Wir bedanken uns bei Anne Dodson und Stephanie Heinrich für Ratschläge, wie Sie das SmFISH-Protokoll zu optimieren, Xavier Darzacq für helfen bei der Analyseplattform, Haiyan Huang für Anregungen über die statistische Auswertung. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) und Glenn Foundation zu EÜ und NSF Graduate Research Fellowship Grant No unterstützt. DGE-1106400, JC.

Hinweis: Alle Puffer und in diesem Protokoll verwendeten Medien sind in Tabelle 1aufgeführt. Die Herstellerinformationen für Reagenzien wird in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
Tag 1/Tag 1-2:
Hinweis: Für die vegetative Kultur wachsen Sie Zellen zu einem OD-600 von 0,4 bis 0,6 in ein bevorzugtes Medium. Induzieren Sie für die meiotische Kultur Zellen Meiose eine bevorzugte Methode (in der Regel in einem OD-600 von 1,85 Kultivierung) zu unterziehen.
1. Probe Fixierung und Verdauung
<ol><li>Insgesamt ~3.5 OD600 Zellen in 3 % Formaldehyd zu beheben.<ol>
<li>Fügen Sie für vegetative Kultur 5,52 mL Kultur zu 480 µL 37 % Formaldehyd in 15 mL konische Röhrchen hinzu.</li>
		<li>Meiotische Kultur fügen Sie 1840 µL der Kultur zu 160 µL 37 % Formaldehyd in 2-mL Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Invertieren ~ 5 Mal zu mischen. Achtung: Formaldehyd ist giftig. Handhabung und Entsorgung nach institutionellen Regelungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eine Bandage bei Raumtemperatur für 20 min Rohre aufsetzen. Für meiotische Proben nach der Fixierung bei Raumtemperatur für 20 min Befestigung über Nacht bei 4 ° c weiter, drehen. Hinweis: Die Übernachtung Fixierung erhöht die Reproduzierbarkeit und die Qualität der SmFISH Daten für meiotische Proben. Fixierzeit sollte optimiert werden.</li>
	<li>Während der Proben beheben, tauen Sie 200 mM Vanadyl Ribonucleoside komplexe (VRC) bei 65 ° c für mindestens 10 min auf.</li>
	<li>Verdauung-master-Mix in einem 15-mL-Tube vorzubereiten: 425 µL Puffer B mix für 1 Probe mit 40 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c); 2125 µL Puffer B mix für 5 Proben mit 200 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c). Vortex ~ 5 s voll Aufschwemmen der VRC vor dem Hinzufügen zu den master-Mix, der leicht bräunlich grün nach VRC Zugabe erscheint. Hinweis: Zugabe von VRC während der Verdauung verbessert die Konsistenz der SmFISH Ergebnisse, möglicherweise durch Hemmung der Nuklease Verunreinigung durch die Zymolyase-Mischung, die aus Rohöl Extrakt gereinigt wird eingeführt. Die Höhe der VRC erforderlich bei diesem Schritt sollte optimiert werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie für vegetative Proben Schläuche am ~ 1057 X g 3 Minuten lang. Für meiotische Proben (nach der Übernachtung Fixierung) Zentrifugieren bei 21.000 x g für 1,5 min. Dekantieren oder Aspirieren des Überstands zu Formaldehyd Verschwendung. Hinweis: Die Zentrifugation Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 1,5 mL kaltem Puffer B durch pipettieren rauf und runter oder durch Umkehrung der Rohre und streichen um zu mischen. Übertragen Sie vegetative Proben auf 2-mL-Tuben nach Wiederfreisetzung.</li>
	<li>Zentrifuge bei 21.000 x g für 1,5 min. entfernen Sie den Großteil der Flüssigkeit durch Vakuum Aspiration oder pipettieren, ~ 100 µL hinterlässt.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen in 1,5 mL kaltem Puffer B.</li>
