeln (512 x 512 Pixel, Pixel-Größe = 1,24 µm; Z-Schritt = 2,17 µm, 268 Bilder/Stack) erhielten eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokalen Mikroskopie mit (20 X, N.A. 1.0, Arbeitsabstand 2 mm). Sub-zerebrale Projektion Neuronen und Parvalbumin exprimierenden Zellen waren beide sichtbar in Scheiben (Abbildung 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig1.jpg"> Abbildung 1: Imaging-Kammern und Distanzstücke. (A) oben: handgemachte Glasboden-Petrischale (rechts) und einer Petrischale ohne einen Glasboden (links). Unten: Eine Kammer (rechts) und Bodenplatten (links), hergestellt aus Silikon Blätter. (B) ein Maus-Hemisphäre unterzogen, die SeeDB-Methode nach Injektion von CTB555 in den Colliculus superior in die Kammer festgelegt ist. Die Probe wird mit einem Stück wiederverwendbare Kleber fixiert. (C) A Objektträger (oben) und ein Abstandhalter aus einem Silikon-Blatt mit einer Dicke von 0,5 mm (unten) gemacht. (D) zwei koronale Scheiben des Mäusegehirns waren die Abstandshalter eingelassen und mit einem Deckglas abgedeckt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig2.jpg"> Abbildung 2: Tracer Injektion. (A) A Glaspipette mit einer Hamilton-Spritze durch ein Kunststoffrohr verbunden. (B) ein Maus befindet sich auf einer stereotaktischen Instrument. Die Glaspipette gekippt ca. 60° nach hinten aus der vertikalen Achse für die Injektion in den Colliculus superior. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig3.jpg"> Abbildung 3: Zuschneiden von Gehirn Proben. (A) ganze Gehirn Probe nach Injektion von CTB555 in der superior Colliculus und Fixierung. Die Bregma und Lambda wurden mit Wolfram Nadeln (Pfeilspitzen) markiert. (B) die gleiche Probe getrimmt, um eine Halbkugel zu erhalten. Beachten Sie, dass die Wolfram-Nadeln (Pfeilspitzen) bleiben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig4.jpg"> Abbildung 4: Eintauchen des Gehirns Proben in Lösungen für die SeeDB und AbScal-e-Methoden. (A) A Hemisphäre Probe eingetaucht in 0,5 % α-Thioglycerol und 20 % (w/V) Fruktose für die SeeDB-Methode. (B) koronalen Scheiben inmitten der Sca/eA2 Lösung für die AbSca-l-e-Methode. (C) koronalen Scheiben eingebettet in AbScale Lösung, Antikörper für die AbSca-l-e-Methode enthält. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig5.jpg"> Abbildung 5: Bestimmung der Zelle stellen. Sub-zerebrale Projektion Neuronen wurden beschriftet, durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons bei 5 Wochen alt. Die linke Hemisphäre wurde die SeeDB-Methode unterzogen und überprüft mit zwei-Photonen-Mikroskopie (512 x 512 Pixel, Pixel-Größe = 0,99 µm; Z-Schritt = 2,8 µm, 601 Bilder/Stack). (A) A Einzelbild. (B) fünf Bilder aus einem Einzelbild-Stapel. (C) das Bild Filter verwendet, um CTB-Label Sub zerebralen Projektion Neuronen zu erkennen. (D) Korrelationswerte für fünf Bilder in (B) mit Hilfe des Filters (c) berechnet. (E) Beispiele von erkannten Sub zerebralen Projektion Neuronen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig6.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse der groß angelegten Bildgebung. Kortikalen Projektion Neuronen (grün) wurden durch TdTomato-Ausdruck in Tlx3-Cre/Ai9 Transgene Mäuse, beschriftet und Sub-zerebrale Projektion Neuronen (Magenta) wurden durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons bei 7 Wochen visualisiert Alter. Die linke Hemisphäre die SeeDB-Methode unterzogen wurde und der Bereich 1.250 µm bis 2.690 µm Lateral und-3,400 µm bis 1.230 µm anterior der Bregma wurde gescannt, mit zwei-Photonen-Mikroskopie. (A) Draufsicht. Ungefähre Positionen der kortikalen Bereiche wurden gezeigt. (B–D) Schrägansicht des CTB 488 Fluoreszenz zeigt Sub zerebralen Projektion Neuronen (B), TdTomato Fluoreszenz zeigt kortikalen Projektion Neuronen (C) und das zusammengefügte Bild (D). A: vordere; P: Posterior; M: Medial; D: Dorsal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig7.jpg"> Abbildung 7: hoher Vergrößerung Fotos von repräsentative