	<li>Zentrifuge bei 21.000 x g für 1,5 min. entfernen Sie den Großteil der Flüssigkeit durch Vakuum Aspiration oder pipettieren, ~ 100 µL hinterlässt.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 1,5 mL kaltem Puffer B. Zentrifuge bei 21.000 x g für 1,5 min. Absaugen der Flüssigkeit vollständig durch Vakuum oder pipettieren.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie Zellen in 425 µL Verdauung master-Mix und kurz Vortex zu Aufschwemmen. Jedes Rohr 5 µL 100 t 10 mg/mL Zymolyase hinzufügen. Hinweis: Vortex Zymolyase jedes Mal, wenn die Rohre vor hinzufügen. Fügen Sie Zymolyase für jedes Rohr einzeln hinzu, anstatt zu den master-Mix. Beide Schritte helfen Verdauung Konsistenz unter den Röhren zu gewährleisten, weil Zymolyase schnell ausfällt.</li>
	<li>Vortex 2-3 s zu mischen. Legen Sie die Röhren auf eine Bandage, und bei 30 ° c für 15-30 min zu verdauen. Für vegetativen Zellen und meiotischen Anfangsphase in der Regel dauert es ca. 15 min und meiotischen Divisionen und meiotischen Prophase dauert in der Regel ~ 30 min. Hinweis: Überprüfen Sie auf dem Mikroskop alle 5 min nach 15 min und stoppen Sie die Verdauung zu, wenn ~ 80 % der Zellen nicht transparent und nicht-Refraktive erscheinen. Von diesem Zeitpunkt an Zellen sind sehr zerbrechlich. Handhaben Sie Zellen vorsichtig und vermeiden Sie die Verwendung von Vakuum Aspiration oder Vortexen.
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen die Flüssigkeit vollständig durch pipettieren.</li>
	<li>Sanft Aufschwemmen Zellen mit 1 mL Puffer B durch pipettieren oben und unten 1 - 2 Mal zu mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen Puffer B Flüssigkeit durch pipettieren. Aufschwemmen Sie sanft Zellen in 1 mL 70 % igem Ethanol (mit RNase-freies Wasser verdünnt).</li>
	<li>3,5-4 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
</ol>2. Hybridisierung
<ol><li>Formamid auf Raumtemperatur bringen (für 50-mL-aliquoten, dauert es ca. 30 min im Wasserbad). Hinweis: Öffnen Sie die Formamid-Flasche nicht, bis die Flasche Raumtemperatur zur Vermeidung von Oxidation von Formamid erreicht. Achtung: Formamid ist giftig. Handhabung und Entsorgung nach institutionellen Regelungen.</li>
	<li>10 % Formamid Waschpuffer in einem 15 mL konische Röhrchen vorzubereiten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen 500 µL 70 % Ethanol durch pipettieren. Sanft nach oben und unten zu Aufschwemmen der verbleibenden Zellen, und übertragen Sie dann die Zellen auf niedrigem Kraftschlußbeiwert Röhrchen pipettieren. Hinweis: Mit niedrigem Kraftschlußbeiwert Rohre stark Zellverlust reduziert, bei nachfolgenden Wäschen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre wieder bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen das Ethanol durch pipettieren.</li>
	<li>Hinzufügen 1 mL 10 % Formamid Waschpuffer und sanft pipettieren rauf und runter 2-3mal Aufschwemmen der Zellen.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen, die bei Raumtemperatur für ~ 20 min sitzen, während der Vorbereitung der Hybridisierung-Lösung. Vermischen Sie für 1 Probe 50 µL der Hybridisierung Puffer (Raum Temp), 5 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c) und 1 µL jede Sonde (200 nM Final). Vermischen Sie für 5 Proben 250 µL Hybridisierung Puffer (Raum Temp), 25 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c) und 5 µL jede Sonde (200 nM Final).<ol>
<li>Tauen Sie Hybridisierung Puffer (bei-20 ° c eingefroren) auf Raumtemperatur vor dem Öffnen der Tube um Formamid Oxidation zu verhindern.</li>
		<li>Nach Zugabe von 200 mM VRC, Wirbel für 5-10 s vor dem Hinzufügen der Sonden sind die entwickelt und kommerziell erworben und gemäß den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert.</li>
		<li>Wenn zwei Sonden Co inkubierten sind, fügen Sie 1 µL der 01:10 Verdünnung der Sonde #1 bestand, sowie 1 µL der 01:10 Verdünnung der Sonde #2 Lager, zu einer Endverdünnung von ~ 1: 500 für jede Sonde. Die Konzentration für die beste Signal-Rausch-Verhältnis muss optimiert (siehe Diskussion für Details).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Entfernen des Überstands in Sondermüll durch pipettieren.</li>
	<li>Jedes Rohr mindestens 50 µL der Hybridisierung Lösung hinzufügen. Streichen Sie die Rohre zu mischen.</li>
	<li>Mindestens 16 Stunden im Dunkeln bei 30 ° c auf eine Bandage inkubieren.</li>
</ol>2/3 Tag
3. Waschen und imaging
<ol><li>Bringen Sie Formamid auf Raumtemperatur.</li>
	<li>10 % Formamid Waschpuffer (FWB) in einem 15 mL konische Röhrchen vorzubereiten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Röhren aus der Bandage und legen Sie sie in ein Feld Folie abgedeckt, um vor Licht zu schützen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Entfernen des Überstands in Sondermüll durch pipettieren.</li>
	<li>In 1 mL 10 % FWB durch sanft auf und ab pipettieren Aufschwemmen 2-3 Mal.</li>
	<li>Inkubation bei 30 ° c für 30 min (nicht rotierend) im Feld Folie abgedeckt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Überstands um gefährliche Abfälle durch pipettieren entfernen und verlassen Sie ~ 50 µL zu.</li>
	<li>Unterdessen bereiten DAPI/FWB in einem 15 mL konische Röhrchen: 1000 µL 10 % Formamid Waschpuffer mit 1 µL von 5 mg/mL DAPI für 1 Probe vermischen. Mischen Sie für 10 Proben 10 mL 10 % Formamid Waschpuffer mit 10 µL von 5 mg/mL DAPI. In 1 mL DAPI/FWB durch sanft auf und ab pipettieren Aufschwemmen 2-3 Mal.</li>
	<li>Inkubation bei 30 ° c für 30 min (nicht rotierend) im Feld Folie abgedeckt.</li>
	<li>Anti-Bleichmittel Reagenzien auf Eis Auftauen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Entfernen des Überstands vollständig durch pipettieren. Bei Bedarf wieder entfernen Sie alle des Überstands Zentrifugieren.</li>
	<li>Für Proben, die nicht sofort abgebildet sind, erneut das Pellet in 50 µL GLOX-Puffer ohne Enzyme. Pipettieren rauf und runter 3-bis 4-Mal zu mischen.<ol>
<li>Halten Sie alle unimaged Proben im Feld Folie bedeckt bei 4 ° c bis bereit zu Bild. Wenn Sie bereit zum Bild, die Proben bei ~ 376 X g für 2 min zentrifugieren und überstand vollständig durch pipettieren entfernen. Aufschwemmen Sie in GLOX mit Enzymen wie unten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie für die Proben sofort abgebildet wird 15-20 µL GLOX-Puffer mit Enzymen. Pipettieren Sie sanft auf und ab zu mischen. Hinweis: Das Volume hinzugefügt kann variieren abhängig von der Größe des Pellet-Zelle. Wir empfehlen resuspending das Pellet in 15 µL GLOX-Puffer mit Enzymen und prüfen die Zelldichte am Mikroskop. Wenn Zellen sind zu dicht (Zellen verklumpen übereinander), fügen Sie zusätzliche GLOX-Puffer mit Enzymen. Wenn Zellen zu spärlich sind, Zentrifugieren der Probenmaterials und ~ 5 µL Puffer zu entfernen.</li>
	<li>Pipettieren 5 µL auf ein Deckglas (18 mm x 18 mm, Nr. 1), und setzen Sie das Deckglas auf einer Folie.</li>
	<li>Setzen Sie eine Labor wischen auf der Folie platziert das Deckglas. Drücken Sie vorsichtig auf das Labor-Tuch, Folie festlegen (siehe flüssige Abspringen von allen vier Rändern der das Deckglas sollte).</li>
	<li>Übertragen der Folie auf das Mikroskop-Zimmer in einer Box von Alu-Folie abgedeckt.</li>