Ergebnisse. (A) eine optische Abschnitt des Bildes in Abbildung 6. Bild Dicke = 20 µm. (B) EGFP-Label Sub zerebralen Projektion Neuronen in einer heterozygoten Crym-Egfp -Maus im Alter von 6 Wochen. Bild Dicke = 30 µm. (C) Subcerebral Projektion Neuronen (Magenta) waren gekennzeichnet durch Injektion von CTB488 in der Pons von Mäusen C57BL/6J an postnatalen Tag 49 und Parvalbumin exprimierenden Zellen (grün) wurden durch die AbScale Methode visualisiert. Bild Dicke = 55 µm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58027/58027fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Fluorophor</td>
			<td>Ex (nm).</td>
			<td>Filter (nm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGFP</td>
			<td>910</td>
			<td>500-550 (FF03-525/50-25, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>tdTomato</td>
			<td>1.000</td>
			<td>578-633 (D605 / 55m, Chroma)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>750</td>
			<td>500-550 (FF03-525/50-25, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 555</td>
			<td>750</td>
			<td>563-588 (FF03-575/25-25, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>750</td>
			<td>601-657 (FF01-629/56, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>700</td>
			<td>400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Erregung Wellenlängen und Filter für die zwei-Photonen-Mikroskopie.
Tabelle 2: Reagenzien für die AbScale Methode. <a href="/files/ftp_upload/58027/JoVE_Table2_AbScaleReagents0411_1829_RE0425_1806.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigen</td>
			<td>Immunisierten Tieres</td>
			<td>Produkt-ID</td>
			<td>Konzentration</td>
			<td>3 mm block</td>
			<td>500 μm slice</td>
		</tr>
<tr>
<td>NeuN</td>
			<td>Maus</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>NeuN</td>
			<td>Kaninchen</td>
			<td>ABN78</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>CTIP2</td>
			<td>Ratte</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>L1-L6</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Statb2</td>
			<td>Maus</td>
			<td>ab51502</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>GAD67</td>
			<td>Maus</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>1: 200</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>GABA</td>
			<td>Kaninchen</td>
			<td>A2052</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>Maus</td>
			<td>235</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>Ziege</td>
			<td>PV-Go-Af460</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>L1-L2/3</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>Maus</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>Kaninchen</td>
			<td>ab11427</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Somatostatin</td>
			<td>Kaninchen</td>
			<td>T-4103</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>L1-L2/3</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>c-Fos</td>
			<td>Kaninchen</td>
			<td>PC38</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Eindringen der getesteten Antikörper. Ergebnisse für 3 mm Dicke Blöcke wie folgt dargestellt ist; L1-L6: Eindringen in die gesamte kortikale Dicke; L1-L2/3: Durchgriff auf Layer 2/3; -: keine Kennzeichnung; ND: nicht ermittelt. Ergebnisse für 500 µm dicken Scheiben wie folgt dargestellt ist; +: einheitliche Kennzeichnung; -: keine oder eingeschränkte Kennzeichnung.

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Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Aufrufe.  RIKEN Brain Science Institute. Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.

Serie: Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Recording Großflächige Neuronale Ensembles mit Silicon-Sonden in der narkotisierten Ratte

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Großflächige Aufnahme von Neuronen durch Movable Silicon Probes in Behaving Nagetiere

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

Dreidimensionale Motornerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...