	<li>Bild mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit starker Vergrößerung (60-100 X) und hoher numerischer Apertur. Hinweis: Um die maximale Anzahl der Photonen, die durch die SmFISH Sonden zu sammeln, sind konfokale Mikroskope nicht empfohlen, da sie die Menge des Lichtes zu erhebenden erheblich einschränken. Hier die Daten auf einem Mikroskop, ausgestattet mit einem 100 X 1,4 NA Ziel, Verwendung von Filtern CY5 (EX632/22, EM679/34) abgebildet bei 1,3 s, 100 % T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100 % T; und DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32-50 % T. Hellfeld Referenzbild sollte auch erworben werden. Erwerben von 15-25 Scheiben mit einer Schrittweite von 0,1-0,2 µm, von ganz unten im Mittelpunkt das Sichtfeld zu ganz oben, um sicherzustellen, dass alle die RNA-Spots entfallen.</li>
</ol>(4) Bildanalyse
<ol><li>Analysieren Sie die SmFISH-Daten mit veröffentlichten SmFISH Analyse-Tools wie Fisch-Quant17 und StarSearch2oder kundenspezifischen Programmen, je nach der genauen Anforderungen des Experiments. Hinweis: Eine gute Analyse-Pipeline soll erlauben den Benutzern, eine Schwelle, die wahre RNA-Spots vom Hintergrund zu trennen, und Ausgang Statistiken wie die X, Y und Z Koordinaten (optionalen) und die Intensität von jedem Fleck, die Anzahl der Plätze in jeder Zelle zu bestimmen , und eventuell Anpassung als ein Weg, um Fehlalarme herausfiltern.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. 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H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. 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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt, offen zu legen.

Das Protokoll hier vorgestellten stammt von anderen veröffentlichten SmFISH Protokolle2,3,21,22,23, und ist speziell für den Hefe-Stamm Hintergrund SK1 optimiert. Die Parameter optimiert enthalten Zellzahl, Fixierung Dauer, Zentrifugation Geschwindigkeit und Dauer, Dauer der Verdauung, Verdauung Puffer, Sonde Konzentration und Hybridisierung Puffer. Andere Parameter wie Hybridisierung Temperatur und Dauer wurden nicht optimiert. In diesem Abschnitt haben wir ein paar Hinweise, die helfen würden, dieses Protokoll Hefe-Stamm-Hintergrund und die Wachstumsbedingungen von Interesse anzupassen.
Die Zellwand der angehende Hefe ist eine große Herausforderung gegen hochwertige SmFISH Bilder in der angehenden Hefe zu erhalten, weil die Zellwand Sonde Eindringen verhindert. Unvollständige Verdauung der Zellwand von Zymolyase führt zu ineffizienter Hybridisierung von Sonden und hohe Variabilität von Zelle zu Zelle im Signal. Aber können über Verdauung Zellen zu schwach zu machen, führt zu erheblichen Zell-Verlust während der Waschschritte und Zelle platzt während der Vorbereitung der Folie für die Bildgebung. Daher ist es entscheidend, die Dauer der Verdauung zu optimieren. Wir empfehlen die Durchführung eines pilot SmFISH Experiments durch Verdauung derselben Probe für unterschiedlich lange. In unserem Fall haben wir die besten SmFISH Daten Wenn wir die Verdauung hielten bei ~ 80 % der Zellen nicht Refraktive wurde. In der Regel können für dasselbe Wachstum, verschiedene genetische mutierte Stämme mit ähnlicher Timing verdaut werden. Allerdings unterscheidet sich die Dauer der Verdauung Vergleich unter verschiedenen Wachstumsbedingungen und verschiedenen Phasen der Meiose in der angehenden Hefe. Sobald der Zeitpunkt bestimmt ist, ist die Qualität der SmFISH reproduzierbar. Hinweis kann für mutierte Stämme mit defekten Zellwand-Synthese und/oder Zusammensetzung, Verdauung in weniger als 15 min. Einsatz verschiedener Chargen Zymolyase durchgeführt werden kann auch leicht die Verdauung Timing ändern.
Optimale Sonde Konzentration ist erforderlich, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Wir entwarfen und unsere SmFISH Sonden im Handel gekauft. Gute Sonden (oft 20-Mers) sollte einen Prozentsatz von GC von 35 % bis 45 %, ein Mindestabstand von 2 Basenpaare zwischen Fühler und geringe Kreuzreaktivität haben. Wir einen Web-basiertes Sonde Designer vom Hersteller verwendet, um eine Liste der Sonden generieren, und gäbe es genügend Sonden zur Auswahl, wir würde Nutzen des BLAST-Algorithmus in der Saccharomyces-Genom-Datenbank die Sonden mit mehr als 17 Basenpaaren überlappt zu beseitigen mit anderen genomischen Regionen. Wir entschieden uns für mehr photostabilen Fluoreszenzfarbstoff (CAL-Fluor-590) für die Sonde gesetzt, die die einzigartige Region NDC80Luti (CF 590) glüht, weil in dieser Reihe, die Anzahl der Sonden, die alle der oben genannten Kriterien (20 Proben) zufrieden niedriger als war die minimale Anzahl der vom Hersteller empfohlenen (~ 25-Sonden). Nach dem Neuaufbau der Sonde Lösung nach den Anweisungen des Herstellers, wir machten eine 01:10 Verdünnung der Stammlösung und die verdünnte Lösung in 5 µL Aliquots bei-20 ° c gelagert. Jedes aliquoten wurde nur ein einziges Mal verwendet. Für die Optimierung sollte man serielle Verdünnungen ab dem 01:10 verdünnt, Lösung und testen, welche Konzentration das beste Signal-Rausch-Verhältnis ergibt. Wir empfehlen, dass eine Verdünnungsreihe 1: 250, 1: 500, 1: 1000 und 1: 2000 aus dem ursprünglichen bestand. In unserem Fall führte ein Verdünnungsfaktor von 1: 500 das beste Signal-Rausch-Verhältnis für die CF-590 und Q-670-Sonde-Sets.
Optimale Fixierung ist auch entscheidend für erfolgreiche SmFISH in der angehenden Hefe. Wir fanden, dass über Nacht Fixierung bei 4 ° c, anstatt Befestigung bei Raumtemperatur für 20 min, verbessert die Konsistenz und Qualität der SmFISH Ergebnisse für meiotische Proben. Obwohl wir nicht getestet haben, wie über Nacht Fixierung vegetative Proben auswirken könnten, Fixierung bei Raumtemperatur gut für dieses Wachstum Zustand gearbeitet. Also, um das SmFISH-Protokoll für neue Stämme oder Wachstumsbedingungen zu optimieren, empfehlen wir beginnend mit kurze Fixierzeit bei Raumtemperatur und Erhöhung der Fixierzeit, wenn hohe Variabilität des Signals aufgetreten ist.
Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Protokollen3,22,23, nutzt unser Protokoll die RNase-Inhibitor VRC während der Verdauung und eine höhere Konzentration von VRC während Hybridisierung. Ergänzung der VRC in diesen zwei Schritten verbessert die Konsistenz der SmFISH Ergebnisse, möglicherweise durch eine bessere Erhaltung der RNA-Moleküle gegen Nuklease Aktivität, die durch die Zymolyase-Mischung eingeführt werden können (das Enzym wird aus groben Extrakten gereinigt und RNase enthalten kann (Verunreinigungen). Daher empfehlen wir die Menge der VRC wie entnehmen Sie bitte unserem Protokoll oder sogar höhere Konzentrationen von VRC für Optimierung.
Ein erheblicher Teil der Zellen kann während Waschschritten in Puffer B und die Formamid Waschpuffer verloren. Um Zellverlust zu reduzieren, könnte man die Zentrifugation Geschwindigkeit erhöhen. In unserem Fall wäscht mit einer hohen Geschwindigkeit (21.000 x g) zu unseren Proben innerhalb der Puffer B Pellets deutlich reduzierten Zellverlust. Jedoch werden die Zellen sehr zerbrechlich nach Zymolyase Verdauung, daher Zentrifugation Geschwindigkeit ändern nicht empfohlen. Stattdessen empfehlen wir die niedrigem Kraftschlußbeiwert Rohre aus USA, die wesentlich dazu beitragen, die Zellen während der Wäschen in der Formamid Waschpuffer pellet. Insgesamt kann unser Protokoll konsequent eine Monolage Zellen dicht genug für die effiziente Bildgebung generieren. In der Regel 7 Gesichtsfelder nachgeben sollte > 130 Zellen geeignet für Quantifizierung.
Zu guter Letzt ist es wichtig zu bestimmen, die optimale Parameter für und die Ausgänge von Bildanalyse erforderlich. Um SmFISH Flecken zu erkennen, veröffentlichten Analyse-Programme häufig filtern die raw-Bilder mit "glockenförmig" Kernel um Hintergrundsignal zu entfernen, und fordern Sie die Benutzer zu bestimmen, das Signal-Rausch-Verhältnis, für jeden Satz von Bildern2,17zu verwenden. Leider gibt es derzeit kein einheitlichen Standard die richtigen Parametern bestimmt, und so einige empirische Tests diese unterschiedlichen Einstellungen ist notwendig. Zur Einstellung der Parameter für jeden dieser Schritte benötigt, braucht man iterativ unterschiedliche Parameter eingeben und überprüfen, wie gut die Ergebnisse aus jedem Satz entspricht, die von der manuellen Zählung in ein paar repräsentative Zellen. Sobald eine Reihe von Parametern gefunden wird, kann es für den Großteil der Bilder, die trotz unterschiedlichen Wachstumsbedingungen und genetische Hintergründe verwendet werden.
Darüber hinaus kann man testen, ob maximale Intensität Projektion der SmFISH Bilder vor der Quantifizierung22durchgeführt werden kann. Dieser Schritt den spot Erkennungsalgorithmus vereinfacht und reduziert bildgebenden Zeit, allerdings auf Kosten der potenziell nützliche Informationen zu einzelnen Flecken, wie ihre subzelluläre Lokalisation. In unserem Fall war die Anzahl der mRNA-Moleküle, die durch das NDC80 -gen produziert niedrig genug, dass die Flecken gut, nach dieser Bearbeitung (nicht selten getrennt wurden für Transkripte in angehende-3,7 Hefe). In Fällen, in denen die ns1 Analyse entscheidend ist, muss die Analyse Pipeline zur Bestimmung der Position jeder SmFISH Stelle in jedem Kanal ns1 beurteilen. Je nach den konkreten Fragen gestellt, weitere Informationen wie die Intensität von jedem Fleck möglicherweise auch die Pipeline zur weiteren Analyse entnommen werden. Optimierung des Schlüssels Schritte in das Protokoll und die Bild-Analyse-Pipeline ist entscheidend bei der Beschaffung von hohen Qualität der SmFISH Daten, die Frage von Interesse zu studieren.

Dynamische Regulation der Genexpression treibt die Entwicklung eines Organismus, sowie seine Reaktion auf Umwelteinflüsse, Infektionen und Veränderungen im Stoffwechsel. Studien, die sich auf transcriptional Regelung setzen auf Technologien, die RNA Fülle zu messen. Eine solche Methode, als einzelnes Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) dient zur Erkennung von einzelnen RNA-Moleküle in einzelne Zellen1,2. Diese Methode ermöglicht die Messung der Zell-Zell-Variabilität in der Genexpression und Bestimmung der intrazellulären RNA-Lokalisierung.
In der am häufigsten verwendeten SmFISH-Technik erfordert Erkennung von einem einzelnen RNA-Molekül mehrere kurze DNA-Sonden (oft ~ 48 20-Mer Sonden), die komplementär zu der Ziel-RNA und sind auf der gleichen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert. Bindung von einzelnen fluoreszierende Sonden führt zu schwaches Signal, aber das Signal aus dem Ensemble der Sonden ist robust. Diese Funktion verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis, denn obwohl eine einzelne Sonde Ziel Bindung aufweisen kann, solches Signal erwartet wird sehr schwach im Vergleich zu der der Ziel-RNA-Molekül3. Innerhalb Fehler erkennen kann die Anzahl der RNA-Moleküle gezählt und verglichen, in ganz verschiedenen Wachstumsbedingungen und unter verschiedenen Mutanten.
Seit seiner ersten Entwicklung ist SmFISH angepasst worden, um verschiedene Aspekte der Gene Expression4, z. B. Transkription Dehnung1,2,5,6, transkriptionelle platzen7 Spleißen studieren , 8 , 9, intrazelluläre allelic Ausdruck10,11,12und RNA Lokalisierung13,14,15. Vor kurzem haben wir diese Methode verwendet, um die Expression von zwei Transkript Isoformen des gleichen Gens, in dem studieren der kurzen Transkript Isoform (NDC80ORF) hat seine gesamte Sequenz gemeinsam mit der langen Isoform (NDC80Luti )16. Zur eindeutigen Identifizierung der beiden Isoformen von mRNA, wir verwendeten Sonde zweierlei: ein Satz bezieht sich auf die einzigartige Abfolge der NDC80Lutiund die andere Gruppe, zu einem anderen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert bindet an die gemeinsame Region der beiden Isoformen. NDC80Luti RNA wird als ein colocalized Ort mit beide fluoreszierende Signale identifiziert, während die NDC80ORF RNA ist derjenige, der nur das Signal aus dem gemeinsamen Sonde Set enthält. Da die Anzahl der der NDC80ORF Abschriften wird berechnet, indem eine "Subtraktion" Methode, hohe Effizienz der Sonde Hybridisierung und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis sind notwendig, um selbstbewusst SmFISH Flecken erkennen und reduzieren Fehler Ausbreitung.
Dieses Whitepaper beschreibt ein optimiertes Protokoll für die Durchführung von SmFISH in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae. In dieses Protokoll, die Zellenzahl, Fixierzeit, Dauer der Verdauung, Verdauung Puffer, Sonde Konzentration und Hybridisierung Puffer für die SmFISH Experimente verwendet wurden optimiert für den SK1 Stamm Hintergrund S. Cerevisiae unterziehen vegetative Wachstum oder Meiose. Allerdings haben wir auch in diesem Manuskript beachten: (1) die Methode zum Überprüfen der Qualität der SmFISH Daten nach der Bildaufnahme und (2) die Schritte in das Protokoll, die zusätzliche Optimierung für verschiedene Belastungen Hintergründe und Wachstumsbedingungen erfordern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Einzelnes Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) ist eine leistungsstarke Technik, Genexpression in Einzelzellen aufgrund seiner Fähigkeit, zu erkennen und zählen die einzelnen RNA-Moleküle zu studieren. Ergänzend zu deep Sequencing-basierte Methoden, SmFISH liefert Informationen über die Zell-Zell-Variation im Transkript Überfluss und die subzelluläre Lokalisation einer bestimmten RNA. Vor kurzem haben wir SmFISH verwendet, um die Expression des Gens NDC80 während der Meiose in der angehenden Hefe zu studieren, in welche zwei Niederschrift Isoformen vorhanden und kurze Niederschrift Isoform hat seine gesamte Sequenz mit der langen Isoform geteilt. Um jede Abschrift Isoform selbstbewusst zu identifizieren, wir optimierte bekannt SmFISH Protokolle und erzielt hohe Konsistenz und Qualität der SmFISH Daten für die Proben während angehende erworben Hefe Meiose. Hier beschreiben wir diese optimierte Protokoll, die Kriterien, die wir verwenden, um festzustellen, ob hoher Datenqualität SmFISH gewonnen wird, und ein paar Tipps für die Durchführung dieses Protokolls in anderen Hefestämme und Wachstumsbedingungen.

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Dieses Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung Protokoll ist optimiert, um die Anzahl der RNA-Moleküle in der angehenden Hefe während des vegetativen Wachstums und Meiose zu quantifizieren.

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.1K Aufrufe.  University of California, Berkeley. Dieses Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung Protokoll ist optimiert, um die Anzahl der RNA-Moleküle in der angehenden Hefe während des vegetativen Wachstums und Meiose zu quantifizieren.

Serie: Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Forschung

Genetik

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Gezielt<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.